A estimulação mecânica de condrócitos-agarose Hidrogéis

O objetivo geral deste procedimento é aplicar carga compressiva mecânica dinâmica a hidrogéis semeados por células. Para isso, as células primárias são obtidas por meio da dissecção e digestão enzimática de fatias de cartilagem. As células isoladas são encapsuladas em 2% agros, hidrogel e construções semeadas por células são criadas usando um punção de biópsia.

As amostras são então colocadas na plataforma de carregamento compressivo e carregadas em um microestimulador mecânico mach one. A carga compressiva dinâmica é então aplicada a construções semeadas por células para avaliar a síntese de colágeno e proteglicano. As construções são rotuladas por rádio após a incubação incorporada.

Os isótopos são quantificados por cintilação contando os dados resultantes, que são normalizados para DNA. O conteúdo mostra mudanças na síntese da matriz extracelular após estimulação mecânica. Embora este método possa fornecer informações sobre a resposta do local do contador e a estimulação mecânica.

Também pode ser aplicado a outros sistemas, como células-tronco, outros tecidos conjuntivos ou células receptivas mecânicas. As articulações metacarpais de vacas esqueleticamente maduras usadas aqui foram obtidas de um matadouro local trabalhando em uma área de dissecação estéril. Em uma capela de fluxo laminar, coloque as fatias de cartilagem em uma placa de Petri de 100 milímetros de diâmetro contendo 20 mililitros de presuntos, F 12 contendo 0,5% de protease e incube por duas horas a 37 graus Celsius.

Após o vácuo de incubação, aspirar a solução de protease e enxaguar as fatias com a adição de presuntos. F 12 meio de cultura girando suavemente e depois aspirando. Repita isso, lave mais duas vezes após a terceira lavagem, aspire a vácuo o meio de cultura.

Adicione 20 mililitros de presuntos F 12 contendo 0,15% de colagenase A e incube os pratos durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, pipetar a suspensão celular através de um filtro de tela de 200 mesh em uma placa de Petri limpa para lavar o filtro, pipetar mais cinco mililitros de presuntos F 12, coletando o fluxo na mesma placa. Transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 50 mililitros.

Lave a placa de Petri com 10 mililitros de presuntos F 12. Em seguida, adicione a solução de lavagem ao tubo cônico. Centrifugue o tubo a 600 a 800 RCF por seis a oito minutos em temperatura ambiente.

Uma vez terminada a centrifugação, aspirar o sobrenadante tomando cuidado para não perturbar o grânulo celular. Ressuspender o pellet em 40 mililitros de meio de cultura. Centrifugar o tubo a 600 a 800 RCF durante seis a oito minutos.

Repita a aspiração, suspensão resus e centrifugação mais duas vezes para um total de três vezes antes da terceira centrifugação. Resus. Suspenda o palato por agitação e tome uma alíquota de 500 microlitros para contagem de células. Durante a terceira rotação, use um hemocitômetro e um microscópio de luz invertida para contar as células viáveis na alíquota por exclusão de azul trian.

Então, uma vez que o número de células tenha sido determinado e o terceiro spin esteja completo, aspire o snat e resus. Suspender o pellet num volume de meio de cultura com o dobro da densidade de assentamento desejada. Aqui, os condrócitos são ressuspensos em 20 vezes 10 elevado a sextas células por mililitro.

O próximo passo do procedimento é encapsular os condrócitos articulares primários isolados em um hidrogel de aros em um béquer para suspender 0,8 gramas de aros. Em 20 mililitros de PBS estéril. Coloque o copo em uma placa quente regulada para 120 graus Celsius assim que o aros se dissolver.

Abaixe o fogo para 60 graus Celsius em um tubo cônico de 50 mililitros. Combine volumes iguais da suspensão de células com o dobro da concentração desejada da solução de aro aquecida. Aqui, cinco mililitros de suspensão celular são adicionados a cinco mililitros de suspensão 4%agro para uma mistura final de hidrogel 2%Agros completamente pipetada, evitando a criação de grandes bolhas que podem afetar a viabilidade celular.

Em seguida, cuidadosamente Eloqua 10 mililitros da mistura de condrócitos agros em uma placa de Petri de 60 milímetros de diâmetro. Mais uma vez, evitando a criação de grandes bolhas. Cubra o prato com a tampa.

Em seguida, deixe a mistura repousar por 30 minutos em temperatura ambiente. Uma vez que a mistura tenha solidificado, use um punção de biópsia de quatro milímetros para obter o maior número possível de amostras de hidrogel de clorocitos agros. Normalmente, isso equivale a 20 a 30.

Coloque as amostras em uma placa de Petri limpa usando uma medida micrométrica e registre o diâmetro e a altura de cada amostra. Idealmente, a construção deve ter aproximadamente cinco milímetros de altura, descarte todas as amostras obtidas de uma região onde a altura da amostra seja maior que 2%Transfira as amostras para uma placa de Petri fresca de 60 milímetros contendo 10 milímetros de meio completo. Nesta parte do protocolo, as construções assentadas nas células serão estimuladas mecanicamente por compressão dinâmica.

Isso será feito usando um equipamento de compressão personalizado que acopla mecanicamente os PLAs de carregamento de construção a um sistema micromecânico simulado, que controla a quantidade de compressão aplicada às construções. O aspecto mais difícil do procedimento é carregar amostras na plataforma de compressão. É importante ajustar adequadamente as placas na plataforma para garantir a aplicação apropriada de carga compressiva dinâmica.

Antes de usar, esterilize os componentes metálicos do equipamento de compressão em uma autoclave. Esterilize os componentes plásticos com etanol 70% durante a noite e luz ultravioleta por pelo menos 15 minutos. Para evitar que as construções de hidrogel aros de condrócitos caiam.

Use uma pinça para colocar 12 anéis de retenção de plástico estéril nos poços de uma placa de cultura de 24 poços. Os diâmetros internos dos anéis de retenção devem ser maiores que os diâmetros de construção. Usando cuidadosamente uma pinça.

Transfira os hidrogéis de condro aros da placa de Petri para a placa de 24 poços, prendendo cada um em um anel de retenção. Transfira 400 microlitros de meio completo para cada amostra. Bem, em seguida, monte o equipamento de compressão esterilizado e, usando parafusos de fixação, prenda os PLAs.

Conecte o equipamento de compressão à placa de cultura de 24 poços para estabelecer a liberação de contato do hidrogel e refixá-lo. A deformação da construção dos parafusos de fixação será aplicada a este estado de referência sem carga ou estado de deformação zero. Carregue o equipamento de compressão montado em um sistema de teste micromecânico Mach um com o pino de localização.

Prenda o equipamento ao estágio vertical e, em seguida, usando um parafuso de fixação, trave-o no lugar. Remova o gabarito de espaçamento. Use a interface do software Mach one para definir a frequência para um hertz, a amplitude para 350 mícrons e o número de ciclos para 1.200.

Isso aplica carga compressiva dinâmica a 10% de amplitude de deformação com base na altura original das amostras. Para iniciar a estimulação mecânica, pressione o botão Iniciar, o atuador mach one. O dispositivo de carregamento que se conecta à placa de cultura tem seis recuos que se movem para cima e para baixo, estimulando seis amostras simultaneamente.

As amostras de controle não estimuladas também estão na mesma placa de cultura, mas não são colocadas nos poços que possuem as reentrâncias. Quando a execução estiver concluída, o mach um emitirá um bipe e o atuador se moverá para o estado de referência descarregado. Após a conclusão da estimulação mecânica, substitua o gabarito de espaçamento.

Afrouxe o parafuso de fixação do pino de localização e remova o equipamento de compressão e a placa de cultura do sistema de teste ao lado da etiqueta de rádio, as construções de hidrogel celular pipetam cinco micro curies de etiqueta de proteína Tritium Prolene para a síntese de colágeno específico de condrócitos e enxofre S 35 para síntese de proteoglicanos em cada um, incube bem as construções marcadas com rádio por 24 horas a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono para colher as construções de hidrogel marcadas com rádio. Use uma pinça para enxaguar cada construção de hidrogel três vezes por imersão em PBS. Para remover qualquer isótopo não incorporado, coloque a construção enxaguada em um tubo de 1,5 mililitro.

Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de pape aos tubos de 1,5 mililitro. Coloque-os em um bloco de aquecimento e deixe-os digerir a 65 graus Celsius por 72 horas. Uma vez que o resumo é concluído, a amostra deve parecer relativamente clara.

Imediatamente após a digestão do pape, pegue alíquotas de 100 microlitros de cada amostra para determinar o conteúdo de DNA usando o ensaio pico green D. Em seguida, tomar uma alíquota de 100 microlitros de cada amostra para determinar a atividade dos isótopos incorporados por contagem de cintilação líquida beta. A atividade isotópica resultante deve então ser normalizada para o conteúdo de DNA para análise.

Construções de hidrogel de aros de condrócitos articulares bovinos compostas por 2%aros com 10 vezes 10 elevado ao sexto. Células por mililitro de células encapsuladas foram estimuladas mecanicamente a uma amplitude de 10% de tensão compressiva a uma frequência de um hertz por 20 a 60 minutos, ou 1.200 a 3.600 ciclos. Eles foram então testados para conteúdo de DNA e síntese de matriz extracelular por incorporação de radioisótopos.

Como pode ser visto aqui, a síntese de DNA e matriz extracelular foi afetada de maneira dose-dependente. O conteúdo de DNA exibiu uma diminuição significativa de 35% como resultado de 20 ou 30 minutos de estimulação com um valor de p inferior a 0,01; 60 minutos de estimulação não exibiram efeito. A síntese de colágeno e proteoglicano específico da cartilagem foi determinada pela incorporação de trítio, prolina e enxofre S 35, respectivamente.

Estes exibiram aumentos significativos de aproximadamente 60% em resposta a 20 ou 30 minutos de estimulação com um valor de p inferior a 0,01 60 minutos de estimulação não exibiram um efeito observável. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estimular mecanicamente as culturas de hidrogel usando impressão dinâmica e adaptar este protocolo para uso em aplicações semelhantes.