Medição dos Efeitos de anticorpos sobre a função celular de cardiomiócitos isolados

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar os anticorpos cardiotrópicos no plasma de pacientes com cardiomiopatia dilatada ou outras doenças cardíacas com fundo autoimune. Isso é obtido por uma mini imunoabsorção inicial do plasma do paciente em colunas de esferas anti-IgG para purificar a imunoglobulina G como uma segunda etapa. Os cardiomiócitos ventriculares são isolados de ratos wistar adultos, fornecendo a base celular para este bioensaio.

Em seguida, os cardiomiócitos são deixados fixos nas lamínulas da câmara e corados com URA 2:00 AM para permitir a observação do transiente de cálcio intracelular durante as contrações, então a IgG do paciente é testada para observar seu efeito na contratilidade do cardiomiócito. Os resultados demonstram se a IgG de um paciente contém anticorpos trópicos com base nas alterações na contratilidade e transitório de cálcio nos cardiomiócitos isolados. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os imunoensaios padrão para a detecção de anticorpos, é que ela é independente de um antígeno específico e permite discriminar entre anticorpos estimulantes e bloqueadores.

Demonstrando o procedimento será bera Google e experiência assistência técnica do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare as mini colunas de imunoabsorção enchendo três mililitros, esferas anti-IgG por dois mililitros de plasma EDTA do paciente em uma coluna econopak vazia. Em seguida, coloque um filtro em cima dos esferos anti-IgG.

Abra a ponta inferior da coluna e pressione o filtro para atingir uma vazão de aproximadamente uma gota por segundo. Em seguida, lave a coluna três vezes com um volume de plasma de cloreto de sódio a 0,9% de pipeta de cloreto de sódio o plasma na coluna quando o plasma estiver completamente imerso na lavagem anti-IgG Spheros com o mesmo volume de cloreto de sódio a 0,9%. Em seguida, pipetar um volume plasmático de cloridrato de glicina 0,2 molar a pH 2,8 na coluna e deixá-lo mergulhar no fos.

Em seguida, adicione outro volume de cloridrato de glicina à coluna. Coletar o fluxo em um tubo de 15 mililitros e ajustar o pH para 7,3 com cloridrato de tris 0,5 molar em p pH 8,0 para regenerar a coluna. Lave-o com três volumes de plasma de cloridrato de glicina após uma lavagem final com dois volumes de cloreto de sódio a 0,9%.

A coluna pode ser utilizada para a amostra de plasma seguinte para utilização em cardiomiócitos. A fração de IgG coletada deve ser dialisada contra o tampão experimental, enchendo primeiro a fração de IgG em um tubo de membrana de diálise de éster de celulose com um limite de peso molecular em 100 kilodaltons. Em seguida, coloque o tubo em um litro EB e mexa lentamente com uma agitação magnética a quatro graus Celsius Após oito horas, transfira o tubo de diálise para três litros de EB fresco e dialisado por mais 20 horas a quatro graus Celsius após a diálise.

Ferva a amostra por 30 minutos a 57 graus Celsius em banho-maria. Para inactivar os factores do complemento, determinar a concentração total de IgG e preparar alíquotas contendo cada uma 330 microgramas de IgG. Neste procedimento, prepare o tampão de isolamento livre de cálcio de acordo com o manuscrito que acompanha.

Em seguida, encha 80 mililitros de IB no reservatório superior de um sistema de perfusão termostato lanor e mantenha o tampão a 37 graus Celsius e areje-o com 95% de oxigênio, 5% de dióxido de carbono por 30 minutos. Dissolver aproximadamente 7.000 a 10.000 unidades de colagenase tipo dois e 174 miligramas de BSA livre de ácidos graxos em 20 mililitros. IB contendo cloreto de cálcio 112,5 micromolares e ajustar o pH do tampão de isolamento no reservatório superior, se necessário.

Em seguida, anestesiar um rato wistar de 175 a 200 gramas usando tiopental a 375 microgramas por quilograma com 2.500 UI de heparina adicionada à solução de tiopental. Após a toracotomia, excise o coração cuidadosamente com um arco aórtico intacto e transfira-o para cloreto de sódio gelado a zero vírgula em cloreto de sódio gelado. Remova o sangue e o tecido circundante do coração.

Em seguida, transfira-o para cloreto de sódio fresco a 0,9% e exponha a aorta. Ligue o redutor de fluxo do sistema de langor para obter uma velocidade de queda de dois a três por segundo. Em seguida, conecte o coração à cânula.

Perfunda-o por até três minutos com uma taxa de fluxo de uma gota por segundo para lavar o sangue restante. Depois disso, circule o IB no sistema LOR. Agora remova o tampão de 20 mililitros do reservatório superior.

Encha o reservatório com a solução de colagenase e reabasteça o tampão necessário para atingir 80 mililitros. Em seguida, circule a solução de digestão por mais 27 minutos. Em seguida, retire o coração da cânula.

Remova os átrios e a aorta e, em seguida, corte os ventrículos em pedaços pequenos. Deixe o tampão de digestão escorrer para o reservatório inferior. Reduza o volume para um máximo de 40 mililitros para digerir ainda mais os ventrículos picados por 10 a 15 minutos sob a aeração contínua com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.

Em seguida, filtre a suspensão celular através de uma gaze de malha de 200 mícrons em um tubo de 50 mililitros. Por último, restabelecer o teor de cálcio das células centrifugando a suspensão celular a 40 3G durante dois minutos. À temperatura ambiente, ressuspenda as células em 10 mililitros.

IB contendo cloreto de cálcio 200 micromolares centrifugue novamente e ressuspenda as células em 10 mililitros. IB com cloreto de cálcio 500 micromolar. Após uma centrifugação final, resus, suspenda os cardiomiócitos em EB filtrada estéril a uma densidade de 50.000 células por mililitro.

Cubra as lamínulas em uma câmara de quatro poços com 10 microgramas de laminina por alvéolo e espere até que esteja totalmente seca. Em seguida, encha um mililitro da suspensão de cardiomiócitos em cada poço. Usando uma micropipeta com ponta cortada e deixe as células aderirem por uma hora em temperatura ambiente, dilua 10 microlitros da solução estoque de um miligrama por mililitro fira 2:00 AM em cinco mililitros, eb, e mantenha a solução de coloração no escuro.

Em seguida, remova o tampão e as células soltas das lamínulas pipeta 0,5 mililitros da solução de coloração. Em cada um, incube bem as células por 10 minutos sob agitação moderada. Em seguida, remova a solução de coloração e lave as células uma vez com um mililitro eb.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros EB a cada poço neste procedimento, coloque a lamínula sob um microscópio de fluorescência inversa conectado a um sistema de registro de cálcio e contratilidade de miócitos. Posicione um eletrodo feito sob medida com um tubo de influxo e influxo no primeiro poço e super. Funda os cardiomiócitos com um mililitro por minuto eb.

Comece a estimulação elétrica a 20 volts, um hertz e cinco milissegundos de duração por pulso, e permita que as células se adaptem à estimulação por cerca de dois minutos. Escolha um cardiomiócito intacto em forma de bastonete com estrias claras e contração constante e posicione-o no centro do campo visual. Em seguida, abra o canal da câmera e oriente a célula horizontalmente dentro da área de vídeo girando o adaptador de enquadramento da célula e movendo a platina do microscópio.

Ajuste o limite dos elementos de controle de detecção da área de vídeo. Ligue o canal fluorescente e registre de 10 a 15 contrações para obter o encurtamento celular inicial e o transiente de cálcio. Depois disso, desligue o canal de luz do microscópio para evitar o branqueamento da mancha fluorescente.

Mude o fluxo de EB para o bypass de amostra com uma válvula de três vias e superfunda os cardiomiócitos com um mililitro de IgG do paciente. Pare a bomba pouco antes de o ar atingir o, ligue o canal de luz e registre outras 10 a 15 contrações para obter a resposta celular aguda. Em seguida, pause a gravação e desligue o canal de luz novamente, repita as gravações após dois e cinco minutos e retire o eletrodo do poço quando terminarem no final, analise o encurtamento celular e o transiente de cálcio com o software do assistente de íons usando o comprimento da barra do comprimento da borda e a janela de taxa de barra subtraída numérica URA, respectivamente.

Em seguida, calcule as alterações percentuais para as respostas agudas, de dois e cinco minutos do encurtamento celular inicial e da altura do pico transitório de cálcio. Aqui está um exemplo representativo da medição de controle. O encurtamento celular e o transiente de cálcio foram monitorados on-line antes da superfusão com IgG e imediatamente dois minutos e cinco minutos após a superfusão com IgG.

E aqui está um exemplo da medição de uma amostra de IgG contendo anticorpos cardiodepressivos. O encurtamento celular e o transiente de cálcio foram medidos on-line antes da superfusão com IgG e imediatamente dois minutos e cinco minutos após a superfusão com IgG. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como detectar anticorpos de tráfego cardiovascular no plasma do paciente, medindo o efeito da IgG isolada no encurtamento celular no transiente de cálcio de cardiomiócitos vermelhos adultos isolados.