Name: Extracção do Tissue Antigens para Ensaios Funcionais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a extrair antígenos de tecido humano para ensaios funcionais de células T usando homogeneização em BAW e liofilização. Este método livre de solventes tóxicos permite medir proliferação e secreção de citocinas com segurança.

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Este trabalho é apoiado por concessões do Australian Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho (NHMRC # 559007) eo Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) e do Sistema de Infra-estrutura Operacional do Governo de Victoria. Agradecemos aos membros da Islet Mandel Tom Programa de Transplante Equipe Isolamento Islet para a prestação dos tecidos humanos. Tecidos humanos foram coletadas e utilizadas com aprovação ética local (Hospital São Vicente HREC-A 011/04 e de Saúde de São Vicente HREC-A 135/08).

1. Preparando tecido do baço <ol><li> Nota-todo o material humano devem ser tratados como potencialmente infecciosos e todos os procedimentos devem ser realizados em uma Capela Fluxo Laminar Classe II. Usando tesouras e pinças esterilizadas, remover gordura e tecido fibroso de seções do baço (~ 1-2 cm de tamanho) e retire o máximo de material da cápsula externa possível. </li><li> Corte um pedaço pequeno (1-2 cm 3) de tecido do baço e colocar cada peça em um tubo de 50 ml estéril Falcon. </li><li> Snap-congelar os pedaços de tecido por imersão em N2 líquido. </li><li> Armazenar a -80 ° C. Um protocolo similar é adequado para qualquer outro tecido (s). </li></ol> 2. Preparando Islet Humanos para Armazenamento <ol><li> Ilhotas Cultura na mídia CMRL. Colete ilhotas num tubo de 10 ml de fundo cónico e lavar duas vezes em PBS por centrifugação a 1500 rpm durante 5 min. Decantar a PBS e drenar o tampão residual colocando o tubo invertido brevemente sobre uma toalha de papel. Tenha cuidado para nãopara desalojar as ilhotas. </li><li> Uma vez drenada, re-cap o tubo e encaixe-congelamento em nitrogênio líquido e armazenar a -80 ° C. </li></ol> 3. Preparando Extrato <ol><li> Prepare BAW mix (10:30:60% v / v) e armazenar a 4 ° C. </li><li> Remover o tubo de -80 ° C. Descongelar à temperatura ambiente. </li><li> Adicionar BAW gelado suficiente para cobrir a peça de tecido. Para usar ilhotas 3-5 ml. Para o tecido do baço usar 10-20 ml, dependendo do tamanho do pedaço de tecido. </li><li> Montar o homogeneizador de tecidos. Limpar por &quot;homogeneização&quot; 10-20 ml de etanol a 70% / água. </li><li> Homogeneizar o tecido em explosões múltiplas, após a colocação da sonda para o tubo homogeneizador com o tecido e solução BAW. Manter o tubo em um balde de gelo depois. </li><li> Limpar completamente o homogeneizador entre amostras, por homogeneização de 10-20 ml de etanol a 70% / água e depois de tampão BAW. Isto impede a contaminação cruzada de tecido entre samples.Dismantleand limpa com etanol a 70% / água depois de nóse. </li><li> Se um extracto contendo apenas material solúvel é necessário, centrifugar extracto de tecido homogeneizado a 4000 rpm à temperatura ambiente durante 10 min. Se um extracto bruto é mais necessário, girar a 1000 rpm à temperatura ambiente durante 5 min. A técnica mais apropriada para extrair as proteínas insolúveis em BAW depende da análise a jusante das proteínas. Para utilização em ensaios imunológicos funcionais sugerimos tentar dissolver a fracção insolúvel em ureia 8 M, como já anteriormente foi encontrado que este seja bem tolerada 6. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo limpo e colocá-lo em gelo. </li><li> Determinar a concentração de proteína no extracto utilizando um ensaio BCA ou similar. </li></ol> 4. Congelar Extractos de secagem <ol><li> Dependendo da massa da proteína desejada (isto é, 100 mg por tubo), dilui-se o homogenato em conformidade e dispensar em alíquotas rotulado 5,0 ml estéril, Falcon (12x75 mm) de tubos. Nós freqüentemente usar 100 mg / tubo. </li><li> Use um 18-20 calibre da agulha de seringa estéril para produzir 3 furos na tampa de cada tubo. </li><li> Congelar tubos ou colocando-os em gelo seco durante ~ 10 min ou no congelador a -80 ° C durante&gt; 1 hora. Loja a -80 ° C até que esteja pronto para colocar no liofilizador. </li><li> Ligue liofilizador e deixar equilibrar (-100 ° C). Isto demora cerca de 30 min. </li><li> Dependendo do volume, a liofilização pode ser concluída dentro de 3 horas, mas nós rotineiramente deixar nossas amostras durante a noite. </li><li> Após a conclusão do ciclo de secagem, desligar a bomba de vácuo e, lentamente, permitir que a pressão dentro da câmara. Remover rack. </li><li> Em um capuz estéril, remover as tampas dos tubos perfurados e substituir por novos (Falcon 352,032). </li><li> Tubos de armazenar a -20 ° C. As amostras podem ser reconstituídos num meio de cultura, ou outros tampões, e usado em ensaios bioquímicos ou função. </li></ol> 5. Resultados representativos A Figura 1 mostra a coloração de uma proteínagel carregado com extracto de tecido do baço e ilhéus pancreáticos empobrecido (rotulado acinar) e purificado ilhéus humanos (ilhotas marcadas). Os resultados mostram uma boa representação de proteínas de peso molecular diferente para cada tecido. A capacidade dos extractos de tecidos para estimular a proliferação de células T humanas foi testado utilizando um ensaio de proliferação CFSE baseado 7 (Figura 2). O PBMC utilizado neste ensaio foram isoladas de um indivíduo com diabetes tipo 1. A magnitude da resposta é expressa como a razão entre o número de células CFSE dim por 5000 células CD4 +, brilhantes, sem antigénio CFSE: de células CFSE dim 5000 por células T CD4 +, células CFSE luminosos com antigénio a partir de amostras triplicadas 7. Os resultados mostram uma fraca, mas a proliferação, detectável em resposta à acinar (CD1 = 3,5) e uma resposta mais forte ao ilhota extracto (6.8). Vírus influenza inactivado (CDI = 142,6) é incluído como umcontrolo positivo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> Figura 1. Gel Protein. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> Figura 2. Resultados de um ensaio de proliferação CFSE baseado contra acinar e extrato de ilhotas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo foi desenvolvido porque queríamos gerar um extrato de tecido humano que estava livre de produtos químicos tóxicos como detergentes. Especificamente utilizou-se para preparar os extractos de tecido humano que podem ser utilizados em ensaios de função imunitária humana, in vitro. Extractos preparados utilizando este protocolo pode igualmente ser reconstituída em qualquer tampão e usados ​​para muitas análises bioquímicas, tais como cromatografia de Western blotting ou líquido. Isto faz com...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm tubos de polistireno estéreis </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Tampas para tubos de tubos de poliestireno (acima) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml tubos estéreis </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrila </td><td> Chemicals Mallinckradt </td><td> 2856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogeneizador: PRO200 </td><td> Bio-estratégia </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm gerador de dente de serra </td></tr><tr><td> Liofilizador </td><td></td><td></td><td> Virtis, bancada 4K </td></tr><tr><td> Agulha estéril calibre 18-20 </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Meio </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabela 1. Reagentes específicos e de equipamento.

extracção do tissue antigens para ensaios funcionais

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Muitos dos alvos de antigénio de resposta imune adaptativa, reconhecidos por células T e B, não foram definidas 1. Isto é particularmente verdadeiro em doenças auto-imunes e cancro 2. O nosso objectivo é o de investigar os antigénios reconhecidos pelas células T humanas do tipo de doença auto-imune uma diabetes 1,3,4,5. Para a análise de células T humanas respostas contra o tecido, onde os antigénios reconhecidos pelas células T são identificadas não foi desenvolvido um método para extrair os antigénios de proteína a partir de tecido humano, em um formato que é compatível com ensaios funcionais 6. Respostas previamente, de células T para extractos de tecido não purificados não puderam ser medidos por métodos de extracção de produzir um lisado que continha detergentes que foram tóxicas para as células mononucleares do sangue periférico. Aqui descrevemos um protocolo para a extracção de proteínas a partir de tecidos humanos, em um formato que não é tóxico para as células T humanas. O tecido é homogeneizado numa mistura de butan-1-ol, acetonitrilo e water (BAW). A concentração de proteína no extracto de tecido é medida e uma massa conhecida de proteína é separado em alíquotas para tubos. Depois da extracção, os solventes orgânicos são removidos por meio de liofilização. Extractos de tecidos liofilizados podem ser armazenados até serem necessários. Para utilização em ensaios da função imune, uma suspensão de células do sistema imunológico, em meios de cultura apropriados, podem ser adicionados directamente ao extracto liofilizado. A produção de citocinas e a proliferação de PBMC em resposta a extractos preparados utilizando este método, foram facilmente medido. Por isso, o nosso método permite a preparação rápida de lisados ​​de tecido humano que podem ser utilizados como uma fonte de antigénios na análise de respostas de células T. Sugerimos que este método irá facilitar a análise das respostas imunes adaptativas para os tecidos em transplantes, cancro e auto-imunidade.

Um protocolo simples para a preparação de extractos de tecido humano para ser usado como uma fonte de antigénios de células T funcionais de ensaios está descrito. Este método permite a respostas das células T aos antigénios derivados de tecido a ser medido<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extracção do Tissue Antigens para Ensaios Funcionais

Muitos dos alvos antigênicos da resposta imune adaptativa, reconhecidos por células B e T, ainda não foram definidos 1. Isso é particularmente verdadeiro em doenças autoimunes...

O objetivo geral deste procedimento é preparar um extrato tecidual compatível com ensaios imunológicos funcionais. Isso é realizado primeiramente coletando uma amostra do tecido de interesse. Em seguida, homogeneíza-se a amostra tecidual em uma mistura de butanol, acetonitrila e água, ou BAW.Após determinar a concentração proteica, o extrato é distribuído e liofilizado para remover os solventes. Por fim, o extrato reconstituído é utilizado como fonte de antígeno em ensaios de proliferação de linfócitos T humanos ou de secreção de citocinas. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a lise com detergentes, é que o extrato obtido está livre de solventes tóxicos e detergentes.Neste protocolo, todos os materiais humanos devem ser tratados como potencialmente infecciosos, e todos os procedimentos devem ser realizados em uma cabine de fluxo laminar classe dois. Usando tesoura e pinça estéreis, remova a gordura e o tecido fibroso de seções do baço com cerca de um a dois centímetros de tamanho. Retire o máximo possível do tecido da cápsula externa.Corte pequenos pedaços de tecido esplênico e coloque cada pedaço em um tubo estéril tipo Falcon de 50 mililitro

extraction-of-tissue-antigens-for-functional-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um protocolo para a preparação de robusta, extratos de pequena escala HeLa nucleares é descrito. Este protocolo é valiosa para os ensaios que requerem o uso de pequenas populações de células, tais como as células tratadas com fármacos ou RNAi. O método deve ser aplicável a uma ampla variedade de ensaios de expressão génica e outros tipos celulares, incluindo células do paciente.

Os pequenos extratos nucleares para ensaios funcionais da expressão gênica Machineries

Este vídeo demonstra o uso do ensaio ELISpot para avaliar a função das células B secretoras de anticorpos, ASCs. Os anticorpos secretados pelas ASCs interagem com os fragmentos de anticorpos policlonais ligados à membrana, que são detectados pelos anticorpos IgG ou IgM conjugados com enzimas. A mancha colorida produzida em cada poço indica a presença do isotipo do anticorpo específico, que se correlaciona com a atividade secretora das células B.

Avaliação funcional de células B secretoras de anticorpos usando o ensaio ELISpot

Apresentamos aqui um protocolo otimizado e detalhado para imunocoloração dupla em seções de tecido do sistema nervoso central (SNC) e linfonodo periférico (LN) de rato fixado em formalina e embebido em parafina.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

A pesquisa translacional do câncer depende da extração de tecidos humanos. Muito trabalho foi feito para otimizar os métodos de extração para análise ex vivo. Aqui, descrevemos os métodos de processamento de tecidos que permitem a saída máxima de dados de amostras limitadas.

Trabalhando com tecidos humanos para Translational Cancer Research

Um método simples, mas eficaz, que emprega nanopartículas magnéticas para detectar e enriquecer as células B antígeno-reativa para análise funcional e fenotípica é descrito.

Detecção e enriquecimento da Rare células B antígeno-específica para a análise do fenótipo e função

Aqui, descrevemos um método que combina em situ MHC-tetrâmero coloração com imuno-histoquímica para determinar a localização, fenótipo e a quantidade de pilhas de T antígeno-específicos nos tecidos. Este protocolo é usado para determinar as características espaciais e fenotípicas de células T CD8 de antígeno-específicas em relação a outro tipo de célula e estruturas nos tecidos.

In Situ MHC-tetrâmero manchando e análise quantitativa para determinar a localização, abundância e fenótipo de células T de CD8 antígeno-específicas em tecidos

Incompatibilidades em sequências de antigénios (HLA) leucocitário humano entre doador e beneficiários pares são a principal causa de rejeição mediada por anticorpo em transplante de órgãos. Aqui nós apresentamos o uso de matrizes de antígeno personalizado com base em sequências HLA dos doadores individuais para sondar aloanticorpos HLA antidoadores em receptores de órgãos.

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

Descrevemos um método de coloração rápida para realizar imagens multiespectrais em tecidos congelados.

Um método rápido para imagem de fluorescência multiespectral de seções de tecido congelado

Os imunoensaios baseados no sangue total fornecem uma ferramenta fácil e eficiente em termos de recursos para analisar a imunidade específica do antígeno para fins de diagnóstico e pesquisa. Este artigo fornece um protocolo otimizado baseado em sangue total com co-estimulação dupla para análise abrangente da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais, incluindo uma versão de baixo volume para pacientes pediátricos e pequenos animais.

Ensaio de sangue total com coestimulação dupla para análise específica do antígeno da imunidade do hospedeiro a patógenos fúngicos e virais

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Aprenda a extrair antígenos de tecido humano para ensaios funcionais de células T usando homogeneização em BAW e liofilização. Este método livre de solventes tóxicos permite medir proliferação e secreção de citocinas com segurança.

Extracção do Tissue Antigens para Ensaios Funcionais

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