Name: A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Aprenda a aplicar carga compressiva dinâmica em condrócitos encapsulados em hidrogéis de agarose. Este método avalia a síntese de colágeno e proteoglicanos para estudos de engenharia de tecidos cartilaginosos.

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1. Isolamento de condrócitos articulares primárias Colheita 10-15 fatias de cartilagem de espessura completa das superfícies articulares das articulações de animais (por exemplo, a articulação metacarpo-falângica de vacas com esqueleto maduro obtido a partir de um matadouro local). <ol><li> Coloque fatias de cartilagem em uma placa de Petri de 100 mm e Incubar em 20 ml de 0,5% de protease em Ham F-12 (w / v) durante 2 horas a 37 ° C. Enxaguar três vezes em meio de Ham F-12 de cultura, e incuba-se com 20 ml de colagenase a 0,15% em meio A de Ham F-12 de cultura durante a noite a 37 ° C. </li><li> Filtra-se a suspensão de células através de um filtro de tela de 200 mesh para uma placa limpa. Lavar o filtro com 5 ml de Ham F-12 e adicionar ao prato. Transferir a suspensão de células para um tubo cónico de 50 ml. Lava-se a placa de Petri com 10 mL de Ham F-12 e adicionar ao tubo cónico. </li><li> Centrifugar o tubo de 600-800 rcf durante 6-8 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Aspirar o sobrenadante, garantindo a não perturbar the sedimento de células e re-suspensão em 40 ml de meio de Ham F-12 de cultura. </li><li> Centrifugar o tubo de 600-800 rcf durante 6-8 min. </li><li> Repita os passos 1.4 e 1.5 vezes mais para um total de 3 vezes. Antes da centrifugação, pela terceira vez, ressuspender o sedimento através da agitação e da obtenção de uma alíquota de 500 ul para a contagem de células. </li><li> Contar as células viáveis ​​utilizando o método de exclusão de azul de Tripan 9 com um hemacitómetro e um microscópio óptico invertido. </li><li> Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em um volume de F-12 de Ham meios para dobrar a densidade de sementeira desejada (por exemplo, 20 x 10 6 células / ml, para uma concentração final de 10 x 10 6 células / ml, após o encapsulamento). </li></ol> 2. Condrócitos-agarose Encapsulation Hydrogel <ol><li> Aquecer 0,8 g Tipo VII autoclavado agarose em 20 ml de solução estéril 1x PBS (pH 7,4) numa placa quente a 120 ° C até à dissolução. Uma vez dissolvido, reduzir o calor a 60 ° C como temperaturas mais elevadas will afetar a viabilidade celular. </li><li> Num tubo cónico de 50 ml, misturar cuidadosamente volumes iguais da suspensão de células com o dobro da concentração desejada de agarose (por exemplo, 4% de suspensão de agarose para um final de hidrogel de agarose 2%). Evitar a criação de bolhas grandes, pois podem afectar a viabilidade celular e construir a resistência à fadiga. </li><li> Cuidadosamente uma alíquota de 10 ml da mistura de condrócitos-agarose em um prato de 60 milímetros de diâmetro Petri, evitando a criação de bolhas grandes. </li><li> Deixar repousar durante 30 min à temperatura ambiente até que gelificou. </li><li> Obter o maior número de amostras de hidrogel de agarose-condrócito conforme necessário (tipicamente 20-30) utilizando um perfurador de biópsia 4 milímetros. </li><li> Medir e registrar as dimensões físicas (diâmetro e altura) de amostras representativas, utilizando um micrômetro. Construtos deve ser aproximadamente de 5 mm de altura, descartar quaisquer amostras obtidas a partir de uma região na qual a variação de altura da amostra foi superior a 2%. </li><li> Transferir as amostras para um prato 60 milímetros fresco Petri e suplementocom 10 ml de meio completo (por exemplo, 20% de soro fetal bovino em meio de Ham F-12 de cultura com 20 mM de HEPES, 100 mg de ácido ascórbico / ml, e antibióticos / antimicóticos 2x). </li></ol> 3. A estimulação mecânica e marcação radioactiva de condrócitos-agarose Hidrogéis <ol><li> Autoclavar os componentes metálicos do equipamento de compressão. Esterilizar os componentes de plástico com 70% de etanol (durante a noite) e luz ultravioleta (por, pelo menos, 15 min). </li><li> Para manter as construções de cair, utilizando fórceps, o local 12 anéis de plástico estéreis de retenção (com um diâmetro interior maior do que o diâmetro do construto) (n = 6, as amostras e controlos), dentro dos poços de uma placa de cultura de 24 cavidades. </li><li> Usando fórceps, transferir cuidadosamente os hidrogéis de condrócitos-agarose a partir de uma placa de Petri para a placa de 24 poços, assegurando cada uma em um anel de retenção. </li><li> Transferir 400 uL de meio completo (por exemplo, 20% de FBS em meio de Ham F-12 de cultura com 20 mM de HEPES, 100 ug / ml de ácido ascórbico, e2x antibiótico / antimicótico) a cada poço de amostra. </li><li> Monte o equipamento de compressão esterilizada (Figura 1) e fixe as placas com parafusos. Anexar o equipamento de compressão na placa de cultura de 24 cavidades. </li><li> Solte e re-assegurar os parafusos de ajuste para estabelecer cilindro hidrogel contato (zero estado de tensão). </li><li> Carregar o equipamento de compressão montados em um sistema de testes de Mach-1 micromecânico. Plataforma segura para a fase vertical via pino de localização e bloqueio no local com parafuso de fixação. Remova o gabarito de espaçamento. </li><li> Aplicar carga de compressão dinâmica da amplitude desejada (por exemplo, amplitude de deformação de 10% com base na altura original das amostras), a frequência (por exemplo, 1 Hz) e duração ou quantidade de ciclos (por exemplo, intervalos de tempo de até 60 min.) </li><li> Após a conclusão da estimulação mecânica, substituir o dispositivo de montagem de espaçamento, soltar o parafuso de fixação do pino de localização e remover o equipamento de compressão e a partir da placa de cultura de Teste do Sistema de Mach-1 micromecânico. </li&gt; <li> Radiomarcador célula-hidrogel construções, completando os meios de comunicação com 5 uCi de isótopo desejado (por exemplo, [3 H]-prolina etiqueta proteína por condrócitos específicos de síntese de colagénio e [35S]-enxofre para a síntese de proteoglicanos). </li><li> Incubar as construções marcadas radioactivamente, durante 24 horas a 37 ° C, 5% CO 2, 10. </li><li> Colheita das construções de hidrogel radiomarcados e lavar 3 vezes em 1x PBS (pH 7,4) para remover qualquer isótopo não incorporado. Digest amostras utilizando papaína (40 ug / ml em acetato de amónio 20 mM, 1 mM de ácido ethyldiaminetetraacetic e 2 mM de ditiotreitol a 65 ° C durante 72 horas). </li><li> Ensaio de digest para o conteúdo de ADN, utilizando o ensaio de PicoGreen corante 11 e incorporou actividade isótopo, normalizados para o conteúdo de ADN, por β-líquido de cintilação de contagem 12,13 digestão com papaína imediatamente a seguir. </li></ol> Nota: A compra e descarte de materiais radioativos (isótopos de resíduos e itensque possam ter estado em contacto materiais radioativos) devem seguir o institucional relevante (e / ou governamentais) políticas e procedimentos para o manuseio e eliminação de substâncias radioactivas. 4. Resultados representativos Bovina articulares construções condrócitos-agarose hidrogéis (2% de agarose com 10 x 10 6 células / ml, as células encapsuladas) foram estimulados mecanicamente a uma amplitude de 10% de deformação à compressão a uma frequência de 1 Hz por 20 a 60 minutos (ou 1200 a 3600 ciclos ) e ensaiadas para teor de ADN e síntese de matriz extracelular, por incorporação de radioisótopos. DNA e síntese de matriz extracelular foi afetado de maneira dose-dependente. O conteúdo de DNA apresentaram uma redução significativa de 35% como resultado de 20 ou 30 minutos de estimulação (p &lt;0,01), enquanto 60 minutos de estimulação não exibiu qualquer efeito (Figura 2). Cartilagem específica a síntese do colagénio e proteoglicanos (determinado por [3H]-prolina e[35S]-incorporação de enxofre, respectivamente) exibiram aumentos significativos de cerca de 60% ​​em resposta a 20 ou 30 minutos de estimulação (p &lt;0,01), com 60 minutos de estimulação que não apresente efeito observável (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="Figura 1" /> . Figura 1 Esquema do equipamento de compactação de custom-built dinâmica para estimular condrócitos-agarose construções esquerda:. Plataforma Montada direita:. Vista explodida mostrando componentes individuais. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Alterações no conteúdo de ADN de condrócitos-agarose hidrogéis estimulada mecanicamente sob uma amplitude de deformação de compressão a 10% a 1 Hz durante 20 a 60 min (média ± SEM, n = 6/grupo). Figura 3. Alterações na síntese da matriz extracelular (colagénio e proteoglicanos) de condrócito-agarose hidrogéis mecanicamente estimulados sob amplitude de deformação à compressão a 10% a 1 Hz durante 20 a 60 min (média ± SEM, n = 6/grupo).

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

<html> O método descrito para a aplicação de estímulos mecânicos controlados de hidrogéis de agarose de células-seeded permite a investigação directa sobre os efeitos de forças de compressão dinâmica sobre o metabolismo dos condrócitos. A utilização do equipamento de teste de costume em conjunto com os anéis de retenção fornecido restrição lateral para as construções, para evitar potenciais problemas de amostra de inflexão. O uso de placas mortos ponderados carregamento garantidos pelas tripulações conjuntos garante o co...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou do equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Ham F-12 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> A colagenase </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> Protease </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbato </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> Antibióticos / antimicóticos </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada Ltd. </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypan azul </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> Reichert Brilhante-Line Hemocitômetro </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Papaína a partir do látex </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> Acetato de amónio </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Ácido Ethyldiaminetetraacetic </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Ditiotreitol </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> Baixo ponto de fusão de agarose, Tipo VII </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Tela de malha (200) Filtrar </td><td> Sigma Aldrich Ltd. </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> Mach-1 Tester micromecânico </td><td> Biomomentum Inc. </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> Carregando compressão Jig </td><td> Custom-built </td><td></td><td> Produto similar pode ser fornecida por Biomomentum Inc. </td></tr><tr><td> Falcon 24 Placa Cultura Bem </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β-Liquid Scintillation Counter </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] prolina </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] Enxofre </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

a estimulação mecânica de condrócitos-agarose hidrogéis

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

A cartilagem articular sofre de uma capacidade limitada de reparação quando danificadas por insulto mecânico ou degradada pela doença, tais como a osteoartrite. Para sanar esta deficiência, várias intervenções médicas têm sido desenvolvidos. Um tal método é a ressurgir a área danificada com o tecido de cartilagem artificial, no entanto, a engenharia de tecidos tipicamente não tem as propriedades bioquímicas e durabilidade da cartilagem nativa, questionar a sua sobrevivência a longo prazo. Isto limita a aplicação de engenharia de tecidos de cartilagem para a reparação de pequenos defeitos focais, baseando-se o tecido circundante para proteger o material implantado. Para melhorar as propriedades do tecido desenvolvido, estimulação mecânica é um método popular utilizado para aumentar a síntese de matriz extracelular cartilaginosa, assim como as propriedades mecânicas dos resultantes da engenharia de tecidos. Estimulação mecânica aplica forças ao tecido constrói análoga àquelas experimentadas in vivo. Estebaseia-se na premissa de que o ambiente mecânico, em parte, regula o desenvolvimento e manutenção de 1,2 tecido nativo. A forma mais vulgarmente aplicado de estimulação mecânica na engenharia de tecidos de cartilagem é de compressão dinâmica em estirpes fisiológicas de aproximadamente 5-20%, com uma frequência de 1 Hz 1,3. Vários estudos investigaram os efeitos de compressão dinâmica e têm mostrado que para ter um efeito positivo sobre o metabolismo dos condrócitos e a biossíntese, em última análise afectar as propriedades funcionais do tecido desenvolvido 4-8. Neste artigo, vamos ilustrar o método para estimular mecanicamente construções condrócitos-agarose hidrogel sob compressão dinâmica e analisar as alterações na biossíntese através de testes bioquímicos e radioisótopo. Este método também pode ser facilmente modificado para avaliar as alterações potencialmente induzidos em resposta celular, como resultado de estímulos mecânicos.

A biossíntese da matriz extracelular cartilaginosa por condrócitos podem ser afectadas pela aplicação de estímulos mecânicos. Este método descreve a técnica de aplicação de dinâmicas tensões compressivas para condrócitos encapsulados em construções em 3D e de avaliação de alterações induzidas no metabolismo dos condrócitos.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

A cartilagem articular apresenta uma capacidade de reparação limitada quando danificada por insulto mecânico ou degradada por doenças, como a osteoartrite. Para remediar...

O objetivo geral deste procedimento é aplicar uma carga compressiva mecânica dinâmica a hidrogéis semeados com células. Para isso, células primárias são obtidas por meio de dissecação e digestão enzimática de fatias de cartilagem. As células isoladas são encapsuladas em um hidrogel de agarose a 2%, e construtos semeados com células são criados utilizando um furador de biópsia.As amostras são então colocadas no dispositivo de carga compressiva e inseridas em um estimulador micro-mecânico mach one. A carga compressiva dinâmica é então aplicada a constructos semeados com células para avaliar a síntese de colágeno e proteoglicanos. Os constructos são marcados com radioisótopos após a incubação incorporada.Os isótopos são quantificados por contagem de cintilação dos dados resultantes, que são normalizados em relação ao DNA. O conteúdo mostra alterações na síntese da matriz extracelular após estimulação mecânica. Embora este método possa fornecer informações sobre a resposta em locais contralaterais e estimulação mecânica.Também pode ser aplicado a outros sistemas, como células-tronco, outros tecidos conjuntivos ou células mecanorreceptoras. As articulações metacarpofalângicas de vacas a

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JoVE Journal

Biology

Biologia

Um sistema 3D de condrócitos articular humana cultivo em altos níveis de líquido sinovial é descrita. Líquido sinovial reflete o microambiente mais natural para a cartilagem articular, e pode ser facilmente obtido e armazenado. Esse sistema, portanto, pode ser usado para estudar a regeneração da cartilagem e para terapêutica de triagem para tratamento da artrite.

Um Sistema de 3D para condrócitos Cultivar Humanos Articular no líquido sinovial

Nós projetamos um novo biorreator carga mecânica que pode aplicar uniaxial ou biaxial de tensão mecânica para um biocomposite cartilagem antes do transplante em um defeito da cartilagem articular.

Projeto de um biorreator Carregando Mecânica Biaxial para Engenharia de Tecidos

Um bioprinter foi usada para criar hidrogéis modeladas com base num molde de sacrifício. O molde foi poloxâmero backfilled hidrogel com um segundo e, em seguida eluiu-se, deixando espaços vazios que foram preenchidos com uma terceira hidrogel. Este método utiliza eluição rápida e boa capacidade de impressão de poloxamero para gerar arquiteturas complexas de biopolímeros.

Impressão de Moldes reversa Thermoresponsive para a Criação de Patterned hidrogéis de dois componentes para Cultura de Células em 3D

O reparo da cartilagem representa um desafio médico não atendido e as abordagens baseadas em células para projetar a cartilagem articular humana são uma solução promissora. Aqui, descrevemos os hidrogéis biomiméticos tridimensionais (3D) como uma ferramenta ideal para a expansão e maturação de condrócitos articulares humanos.

3D Hidrogel Andaimes para articular de condrócitos Cultura e Geração de cartilagem

Um andaime engenharia de tecidos injectáveis ​​compostas de poli (N-isopropilacrilamida), sulfato de condroitina--graft (PNIPAAm-g-CS) molecular contendo micropartículas de alginato foi preparada. A força de aderência, propriedades e inchaço na biocompatibilidade in vitro são analisadas neste estudo. As técnicas de caracterização desenvolvidos aqui podem ser aplicados a outros sistemas termogelificantes.

Síntese de termogelificantes poli (N-isopropilacrilamida) -graft-condroitina Composites Sulfato com alginato micropartículas para Engenharia de Tecidos

O estresse mecânico pode induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco, fornecendo uma abordagem terapêutica potencial para o reparo da cartilagem prejudicada. Apresentamos um protocolo para induzir a diferenciação condrogênica de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ASCs) usando gravidade centrífuga (CG). A regulação positiva de SOX9 induzida por CG resulta no desenvolvimento de fenótipos condrogênicos.

Condrogênica Diferenciação indução de células-tronco derivadas de tecido adiposo por gravidade centrífugas

Condrogênese a partir de células-tronco requer ajuste fino as condições de cultura. Aqui, apresentamos uma abordagem magnética para células de condensação, um passo essencial para iniciar chondrogenesis. Além disso, mostramos que a maturação dinâmico num biorreactor aplica estimulação mecânica para as construes celulares e aumenta a produção de matriz extracelular cartilaginosa.

3D Agregação Stem Magnetic celular e biorreator Maturação para regeneração da cartilagem

Este artigo fornece métodos detalhados para fabricar e caracterizar um dispositivo microfluídicos de actuação pneumaticamente para a compressão do condrócitos.

Uma plataforma Microfluídico para estimular condrócitos com compressão dinâmica

A terapia óssea via ossificação endocondral através da implantação de tecido cartilaginoso artificial produzido a partir de células-tronco mesenquimais tem o potencial de contornar os inconvenientes das terapias convencionais. Os hidrogéis de ácido hialurônico são eficazes na ampliação de enxertos de cartilagem uniformemente diferenciados, bem como na criação de osso integrado com vascularização entre enxertos fundidos in vivo.

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Este estudo descreve um método para produzir esferoides condrocíticos agregando células em esferoides sob condições de baixa adesão usando gravidade, seguido de cultura dos esferoides resultantes em mini-biorreatores.

Geração de esferoides a partir de vários condrócitos usando condições de baixa aderência sob gravidade e mini-biorreatores caseiros

Aprenda a aplicar carga compressiva dinâmica em condrócitos encapsulados em hidrogéis de agarose. Este método avalia a síntese de colágeno e proteoglicanos para estudos de engenharia de tecidos cartilaginosos.

A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

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