Name: Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Aprenda a analisar antígenos glicoesfingolipídeos em células imunes por espectrometria de massa. Este método sensível permite detectar biomarcadores de câncer com alta precisão molecular.

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DZ é suportado pelo MD Anderson Cancer Center e bolsas NIH AI079232. MD Anderson Cancer Center é apoiado em parte pelo NIH concessão CA16672.

1. Preocupações de segurança em laboratório <ol><li> Todos os solventes orgânicos devem ser armazenados em áreas específicas, com rotulagem clara. Veja rótulos pelos fabricantes para os tipos de extintores de incêndio necessários. </li><li> Vários reagentes utilizados são potencialmente carcinogénico e pode causar depressão mental. Estes reagentes devem ser tratados de uma capa química com ventilação (Veja a tabela de reagentes e equipamentos específicos para fins específicos). </li><li> Recomenda-se que ao trabalhar com solventes orgânicos, e as células, o equipamento de protecção individual, como luvas, bata e óculos de protecção ser utilizados em todos os momentos. </li></ol> 2. Extracção de Glicoesfingolipídeos de células de leucemia de rato <ol><li> Loja de ratos RBL células de leucemia 8 (de 10 a 100 milhões) em tubos de vidro 16x100 mm sob -80 ° C condições. As células são contadas por um hemocitómetro após coloração com azul de tripano. Viabilidade das células deve ser superior a 95%. </li><li> Extraia os lipídios usando sonicat extensaion quatro vezes para cada 1-2 horas com solventes de polaridade mistos. Use 6 ml de clorofórmio-metanol 1:1 (v / v) como solvente e sobrenome. Seis mililitros de isopropanol: hexano: H2O 55:25:20 (v / v / v, fase superior remover por aspiração antes da utilização) pode então ser utilizado como o solvente de segundo e terceiro. Este solvente é preparado por mistura de isopropanol: hexano: H 2 O numa proporção de 55:25:20, com agitação vigorosa, e uma fase superior que permite a aparecer, o qual será removido. Manter a fase inferior para utilização. </li><li> Siga sonicação com centrifugação para sedimentar o material insolúvel. A piscina do sobrenadantes. Secá-los num Speedvac durante 4 h. Corrente de azoto ou evaporador rotativo pode ser usado se Speedvac não está disponível. Use uma boa armadilha frio para segurar evaporaram solventes orgânicos. A contaminação de um solvente orgânico no óleo da bomba de vácuo irá diminuir a eficiência da bomba de vácuo. </li><li> Faça uma análise preliminar usando alto desempenho cromatografia em camada delgada (HPTLC). Para quantificar glicolipídios, Preparar uma orcinol a 0,2% em solução de ácido sulfúrico a 50% (100 mg em 50 ml) e um padrão de Galactose (40 mg em 100 ml de solução concentrada). Preparar, em 30 ul de volume de reacção de uma série de diluições para usar como curva padrão (de 0 g / L até 20 g / L). Adicionar 20 ul de metanol a cada amostra de séries de diluição. Dissolver cada amostra de glicolípidos em 200 ul de metanol, sonicar, e utilizar para a medição de 20 ul quantidade de glicolípidos. Em tubos de 1,5 ml de Eppendorf com tampas roscadas (Sarstedt, 72.692.005), adicionar 0,4 ml de 0,2% de orcinol em solução de ácido sulfúrico a 50% para cada uma das amostras, com uma série de Galactose-H 2 O-metanol soluções que servem para a curva padrão . Ferver durante 5 min em bloco de aquecimento a 100 ° C. Ler a densidade óptica de reação de cor a 440 nm usando Sunrise Tecan Leitora. Para executar HPTLC, utilizar clorofórmio: metanol: H2O 60:35:8 (v / v / v) como solvente de lipídeos neutros tratados com clorofórmio-metanol 1:1 (v / v). Use isopropanol: hexano: H2O 55:25:20 (v / v / v) comoo solvente para os lípidos ácido (gangliósidos). Os isolados GSLs neutros foi dissolvido em 200 ul de clorofórmio solvente: metanol 1:1 (v / v) e carregado em sílica Merck placa de cromatografia em camada fina de gel por Drummond microcaps. As placas foram analisadas em clorofórmio solvente: metanol: H2O 60:35:8 (v / v / v) e seca-se. Os glicoesfingolípidos foram visualizadas por orcinol-ácido sulfúrico a 300 ° C. </li><li> A fim de separar os lípidos neutros a partir dos ácidos, fracção de lípidos para fora os lípidos neutros e ácidos, por cromatografia de permuta aniónica sobre uma pequena coluna de DEAE Sephadex A-25 [a DEAE Sephadex A25 resina pode ser preparada por imersão de resina Sephadex A-25 pó em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) durante a noite. Aspirar o sobrenadante até que a resina Sephadex A25 é tudo o que resta. Adicionar clorofórmio fresco: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) para lavar a resina. Repetir três vezes para remover os resíduos de carga negativa a partir de Sephadex] resina A25. </li><li> Dissolver, Sonicado (por não mais do que 10 min), e ressuspender os lipidos a partir do passo 2.1 em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v), quando necessário. </li><li> Prepara-se uma pequena DEAE Sephadex A25 (Cl) Forma coluna usando lã de vidro e um 9 &quot;pipeta de Pasteur. Embalar a lã de vidro cuidadosamente, de modo que o pó de resina não passar através da coluna. Adicionar DEAE Sephadex A25 (Forma Cl) de resina para o&quot; pescoço &quot;da 9&quot; pipeta de Pasteur, sem deixar que a coluna seca. Certifique-se que você não vê qualquer resina em eluente. As amostras dissolvidas em clorofórmio: metanol: H2O 30:60:8 (v / v / v) foram dissolvidos. A fracção de lípido neutro é o fluxo através da fracção. </li><li> Eluir a fracção de lípido acídico (ligada às resinas) com 8 ml de acetato de sódio em metanol. Secar ambas as fracções neutros e ácidos, dessalinizar los por diálise, secá-los por Speedvac e analisá-las por HPTLC. </li></ol> A fracção ácida contém gangliósidos, que podem ser dialisados ​​para a reacção 3 Passo directamente.A fracção neutra contém não só glicoesfingolípidos neutros, mas também fosfolípidos (fosfatidilcolina e esfingomielina), que devem ser removidos por uma reacção de acetilação. Na nossa experiência, o método de uma cassete de diálise, é mais eficiente e conveniente do que um tubo de diálise ou cromatografia de coluna de fase reversa C18. <ol start="9"><li> O próximo passo é a remoção de fosfolípidos de glicoesfingolípidos neutros por uma reacção de acetilação e peracetylation. Seca-se o Sephadex DEAE A-25 fracção de passagem no Speedvac (com arrefecimento) durante 4 horas. Depois que as amostras são secas, colocá-los de volta para o Speedvac e seco para outro hr 4. Assegure-se que estas amostras são completamente seco, qualquer água residual que vai impedir que a reacção peracetylation. </li><li> Peracetylate as amostras com 1 ml de piridina e 0,5 ml de anidrido acético, no escuro, à temperatura ambiente ou a 37 ° C durante a noite. Esta quantidade de anidrido acético e piridina é adequada para sede 200 ug de glicoesfingolípidos. Esta reacção pode ser realizada a 37 ° C, enquanto os GSLs têm melhor solubilidade. </li><li> Secar o material peracetilado por Speedvac durante 3 horas, com a adição de 1 ml de tolueno 3x (coevaporação) para assegurar a completa evaporação. Se as amostras não são ainda completamente seco, Speedvac até secar. </li><li> Prepara-se uma coluna de Florisil (Sigma-Aldrich) (30-60 mesh, 10 x 80 mm) de uma pipeta de Pasteur com a lã de vidro, utilizando esferas de Florisil. Grânulos de florisil deve ser completamente seco antes da sua utilização, por incubação num forno a 110 ° C. Encha as pérolas na pipeta Pasteur até ao pescoço, e equilibrar em 1,2-dicloroetano-hexano 4:1 (v / v). </li></ol> A eluição a partir da coluna de Florisil é muito rápido. Volatilidade rápida dos solventes pode conduzir à secagem da coluna. Assim, todas as misturas de solventes deve ser preparada antes de correr a coluna, uma vez que não é possível parar a coluna durante a eluição. <ol start="13"><li> Aplique o peracetílicoated amostra em 1 ml de 1,2-dicloroetano-hexano 4:1 (v / v), e lava-se a coluna com 6 ml do mesmo solvente, seguindo-se 10 ml de 1,2-dicloroetano. Eluir neutros GSLs peracetilado com 6 ml de 1,2-dicloroetano-acetona 1:1 (v / v). Este passo remove os fosfolípidos peracetilado de glicoesfingolípidos, porque os glicoesfingolípidos peracetilado liga à coluna de Florisil, enquanto fosfolípidos peracetilado não. </li><li> Secam-se as fracções por Speedvac durante 2 horas e desacetilar com 2 ml de metóxido de sódio 0,5 M [Sigma-Aldrich, 403067] em 2 ml de metanol durante 3 horas à temperatura ambiente. </li><li> Neutraliza-se a mistura com 3 ml de ácido acético metanólico [ácido acético / metanol 15/85 v / v], seco por Speedvac, desalt por diálise [Dissolver os produtos secos, em 3 ml de água, e injectar no Slide-A-Lyzer Cassete de diálise, dializar contra água durante 24 h. Troque a água pelo menos duas vezes]. Secar os GSLs dialisados ​​(em solução aquosa) por Speedvac até as amostras estarem completamente secos. </li&gt; </ol> 3. Chemical Modification (permetilação) de 13 Glicoesfingolipídeos <ol><li> Introduzir GSLs (1-20 ug) para um tubo de vidro com tampa de rosca e revestimento de teflon, e adicionar sulfóxido de dimetilo (150 ul) sem o uso de condições de secagem especiais ou atmosfera de gás inerte. </li><li> Preparar hidróxido de sódio em pó (40-60 mg) a partir de partículas de hidróxido de sódio moendo-se num almofariz com um pilão de química. Certifique-se de armazenar os pós em um ambiente muito seco e ter o cuidado de fazer a retificação na capa química para evitar respirar o pó. </li><li> Em seguida adicione o pó de hidróxido de sódio à solução de amostra, com uma espátula. Adicionar iodometano (80 uL) com uma seringa de 100 microlitros Halmilton, [ou um VWR microlitro 100 calibrado pipeta ligada a uma seringa através de uma tubagem de borracha podem ser usados], e agitar a mistura à temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Extingue-se a reacção de metilação com água (2 ml). Extrair os produtos permetilada 3 vezes pora adição de diclorometano (2 ml) [glicolipidos estão em fase de diclorometano, que é a fase mais baixa, então a fase superior é transferida para um tubo de vidro de novo, e foi extraída de novo com diclorometano]. </li><li> Lavar os extractos combinados de diclorometano a 3 vezes com 2 ml de água [a fase superior, que é a água, pode então ser eliminados]. Após a lavagem final, transferir as amostras para um novo tubo, e secar utilizando o Speedvac. </li><li> As amostras podem então ser dissolvido em 100 a 200 ul de metanol para análise ESI-MS. </li></ol> 4. MALDI-TOF Análise dos Gycosphingolipids permetilada <ol><li> Executar MALDI-TOF-MS e MALDI-TOF/TOF-MS/MS experiências num TOF-TOF MALDI Mass Spectrometer (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Preparar a matriz através da mistura de volume de 50% de 10 mg / ml de ácido di-hidroxibenzóico (DHB) em acetonitrilo e 50% de volume de 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) em água. </li><li> A matriz DHB pode ser visto no targe MALDIt (1 ul), seguido por um pi 1 (contendo 100 ng GSLs) mancha da amostra dissolvida em metanol. Aplicar lentamente e deixá-la secar antes da análise. </li></ol> 5. Ion trap MS Análise de Glicoesfingolipídeos permetilada <ol><li> Realizar a espectrometria de massa de um espectrómetro de massa linear ion trap (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA), utilizando uma fonte de nanoelectrospray, 0,30 caudal ul / min a 230 ° C de temperatura capilar em modo de ião positivo com uma energia de colisão de 30-50%. Definir as energias de colisão para deixar uma abundância mínima residual do ião precursor. Detectar todos os iões de sódio como adutos. </li><li> Identificar o iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) numa mistura de Gb3 isobárica (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) iGb3 padrões ao comparar os diferentes padrões de MS quatro iões dos produtos a partir do ião molecular sodiated através do fragmento de glicano m / z 667 e do terminal de dissacarídeo 1 - eno ião de m / z 445 (isto é,X → 667 → 445 →, X significa o ião molecular detectado em MS 1) de puras permetilada iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) Normas via ESI-LIT-MS com as do permetilada Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol><li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P. Chapter 10 Glycosphingolipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchnaar%2C+RL+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).</li>
<li>Bendelac, A. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBendelac%2C+A+%22Fundamental+Immunology%22">Fundamental Immunology</a>. Paul, W. E. , 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).</li>
<li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li>
<li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+function+of+iGb3%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protein+Pept.+Sci%22%5BJournal%5D)">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li>
<li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li>
<li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mapping+of+glycomes%3A+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li>
<li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li>
<li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li>
<li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li>
<li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+permethylation+of+glycolipid%2C+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205(1964).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209(1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li>
<li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li>
<li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213(2003).</li>
<li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).</li>
<li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li>
<li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib%3A+an+MSn+spectral+library%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li>
</ol>

DZ é um consultor para Biotex, Houston, TX, e um inventor envolvido em patentes relacionadas a tecnologias mencionadas neste artigo, emitidos ou na aplicação.

O glycome, cunhado em analogia com o genoma e proteoma, refere-se a todas as estruturas de sacarídeos de um organismo. Para compreender plenamente as funções múltiplas de glicosilação exigirá uma abordagem integrada, incluindo ambos os estudos funcionais e estruturais Glicômica. Ambos são complicados pela natureza não-molde dirigido de glicano biossíntese, a complexidade resultante e diversidade de estruturas de glicano, o frequente envolvimento de estrutura aglicona na modulação de glicano interacções ligando-receptor ao nível molecular, bem como a importância funcional de ligandos de baixa abundância. É geralmente aceite que a espectrometria de massa (MS) é um método indispensável para estudos estruturais Glicômica, especialmente para identificação e caracterização de ligandos de baixa abundância. Para observar glicanos ou glicoconjugados como espécies moleculares, muitas vezes usamos um altamente eficiente, o método de ionização baixa energia, chamado de ionização electrospray (ESI). Para mais detailed caracterização da estrutura de glicano, é essencial para seleccionar espécies moleculares individuais e quebrar os glicanos em pedaços menores. Isto é normalmente feito por dissociação induzida por colisão, o que envolve a activação dos glicanos por colisão com as moléculas de gás inerte. O aumento da energia induz quebras ligação, e uma análise sistemática dos fragmentos resultantes fornece informações sobre a estrutura molecular do glicano. Muitas vezes, &quot;assinatura&quot; de fragmentos pode ser gerada, que é diagnóstico para determinadas características estruturais de glicano. Em conjunto com a massa molecular, estes fragmentos podem, por vezes, ser suficiente para a identificação de glicanos, mas no passado muito mais informação tiver sido solicitada para caracterizar completamente a eles, em particular, se a estrutura é nova. Estes métodos incluem a análise de açúcar a composição, a análise de cromatografia gasosa espectrometria de massa de parcialmente metilados alditol acetatos para a análise de ligação e digestão glicosidase específico 17. 18-19, múltiplos ciclos de fragmentação de baixa energia, o qual pode ser eficazmente levada a cabo num espectrómetro de massa de armadilha de iões-(IT-MS), melhora significativamente o rendimento de informações a partir de glicano análise espectral de massa . Com quatro ou cinco ciclos de fragmentação (que não pode ser feito com outros instrumentos de MS), é possível distinguir glicanos isoméricas que contêm os componentes de açúcar mesmas dispostas em ligações de açúcar diferentes, mesmo quando estes estão presentes em conjunto em misturas de componentes com a mesma massa molecular (isóbaras). Para esta análise, os glicanos foram derivatizadas, substituindo todos os grupos hidroxilo livres com grupos metilo utilizando permetilação. Enquanto atribuição estrutural dos glicanos é possível sem permetilação, a permetilação aumenta a sensibilidade 17. Levery e Zhou, têm combinado de todas as vantagens potenciais da TI-MS metodologia, incluindo a detecção de isomérica structures utilizando iões de assinatura de diagnóstico, apenas observáveis ​​em MS 4 e 5, os espectros de MS para a identificação de elevada sensibilidade e quantificação de glicoesfingolípidos presentes sob a forma de misturas de várias isobáricas 7-9. Em teoria, pode ser capaz de identificar cada estrutura glicolipídeo existente, enquanto se aguarda a disponibilidade de glicolipídeos padrão, que podem ser sintetizados quimicamente. Os passos críticos dessa análise são a taxa de recuperação de GSLs de amostras biológicas. Tipicamente 80 ug de GSL podem ser recuperados a partir de 100 milhões de células de tumor, tais como RBL. Para gerar suficientes iões moleculares para múltiplos ciclos de fragmentação em espectrómetros ion-trap de massa, pelo menos 10 microgramas de GSLs tumorais são necessários. Baixo rendimento durante a purificação de GSLs conduzirá a baixa abundância de iões, que não podiam ser submetidos a nova fragmentação. O sucesso da análise é dependente da quantidade de GSL que são recuperados. Tipicamente, concentração finalentration de GSLs permetilada deve chegar a 1 mg / ml, dissolvida em metanol, antes de ser analisado numa fonte de nano-electrospray. O limite de uma análise minuciosa MS n depende da abundância de iões específico em MS perfil 1. Um típico e abundância de iões 7 é necessário para uma completa análise MS 5. O baixo rendimento de GSLs durante a purificação pode ser causada por uma perda de GSLs durante o passo peracetylation (que remove os fosfolípidos), quando os GSLs per-acetilados devem ser ligados a resina de cromatograf ia de coluna de Florisil, lavou-se, e subsequentemente eluída. A fim de assegurar a ligação de per-acetilados GSLs para gel de sílica, as amostras devem ser recarregado duas vezes para a coluna de cromatograf ia depois flui através.

<table><tbody><tr><td>1,2 Diclor&amp;#8211;etano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34872</td><td>Cancerígeno </td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>VMR</td><td>JT9524-0</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido acético</td><td>Fluka</td><td>45830</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fischer</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio </td><td>Fischer</td><td>C606-1</td><td>Cancerígeno</td></tr><tr><td>DEAE Sephadex A25 (Forma Cl)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>AB 17&amp;#8212;170-01</td><td>100 gramas</td></tr><tr><td>Decano (anidro): </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457116</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Ácido dicloroacético</td><td>Sigma</td><td>D54702</td><td>Cancerígeno</td></tr><tr><td>Cassete de diálise </td><td>Fischer(Pierce)</td><td>66110</td><td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20684</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etila </td><td>Fischer</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>Florisil</td><td>Fluka</td><td>46384</td><td>para empacotar coluna de cromatografia</td></tr><tr><td>Hexanos </td><td>EMD</td><td>HX0290-6</td><td></td></tr><tr><td>Iodometano </td><td>Riedel de Haen, Alemanha</td><td>03810</td><td>estabilizado com folha de prata, cancerígeno</td></tr><tr><td>Metanol </td><td>VWR/EMD</td><td>MXO475-1</td><td></td></tr><tr><td>Qualmix de glicoesfingolípides neutros </td><td>Matreya</td><td>1505</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de monossialgangliosídeos</td><td>Matreya</td><td>1508</td><td></td></tr><tr><td>Mistura de dissialgangliosídeos </td><td>Matreya</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>Lactosilceramida e derivados sialilados </td><td>Matreya</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Gangliotetraosilceramida e derivados sialilados </td><td>Matreya</td><td>1511</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Piridina: </td><td>Sigma</td><td>270407</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio: </td><td>BDH</td><td>0292</td><td>500 gramas</td></tr><tr><td>Metóxido de sódio </td><td>Sigma</td><td>404367</td><td>Solução 0,5 M em metanol</td></tr><tr><td>Tolueno </td><td>J.T. Baker</td><td>9351-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>Fibra de vidro (lã de vidro)</td><td>Corning Incorporated</td><td>3950</td><td>Pyrex 9989 vidro</td></tr><tr><td>Tubos de vidro 12x75 mm</td><td>Fischer</td><td>14-962-10B</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas calibradas (100 microlitros)</td><td>VMR</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>Tubos descartáveis de borossilicato 16x100 mm x1.000 </td><td>Fischer</td><td>14-961-29</td><td>Com tampas rosqueáveis</td></tr><tr><td>Tampas para tubos de vidro</td><td>Kimble</td><td>40566C</td><td>tamanho/13-415 </td></tr><tr><td>Placas Merck TLC</td><td>Sigma</td><td>Z 29, 301-6</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de vidro para TLC</td><td>Sigma</td><td>Z 12,619-5</td><td></td></tr><tr><td>Microcápsulas Drummond </td><td>Drummond scientific company</td><td>1-000-0100</td><td>10 &amp;mu;l, para carregamento de amostras de TLC</td></tr><tr><td>Leitor de Absorbância Sunrise Microplate</td><td>Tecan</td><td>A-5082</td><td></td></tr><tr><td>Papel de cromatografia Whatman</td><td>Fischer</td><td>05-716-3E</td><td>18 cm x 34 cm Para Tanque TLC</td></tr><tr><td>Reagente em spray de cloreto férrico com orcinol</td><td>Sigma</td><td>O7875</td><td>Para detecção de glicoesfingolipídeos em placas de TLC</td></tr><tr><td>Unidade de pulverização Prevel</td><td>Sigma</td><td>Z 36,555-6</td><td></td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>Fischer</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Savant</td><td>AS160</td><td>Com armadilha química para solventes orgânicos</td></tr><tr><td>Espectrômetro de massas MALDI TOF-TOF</td><td>Applied Biosystems</td><td>Proteomics 4700</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de massas com armadilha iônica</td><td>Thermo</td><td>LTQ</td><td></td></tr></tbody></table>

análise por espectrometria de massa de antígenos glicoesfingolipídeos

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glicoesfingolípidos (GSL) pertencem à classe de glicoconjugado biomacromoléculas, que levam informações estruturais significativas para os processos biológicos, tais como o desenvolvimento embrionário, a transdução de sinal, e no reconhecimento imunológico do receptor 1-2. Eles contêm porções de açúcar complexos, sob a forma de isómeros, e porções lipídicas, com variações, incluindo comprimento de cadeia acilo gordo, de insaturação, e hidroxilação. Ambas as porções de hidrato de carbono e de ceramida pode ser base de significância biológica. Por exemplo, o tri-hexosylceramides incluem globotriaosilceramida (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) e isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), que possuem massas moleculares idênticas mas ligações de açúcar diferentes de fracção de hidratos de carbono, completamente responsável por diferentes funções biológicas 3-4. Em outro exemplo, demonstrou-se que a modificação da parte ceramida de alfa-galactosilceramida, um ligando agonista potente para invariantecélulas NK, mudanças de formigas seus perfis de citocinas secreção e função em modelos animais de câncer e doenças auto-imunes 5. A dificuldade na realização de uma análise estrutural de isómeros nos órgãos e células imunes servir como uma barreira para a determinação muitas funções biológicas 6. A seguir, apresentamos uma versão visualizada de um método de análise relativamente simples, rápido, sensível e de perfis de glicoesfingolipídeos em células imunes 7-9. Este método baseia-se na extracção e modificação química (permetilação, ver abaixo Figura 5A, todos os grupos OH de hexose foram substituídos por MeO após reacção permetilação) de glicoesfingolípidos 10-15, seguido de posterior análise usando laser assistida por matriz de dessorção / ionização-tempo de vôo espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS) e espectrometria de massa de íons armadilha. Este método exige 50 milhões de células imunes para uma análise completa. Os experimentos podem ser concluídas dentro de uma semana. A abundância relativa dos vários glicoesfingolípidos pode ser delineada por comparação com padrões sintéticos. Este método tem uma sensibilidade de medição de 1% entre iGb3 Gb3 isómeros, quando da mistura de 2 fmol iGb3/Gb3 total está presente 9. Espectrometria de massa de iões de captura podem ser utilizadas para analisar os isómeros. Por exemplo, para analisar a presença de globotriaosilceramida isoglobtriaosylceramide e na mesma amostra, pode-se utilizar a fragmentação de moléculas estruturalmente glicoesfingolipídeos a discriminar entre os dois (ver Figura 5 abaixo). Além disso, a modificação química das porções açúcar (por meio de uma reacção de permetilação) melhora a eficiência de ionização e fragmentação de maior sensibilidade e especificidade, e aumenta a estabilidade dos resíduos de ácido siálico. A modificação química de extracção e glicoesfingolípidos pode ser realizada em um capuz clássico químicas certificadas, e a espectrometria de massa pode ser realizada por núcleoinstalações com instrumentos ion trap MS.

Um exemplo de uma análise de MS MALDI dos glicoesfingolípidos de rato RBL linha de leucemia de células (um tipo de célula que apresenta o antigénio que apresenta antigénios glicoesfingolipídeos de células NKT) é mostrado na Figura 3. Os iões podem ser atribuídos a estruturas específicas glicoesfingolipídeos (Figura 3A). Em células RBL tratados por NB-DGJ 16, uma droga que inibe a síntese de glicosfingolípidos, redução significativa de todos os glicoesfingolípidos foi observado (Figura 3B). Isómeros estruturais não podem ser distinguidas. A capacidade de MS / MS do Applied Biosystems 4700 permite a fragmentação de iões MS1 para MS 2 fragmentos, permitindo que a informação estrutural limitado a ser gerado. No entanto, a análise de MS2 muitas vezes não é suficiente para discriminar isómeros de oligossacáridos. O Ion-Trap MS análise de glicoesfingolípidos permite o estudo de isómeros, tais como iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) e Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) que podem existir como os iões trihexosylceramide detectados na Figura 3A. Para detectar esses isómeros, padrão iGb3 Gb3 e foram analisados ​​por múltiplos ciclos de fragmentação, até que foram encontradas diferenças (Figura 4A e 4B). No exemplo aqui apresentado (Figura 5C) e iGb3 Gb3 puderam ser discriminados por comparação com o padrão iGb3 e Gb3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma do procedimento de extracção, glicosfingolípidos e modificação química de glicoesfingolípidos (permetilação). Glicoesfingolipídeos foram extraídas a partir de células por solventes orgânicos. Para remover não-glicoesfingolípidos, lípidos pode ser peracetilado e desacetilado. Em segundo lugar, glicoesfingolípidos foram quimicamente modificados através de uma reacção permetilação, o que melhora a sensibilidade e especificidade do MS detection. Por fim, os perfis glicoesfingolipídeos foram determinados utilizando MALDI-TOF de espectrometria de massa e espectroscopia de massa de iões armadilha. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figura 2. Quantificação glicosfingolípidos pelo método do ácido sulfúrico orcinol: Quantificação dos glicoesfingolípidos usando um 0,2% orcinol em solução de ácido sulfúrico a 50% e uma curva padrão de glucose. <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figura 3. Glycosphingolipidomics de células de leucemia de rato A. Representante de espectro de massa MALDI, cada ião. Representa uma estrutura específica glicosfingolípidos, isómeros estruturais não podem ser distinguidos B. NB-DGJ, uma droga que inibe a síntese de glicosfingolípidos, s.ignificantly reduz todos os glicoesfingolipídeos produzidos em células RBL. <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figura 4. Tandem Espectrometria de Massa de isómeros de Glicoesfingolipídeos. A. Característica vias de decomposição de modo positivo a espectrometria de massa de íons armadilha de GSLs permetilada 3 GB Cer e igb Cer 3. Gb 3 e IGB 3 são claramente separados por seus padrões de fragmentação. As diferenças na ligação são reflectidos nas 4 ms iões de produtos compatíveis com as isobáricas m / z 445 precursores. B. Os resultados representativos mostrando iGB3 pode ser medido em uma mistura de isómeros iGb3/Gb3. Estrelas indicam íons diagnósticos para iGb3 apenas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para</a>ver figura maior. <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figura 5. Ion trap MS permite a análise de isômeros de glicoesfingolípidos. A. Padrão iGb3 e Gb3 demonstram diferença de perfil de fragmentação após quatro rodadas de fragmentação em uma armadilha de íons LTQ espectrômetro de massa. B. Característica MS 4 perfil de íons derivados de iGb3 ou Gb3. C. Trihexosyleramides são misturas de isómeros Gb3 iGb3 e que podem ser identificados por método de ion trap MS (Figura Dapeng por Zhou). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

Um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos glicoesfingolipídeos em órgãos e células do sistema imunológico é descrito. O método tira partido da espectrometria de massa de iões armadilha permitindo passo a passo de fragmentação de moléculas de glicoesfingolipídeos para análise estrutural em comparação com padrões de síntese química.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

Os glicoesfingolipídios (GSLs) pertencem à classe de biomacromoléculas de glicoconjugados, que carregam informações estruturais para processos biológicos significativos...

O objetivo geral deste procedimento é criar um método específico e sensível para obter informações sobre o perfil de expressão de antígenos lipídicos glicofíngicos em órgãos e células imunes. Isso é realizado primeiramente pela extração dos lipídios glicofíngicos das células. O segundo passo consiste em separar os lipídios glicofíngicos neutros dos lipídios glicofíngicos ácidos.Após a remoção dos fosfolipídios dos lipídios neutros, os glicolipídios extraídos são quimicamente modificados por meio de uma reação de permetilação, na qual todos os grupos hidroxila das hexoses são substituídos por grupos metoxi. Por fim, os glicolipídios extraídos são analisados utilizando a espectrometria de massas por ionização a laser assistida por matriz, com tempo de voo (MALDI-TOF MS) e espectrometria de massas com armadilha iônica. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a CLAE analítica e a coloração com anticorpos, é que a espectrometria de massas é mais sensível e mede com precisão a massa das moléculas.Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de imunologia, como a medição de glicolipídios antigênicos de baixa abundância. As implicações dessa técnica estendem-se para a terapia ou diagnóstico de câncer, pois muitos antígenos glicolipídicos, como o GD dois e o globo H, são expressos como biomarcadores de câncer. Vou demonstrar o procedimento como estudante de graduação do laboratório da professora DA pen Zoe.O Dr. David Hawk realizará procedimentos nos instrumentos de espectrometria de massas. Antes de iniciar este procedimento, prepare células de leucemia basofílica de rato contando as células com um hemocitômetro. Após a coloração com azul de tripano, a viabilidade das células deve ser superior a 95%. Extraia os lipídios adicionando primeiro seis mililitros de uma proporção volumétrica um para um de clorofórmio-metanol às células.Utilize sonicação extensiva por uma a duas horas com o solvente de polaridade mista. Repita este procedimento duas vezes com uma proporção volumétrica de 55 a 25 a 20 de isopropanol, hexano e água preparada conforme descrito no procedimento escrito como extração final. Adicione seis mililitros de clorofórmio, metanol e sonique previamente.Após a sonicação, realize uma centrifugação para formar o pellet do material insolúvel a 4.000 RPM durante cinco minutos. Retire a fase Senna antes de secá-la em um evaporador a vácuo por quatro horas. Para separar os lipídios neutros dos lipídios ácidos, utilize cromatografia de troca aniônica em uma pequena coluna de de A e sedex A 20.Após preparar o DEAE SEDEX A 25 conforme descrito no procedimento escrito que acompanha este vídeo, prepare a coluna utilizando uma parede de vidro e uma pipeta de pasta de nove polegadas. Encha cuidadosamente a parede de vidro para que o pó da resina não atravesse a coluna. Adicione a resina DEAE sedex A 25 ao pescoço da pipeta de pasta de ar de nove polegadas sem deixar a coluna secar.Certifique-se de que não haja resina no eent. Dissolva, sonique e re-suspenda os lipídios em uma proporção volumétrica de 30:60:8 de clorofórmio, metanol e água, e aplique as amostras dissolvidas na coluna. Os lipídios neutros passarão pela coluna, enquanto os lipídios carregados permanecerão na coluna; elua a fração de lipídios ácidos com oito mililitros de acetato de sódio em metanol.É mostrada aqui a fração seca carregada negativamente após tratamento com acetato de sódio. Dessaline as frações por diálise utilizando a cassete de diálise Slide Eliza. Seque as frações por evaporador a vácuo antes da análise preliminar dos lipídios por cromatografia em camada delgada de alta eficiência ou H-P-T-L-C; para realizar a H-P-T-L-C, dissolva os lipídios neutros glicofingolipídios isolados ou gsl em 200 microlitros de uma proporção volumétrica um para um de solvente clorofórmio-metanol.Carregue a amostra em uma placa de cromatografia em camada delgada de gel de sílica. Corra as placas em uma proporção volumétrica de 60:35:8 de clorofórmio, metanol e água após secar a placa. Visualize os lipídios glicofíngicos com ácido sulfúrico de arsenal a 300 graus Celsius para os lipídios ácidos ou gangliosídeos.Utilize uma proporção volumétrica de 55 a 25 a 20 de isopropanol, hexano e água como solvente e realize a corrida em H-P-T-L-C da mesma maneira. Neste ponto, a fração neutra contém não apenas glicolipídios neutros, mas também fosfolipídios, os quais devem ser removidos por reação de acetilação e para-acetilação. Primeiro, seque a fração que passou pela coluna de DEAE sedex A 25 em speed VAC com refrigeração por quatro horas.Após as amostras estarem secas, coloque-as novamente no speed vac e seque por mais quatro horas. Certifique-se de que essas amostras estejam completamente secas, pois qualquer resíduo de água impedirá a reação de para-acetilação. Adicione um mililitro de PERINE e 0,5 mililitros de anidrido acético às amostras para a reação de para-acetilação de até 200 microgramas de glicoesfingolipídios, incubando à escuridão a 37 graus Celsius durante a noite.Uma temperatura na qual os GSL apresentam melhor desempenho exige adicionar um mililitro de tolueno para garantir a evaporação completa e secar o material parafinado por meio de speed vac por três horas. Se as amostras ainda não estiverem completamente secas, utilizar o speed VAC até completa secagem, conforme mostrado aqui na amostra de ácido paracético seca. Enquanto isso, preparar uma coluna de Florisil secando completamente as esferas de Florisil mediante incubação em estufa a 110 graus Celsius.Em seguida, prepare a coluna em uma pipeta de pasta com lã de vidro, preenchendo a pipeta de pasta com as esferas até o pescoço e equilibrando numa proporção volumétrica de quatro para um de hexano e dicloroetano. A eluição a partir da coluna de célula de fluxo é muito rápida. A volatilidade rápida dos solventes pode levar à secagem da coluna. Assim, todas as misturas de solventes devem ser preparadas antes de executar a coluna.Como não é possível parar a coluna durante a eluição, aplique a amostra percentual em um mililitro a uma proporção volumétrica de quatro para um de hexano e dicloroetano. Lave a coluna com seis mililitros do mesmo solvente, seguido por 10 mililitros de dicloroetano para a eluição.O percet neutro com seis mililitros de uma proporção volumétrica um para um de acetona de dicloro um dois. Este passo remove os fosfolipídios percet dos lipídios glicofinger porque os lipídios glicofinger percet ligam-se à coluna de fluoral, enquanto os fosfolipídios percet não se ligam. Após secar as frações por centrifugação rápida durante duas horas, realize a desacetilação com dois mililitros de metóxido de sódio 0,5 molar e dois mililitros de metanol durante três horas à temperatura ambiente.Após a incubação, neutralize a mistura com três mililitros de metanol, ácido acético e seque por evaporador rotativo, desalize por diálise, dissolvendo os produtos secos em três mililitros de água e injetando na cassete de diálise Eliza seguido por diálise contra água por 24 horas, trocando a água pelo menos duas vezes. Seque o GSL dialisado por evaporador rotativo até que as amostras estejam completamente secas. Para a metilação completa. Primeiro, introduza o GSL em um tubo de vidro com tampa rosqueada e revestimento de teflon com 150 microlitros de dimetilsulfóxido sem usar condições especiais de secagem ou atmosfera de gás inerte, no capuz químico, prepare hidróxido de sódio em pó a partir de partículas de hidróxido de sódio moendo-as em um almofariz químico com um pistilo. Em seguida, adicione o pó de hidróxido de sódio à solução da amostra com uma espátula.Em seguida, adicione 80 microlitros de metano IO com uma seringa Hamilton de 100 microlitros. Agite a mistura à temperatura ambiente por uma hora após a interrupção da reação de metilação com dois mililitros de água; extraia os produtos perm-metilados pela adição de dois mililitros de diclorometano. Os glicolipídios estão na fase de diclorometano, que é a fase inferior, portanto a fase superior pode ser transferida para um novo tubo de vidro.Os produtos metilados perma podem então ser extraídos novamente por clorometano, totalizando três extrações. Lave os extratos combinados de diclorometano três vezes com dois mililitros de água, descartando a fase aquosa superior após cada lavagem; após a lavagem final, transfira as amostras para um novo tubo e seque. Usando o speed vac, as amostras podem então ser dissolvidas em 100 a 200 microlitros de metanol para análise por espectrometria de massas realizada conforme descrito no procedimento escrito; as amostras foram enviadas à unidade de proteômica do Centro de Câncer MD Anderson da Universidade do Texas e analisadas por espectrômetro de massas MALDI-TOF/TOF, bem como por um espectrômetro de massas com armadilha iônica LTQ.É apresentado aqui um exemplo da análise por espectrometria de massas MALDI de lipídios glicofingolípidos da linhagem celular de leucemia de rato RBL, um tipo de célula apresentadora de antígenos que apresenta antígenos de glicofingolípidos a células NKT. Os íons podem ser atribuídos a estruturas específicas de glicofingolípidos nas células RBL tratadas com o fármaco que inibe a síntese de glicofingolípidos. Foi observada uma redução significativa de todos os glicofingolípidos.Isômeros estruturais não podem ser diferenciados. A capacidade de msms do biosystems 4.700 aplicado permite a fragmentação de íons MS um em fragmentos MS dois, possibilitando a obtenção de informações estruturais limitadas. No entanto, a análise MS dois frequentemente não é suficiente para discriminar isômeros de oligossacarídeos, enquanto a análise por ion trap de lipídios glico-fingerprint permite o estudo de isômeros de oligossacarídeos para detectar tais isômeros.Os padrões de IGB três e GB três foram analisados por múltiplas rodadas de fragmentação até que fossem identificadas diferenças, conforme mostrado nesta característica. O perfil MS quatro de íons derivados de IGB três ou GB três quando diferentes proporções de IGB três e GB três são misturadas pode ser utilizado para construir uma curva padrão com base na abundância iônica de íons marcadores derivados de cada isômero. No exemplo apresentado aqui, IGB três e GB três puderam ser discriminados mediante comparação com os padrões.Este espectro representa a análise por MS4 de 1 3 2 5, o ferro molecular representando íons IMR de GB três e íons característicos de IGB três para IGB três e íons característicos para GB três foram detectados, sugerindo a presença de uma mistura dos dois isômeros. A proporção de IGB três para GB três foi calculada por comparação com uma curva padrão. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de recuperar completamente os glicolipídios durante a cromatografia antes da pro-metilação dos glicolipídios.Certifique-se de recuperar pelo menos 80 microgramas de glicolipídios durante a purificação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como analisar glicolipídios por um método semiquantitativo de espectrometria de massas. Você dominará os passos principais da extração de glicolipídios, separação em frações neutras e ácidas, modificação pela reação de per-O-metilação e envio dos glicolipídios modificados à sua instalação de espectrometria de massas.Não se esqueça de que trabalhar com dicloroetano, clorofórmio, ácido cloroacético e iotometano pode ser extremamente perigoso, pois são substâncias carcinogênicas, e precauções como o uso de luvas e jaleco laboratorial devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento. Respeite as regras e aproveite sua descoberta.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Usando glicosidases específicas para remover a partir de açúcares glicoproteínas seguido por SDS-PAGE é um método valioso para detectar modificações glicano em amostras de proteína e é uma boa escolha para estudos glycobiology inicial. Seguintes alterações deglycosylation podem ser detectados como mudanças na mobilidade gel ou através da coloração com glicano reagentes sensíveis.

Identificação e caracterização de glicosilação de proteínas específicas usando endo-e exoglycosidases

A fim de explorar de forma abrangente a diversidade de glicanos ligados a O, um novo procedimento para eliminação de β redutora em gel, combinado com permetilação e um método de partição rápida de fase, é aplicado à análise de glicanos ligados a O diretamente liberados de glicoproteínas resolvidas por SDS-PAGE e passíveis de análise glicômica subsequente por espectrometria de massa.

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Este artigo apresenta uma forma aprimorada de uma nova técnica de glicômica de baixo para cima projetada para analisar o perfil de composição agrupado de glicanos em biofluidos não fracionados por meio da decomposição química de glicanos em seus monossacarídeos específicos de ligação constituinte para detecção por GC-MS. As aplicações potenciais incluem a detecção precoce de câncer e outros distúrbios afetivos glicanos.

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Este artigo descreve um método para preparar as amostras de tecido para análise MS cardiovasculares que permite (1) a análise da composição de proteínas de ECM, (2) a identificação de locais de glicosilação, e (3) a caracterização da composição de formas de glicano. Esta metodologia pode ser aplicada, com pequenas modificações, para o estudo da ECM em outros tecidos.

Glicoproteômica da matriz extracelular: um método de análise GLICOPï¿½TIDOS Intact Usando Espectrometria de Massa

Ácido siálico é uma monossacarídeo-unidade típica encontrada em glicoconjugados. Está envolvido em uma infinidade de interações moleculares e celulares. Aqui nós apresentamos um método para modificar a expressão de superfície de ácido siálico célula usando glycoengineering metabólica com derivados de N- acetylmannosamine.

Glycoengineering metabólica do ácido siálico usando N-acil-modificado Mannosamines

Um ensaio de microarrays de sialoglicano pode ser usado para avaliar anticorpos anti-Neu5Gc em soros humanos, tornando-se um possível ensaio de diagnóstico de alto rendimento para câncer e outras doenças crônicas causadas por inflamação mediada por doenças humanas.

Perfis Anti-Neu5Gc IgG em Sera Humana com um Ensaio de Microarray de Sialoglicano

Este protocolo detalha o método glicoproteômico guiado por glicômica, uma tecnologia ômica integrada que oferece informações abrangentes sobre o glicoproteoma heterogêneo em microambientes tumorais complexos necessários para entender melhor a glicobiologia dos cânceres.

A glicoproteômica guiada por glicômicos facilita o perfil abrangente do glicoproteoma em microambientes tumorais complexos 

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a liberação de O-glicanos das mucinas e a subsequente dessalinização, permetilação e análise usando espectrometria de massa MALDI-TOF.

Perfil de O-glicanos de mucina permetilada usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz

Um protocolo foi desenvolvido para a preparação de mitocôndrias purificadas a partir de células microgliais, isolamento de proteínas mitocondriais para liberação de N-glicanos e detecção rápida de glicanos mitocondriais subcelulares usando ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha acoplada a espectrometria de massa de analisador de massa precisa de alta resolução.

Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

Este protocolo detalha os passos principais para permitir uma medição rigorosa e reprodutível tanto do glicogênio quanto dos glicanos N-ligados por meio de imagens por espectrometria de massas.

Imagem Molecular Espacial do Glycome Usando Espectrometria de Massa

Aprenda a analisar antígenos glicoesfingolipídeos em células imunes por espectrometria de massa. Este método sensível permite detectar biomarcadores de câncer com alta precisão molecular.

Análise por espectrometria de massa de Antígenos glicoesfingolipídeos

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