Medição dos Efeitos de anticorpos sobre a função celular de cardiomiócitos isolados

O objetivo geral do experimento a seguir é detectar anticorpos cardiotrópicos no plasma de pacientes com miocardiopatia dilatada ou outras doenças cardíacas de origem autoimune. Isso é alcançado por uma imunoabsorção inicial em miniatura do plasma do paciente em colunas de esferos com anticorpos anti-IgG, para purificar a imunoglobulina G como segundo passo. Cardiomiócitos ventriculares são isolados de ratos Wistar adultos, fornecendo a base celular para este bioensaio.

Em seguida, permite-se que os cardiomiócitos aderem às lamínulas de câmara e são corados com URA 2:00 AM para permitir a observação do transiente intracelular de cálcio durante as contrações; então, o IgG do paciente é testado para observar seu efeito na contratilidade dos cardiomiócitos. Os resultados demonstram se o IgG de um paciente contém anticorpos trópicos com base nas alterações na contratilidade e no transiente de cálcio nos cardiomiócitos isolados. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como os imunoensaios padrão para detecção de anticorpos, é que ela é independente de um antígeno específico e permite discriminar entre anticorpos estimulantes e bloqueadores.

Para demonstrar o procedimento, bera Google e receberá assistência técnica do nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, prepare as colunas de imunoabsorção miniatura preenchendo três mililitros de esferas anti-IgG por cada dois mililitros de plasma de paciente com EDTA em uma coluna econopak vazia. Em seguida, coloque um filtro sobre as esferas anti-IgG.

Corte a ponta inferior da coluna e pressione o filtro para atingir uma vazão de aproximadamente uma gota por segundo. Em seguida, lave a coluna três vezes com um volume de plasma de cloreto de sódio 0,9%, pipetando o plasma na coluna quando o plasma tiver imerso completamente no anti IgG Spheros, e lave com o mesmo volume de cloreto de sódio 0,9%. A seguir, pipete um volume de plasma de glicina cloreto 0,2 molar com pH 2,8 na coluna e deixe-o imergir no fósforo.

Em seguida, adicione outro volume de cloreto de glicina à coluna. Colete o fluxo em um tubo de 15 mililitros e ajuste o pH para 7,3 com tris cloreto 0,5 molar em pH 8,0 para regenerar a coluna. Lave-a com três volumes plasmáticos de cloreto de glicina após uma lavagem final com dois volumes de cloreto de sódio 0,9%.

A coluna pode ser usada para a próxima amostra de plasma para uso em cardiomiócitos. A fração de IgG coletada deve ser diafiltrada contra o tampão experimental, preenchendo primeiro a fração de IgG em um tubo de membrana de diálise de éster de celulose com corte de peso molecular em 100 kilodaltons. Em seguida, coloque o tubo em um litro de EB e agite lentamente com um agitador magnético a quatro graus Celsius. Após oito horas, transfira o tubo de diálise para três litros de EB fresco e continue a diálise por mais 20 horas a quatro graus Celsius.

Ferva a amostra por 30 minutos a 57 graus Celsius em banho-maria. Para inativar os fatores do complemento, determine a concentração total de IgG e prepare alíquotas, cada uma contendo 330 microgramas de IgG. Neste procedimento, prepare o tampão de isolamento livre de cálcio conforme descrito no manuscrito anexo.

Em seguida, preencha 80 mililitros de IB no reservatório superior de um sistema de perfusão com termostato e mantenha o tampão a 37 graus Celsius, arejando-o com 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos. Dissolva aproximadamente 7.000 a 10.000 unidades de colagenase tipo dois e 174 miligramas de BSA livre de ácidos graxos em 20 mililitros. IB contendo cloreto de cálcio 112,5 micromolar e ajuste o pH do tampão de isolamento no reservatório superior, se necessário.

Em seguida, anestesie uma rata Wistar de 175 a 200 gramas utilizando tiopental a 375 microgramas por quilograma, com 2.500 UI de heparina adicionadas à solução de tiopental. Após a toracotomia, excise o coração cuidadosamente com o arco aórtico intacto e transfira-o para cloreto de sódio a zero vírgula zero por cento em temperatura de gelo, em cloreto de sódio gelado. Remova o sangue e os tecidos circundantes do coração.

Em seguida, transfira-o para cloreto de sódio 0,9% fresco e exponha a aorta. Ligue o redutor de fluxo do sistema langor para obter uma velocidade de gotejamento de duas a três gotas por segundo. Em seguida, fixe o coração à cânula.

Perfunda-o por até três minutos com uma taxa de fluxo de uma gota por segundo para remover o sangue remanescente. Depois disso, circule o IB no sistema LOR. Agora, remova 20 mililitros de tampão do reservatório superior.

Encha o reservatório com a solução de colagenase e reabasteça com o volume de tampão necessário para atingir 80 mililitros. Em seguida, circule a solução de digestão por mais 27 minutos. Depois, desprenda o coração da cânula.

Remova os átrios e a aorta, depois pique os ventrículos em pedaços pequenos. Deixe o tampão de digestão fluir para o reservatório inferior. Reduza o volume para um máximo de 40 mililitros para continuar a digestão dos ventrículos picados por 10 a 15 minutos sob aeracao contínua com 95%oxigênio, 5%dióxido de carbono.

Em seguida, filtre a suspensão celular através de uma malha com tamanho de poro de 200 mícrons para um tubo de 50 mililitros. Por fim, restabeleça o teor de cálcio das células por meio da centrifugação da suspensão celular a 40 3G durante dois minutos. À temperatura ambiente, re-suspenda as células em 10 mililitros.

IB contendo cloreto de cálcio 200 micromolar, centrifugue novamente e re-suspenda as células em 10 mililitros. IB com cloreto de cálcio 500 micromolar. Após uma centrifugação final, re-suspenda os cardiomiócitos em EB estéril filtrado até uma densidade de 50.000 células por mililitro.

Cubra as lamínulas em uma câmara de quatro poços com 10 microgramas de laminina por poço e aguarde até que esteja completamente seca. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão de cardiomiócitos em cada poço. Usando uma micropipeta com ponteira cortada e permita que as células adiram por uma hora à temperatura ambiente, dilua 10 microlitros da solução estoque de fira 2:00 AM a um miligrama por mililitro em cinco mililitros, eb, e mantenha a solução de coloração no escuro.

Em seguida, remova o tampão e as células não aderidas das lamínulas, pipetando 0,5 mililitros da solução corante. Em cada poço, incube as células por 10 minutos sob agitação moderada. Posteriormente, remova a solução corante e lave as células uma vez com um mililitro de EB.

Em seguida, adicione 0,5 mililitros de EB a cada poço neste procedimento, coloque a lamínula sob um microscópio de fluorescência invertido conectado a um sistema de gravação de cálcio e contratilidade de miócitos. Posicione um eletrodo personalizado com um tubo de influxo e influxo no primeiro poço e super. Fase os cardiomiócitos com um mililitro por minuto de EB.

Inicie a estimulação elétrica em 20 volts, um hertz e duração de cinco milissegundos por pulso, e permita que as células se adaptem à estimulação por cerca de dois minutos. Escolha um cardiomiócito em forma de bastonete intacto, com estriação nítida e contração constante, e posicione-o no centro do campo visual. Em seguida, abra o canal da câmera e oriente a célula horizontalmente na área de vídeo girando o adaptador de fixação da célula e movendo o estágio do microscópio.

Ajuste o limite dos elementos de controle de detecção da área de vídeo. Ligue o canal fluorescente e registre de 10 a 15 contrações para obter o encurtamento celular inicial e o transiente de cálcio. Em seguida, desligue o canal de luz do microscópio para evitar o desbotamento da coloração fluorescente.

Alterne o fluxo do EB para o desvio da amostra com uma válvula de três vias e fusione os cardiomiócitos com um mililitro de IgG do paciente. Pare a bomba pouco antes de o ar atingir o poço, ligue o canal de luz e grave por mais 10 a 15 contrações para obter a resposta celular aguda. Em seguida, pause a gravação e desligue novamente o canal de luz, repita as gravações após dois e cinco minutos e retire o eletrodo do poço quando terminarem ao final. Analise o encurtamento celular e o transitório de cálcio com o software IonWizard, utilizando respectivamente a janela de comprimento da borda dividido pelo comprimento e a janela de razão subtraída numericamente URA2.

Em seguida, calcule as variações percentuais das respostas aguda, aos dois minutos e aos cinco minutos em relação à redução celular inicial e à altura máxima do transiente de cálcio. Abaixo, tem-se um exemplo representativo da medição controle. A redução celular e o transiente de cálcio foram monitorados em tempo real antes da superfusão com IgG e imediatamente dois minutos e cinco minutos após a superfusão com IgG.

E aqui está um exemplo da medição de uma amostra de IgG contendo anticorpos cardio-depressores. O encurtamento celular e o transiente de cálcio foram medidos em tempo real antes da superfusão com IgG e imediatamente dois minutos e cinco minutos após a superfusão com IgG. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como detectar anticorpos cardio-depressores no plasma de pacientes mediante a medição do efeito da IgG isolada sobre o encurtamento celular e o transiente de cálcio em cardiomiócitos adultos isolados.