Análise de célula específico Arabidopsis Folhas utilizando ordenação células activadas por fluorescência

O objetivo geral deste procedimento é isolar uma população de protoplastos específicos de um tipo celular a partir de uma folha. Isso é realizado primeiramente cultivando plantas que expressam GFP em tipos celulares específicos na folha. O segundo passo é colher as folhas e gerar protoplastos por meio de uma digestão enzimática.

Em seguida, os protoplastos são filtrados e separados utilizando classificação de células ativada por fluorescência ou FACS. O passo final é confirmar a precisão da separação por meio de microscopia de fluorescência. Em última instância, os protoplastos separados podem ser utilizados para análise da expressão gênica específica de tipo celular, análise proteômica ou perfil metabólico.

A triagem de células ativada por fluorescência já foi utilizada com sucesso em raízes, mas é usada para o isolamento de células foliares. A marcação com GFP antes deste método foi limitada devido à interferência da fluorescência da clorofila. A demonstração visual deste método é essencial, pois a preparação rápida, mas cuidadosa, da amostra é crucial para minimizar as extensas alterações fisiológicas que podem ocorrer durante a triagem celular.

Em geral, indivíduos novos neste método terão dificuldades porque não saberão como configurar o classificador de células nem como confirmar a classificação precisa. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de biologia de sistemas vegetais. O problema em identificar redes de regulação gênica em órgãos multicelulares complexos, como uma folha, é que diferentes tipos celulares expressam grupos distintos de genes.

Essas informações genéticas são perdidas na análise de colheita de uma folha inteira, conforme demonstrado no procedimento. Ao meu lado estarão Ellison As e Sanjeev Kuma, que fornecem apoio técnico para este trabalho em nosso laboratório. Primeiro, preencha uma placa de Petri redonda de nove centímetros com 20 mililitros da solução A, contendo enzimas protoplastolíticas e inibidores de transcrição e de RNAses.

Em seguida, colete o material foliar desejado para amostras contendo mais de uma única folha, como a amostra mostrada aqui. Organize as folhas em uma pilha de até 15 folhas. Em seguida, use uma lâmina de barbear para cortar as folhas em tiras com um milímetro de largura.

Transfira imediatamente as tiras de folha para a placa de Petri usando uma pinça plana, separe delicadamente as tiras e, em seguida, realize a infiltração a vácuo das amostras duas vezes, por cinco minutos cada vez. Em seguida, coloque a placa de Petri sobre um agitador orbital ajustado a 90 rpm em temperatura ambiente e incube as amostras por três a quatro horas. Durante a incubação, use a pinça para separar as tiras de folha umas das outras em intervalos de meia hora.

Após a digestão, filtre suavemente a solução de protoplastos através de um filtro celular de 70 mícrons para um tubo de 50 mililitros. Para remover as tiras de folha, as tiras serão retidas. Os protoplastos passarão pelo filtro.

Agora, utilize quatro mililitros da solução A para lavar suavemente as tiras de folha, coletando a lavagem no tubo de 50 mililitros. Em seguida, transfira a suspensão de protoplastos para tubos de fundo redondo e centrifugue os protoplastos por cinco minutos a 300 vezes G e temperatura ambiente. Tendo cuidado para não perturbar o pellet, aspire suavemente o sobrenadante, removendo o máximo possível, e então lave os protoplastos com cinco mililitros da solução A nas mesmas condições de centrifugação.

Por fim, após remover o sobrenadante, use uma ponteira cortada de P 1000 para ressuspender os PROTOPLASTOS em um volume apropriado da solução A para triagem imediata antes da triagem. Use uma ponteira não cortada de P 1000 para desagregar quaisquer agregados na solução de protoplastos. Dissocie ainda mais as células filtrando os protoplastos para um tubo de coleta através de um filtro de filón de 50 mícrons.

Em seguida, dilua a solução celular conforme apropriado para evitar o entupimento do bico de coleta celular. Após determinar as condições ideais de coleta celular, identifique os protoplastos positivos para GFP Proto com um laser Argonne de 488 nanômetros combinando a saída do filtro passa-banda 580 30 com o filtro passa-banda 530 40. Observe que os protoplastos positivos para GFP aparecerão na população com valor alto em 530 e baixo em 580.

Com os protoplastos não GFP na população baixa em 530 e baixa em 580, os protoplastos mortos, em processo de morte e os detritos aparecem na população alta em 580. Para visualização dos protoplastos classificados por microscopia de fluorescência, classifique os protoplastos diretamente em pelo menos oito volumes da solução A após a concentração. Os protoplastos podem ser classificados em oito volumes da solução A e coletados para visualização em um microscópio de fluorescência, a fim de verificar o enriquecimento. Esta primeira imagem mostra um exemplo de enriquecimento da linhagem celular TP 382, que expressa GFP nas células-guarda. Exemplos de rendimentos obtidos com este método, tanto antes quanto após a amplificação, são resumidos nesta tabela.

As quantidades obtidas entre 500 picogramas e 50 nanogramas são suficientes para amplificação pelo sistema ovation PICO WTA e análise subsequente por PCR quantitativa, sequenciamento de próxima geração ou microarranjo. Esta próxima série de imagens mostra várias linhagens celulares de protoplastos isoladas e classificadas pelo método aqui descrito. Estes primeiros protoplastos foram derivados de KC 2 74, folhas de uma seção transversal de KC 2 74.

Folha mostra que a GFP é expressa no sistema vascular. Esses protoplastos foram isolados de folhas KC 4 64 e uma seção transversal de uma folha KC 4 64 mostra que a expressão de GFP é encontrada na epiderme adaxial. Finalmente, esses protoplastos foram derivados de folhas TP 3 82 em folhas TP 3 82.

A GFP é expressa nas células-guarda aqui. Gráficos de dispersão típicos de aquisição por fax ilustram os resultados obtidos com os filtros de passagem de banda de 5 80 30 nanômetros versus 5 30 40 nanômetros. Os portões de separação mostrados são aqueles tipicamente utilizados durante a separação.

Este primeiro gráfico de dispersão de protoplastos derivados de folhas de coal four, protoplastificados na ausência de inibidores, mostra uma única população com baixa fluorescência em 530 e baixa em 580. Enquanto isso, este gráfico de dispersão de protoplastos derivados de folhas de tipo selvagem de coal four, protoplastificados na presença de inibidores, demonstra a mudança na fluorescência em 580 que ocorre devido ao estresse e coloração provocados pelos inibidores. Esses gráficos de dispersão são de protoplastos derivados de folhas das linhagens KC seven four, KC 4 64 e TP 3 82, respectivamente.

Essas amostras também foram analisadas por citometria de fluxo na presença de inibidores, demonstrando que a GFP estava contida nas populações alta 530 e baixa 580. Para este experimento representativo de PCR quantitativa, amostras foram inicialmente obtidas para cada tipo de fração. As amostras foram então amplificadas utilizando o sistema ovation PICO WTA e PCR quantitativa.

Foi realizada a utilização de primers específicos para GFP. Os valores apresentados são os mais altos em vermelho e os mais baixos em verde; médias ou valores individuais, utilizando actina dois como gene de referência, são indicados pelas barras horizontais amarelas. Os resultados confirmam novamente as avaliações ópticas do conteúdo celular de GFP nas frações classificadas.

A população alta em 530 e baixa em 580 exibiu os níveis mensuráveis mais altos de expressão de GFP. Embora a população alta em 530 e alta em 580 tenha exibido uma expressão de GFP cerca de 1000 vezes menor, as populações baixa em 530 e baixa em 580, e baixa em 530 e alta em 580 exibiram baixos níveis de expressão de GFP comparáveis aos das populações controle de folha inteira e de protoplastos não ordenados. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em quatro a cinco horas, da planta até a população celular ordenada, se for executada corretamente. Durante a realização deste procedimento, é importante lembrar-se de monitorar constantemente o classificador celular e recalibrá-lo, se necessário, para manter a precisão da separação.

Encontrou-se este procedimento. Outros métodos, como a análise por microrrevestimento, podem ser realizados para comparar os níveis de expressão gênica em diferentes tipos celulares. Agora que esta técnica foi desenvolvida, estamos analisando a expressão gênica em tipos celulares foliares específicos em diferentes estágios de desenvolvimento e compararemos esses dados com os obtidos da folha inteira, gerados no projeto de agronomia.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar tipos celulares individuais de folhas utilizando classificação de células ativadas por fluorescência.