Name: Isolamento rápido de células tumorais viáveis circulantes de amostras de sangue de doentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a isolar células tumorais circulantes viáveis de amostras de sangue usando um dispositivo de microtubos funcionalizado com E-selectina. Esta técnica biomimética captura CTCs sem danificar as células, permitindo análises personalizadas para terapias oncológicas.

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O trabalho descrito foi apoiado pelo Centro de Cornell sobre o microambiente e metástases através do número Prêmio U54CA143876 do National Cancer Institute. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Câncer ou o National Institutes of Health. Este trabalho foi ainda financiado em parte por um National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).

O protocolo seguinte é para a produção de um dispositivo de microtubo único. 1. Preparação da solução de Nanotubos de haloisita <ol><li> Sonicado (10-13 W (rms)) 250 uL solução nanotubo haloisite (6,6% em peso em água) 30 seg. Solução legal com água fria e repita uma vez sonicação. Esfriar novamente. </li><li> Desenhar solução sonicada para uma seringa, anexar um filtro de seringa de 0,45 uM, e solução de filtro para dentro do tubo de microcentrífuga limpo. Solução a vórtice ocasionalmente para manter a homogeneidade. </li></ol> 2. Revestimento de superfície Microtube interno com nanotubos de haloisita <ol><li> Obter 50 cm longa seção de Micro-Renathane microtubing (300 mM de diâmetro interior, 35,3 uL de volume interno). Corte uma extremidade do microtubo de uma diagonal e inserir um pedaço pequeno adaptador IDEX. Inserir a agulha de uma seringa 3/10 cc 29G na outra extremidade do microtubo. </li><li> Para limpar o microtubo, colocar a extremidade aberta do microtubo (a extremidadecom o adaptador) em etanol 70% e draw ~ 50 uL de etanol para a seringa para encher microtubo. </li><li> Lave o etanol a partir do microtubo desenhando um volume generoso de água destilada para a seringa. </li><li> Retire a seringa do microtubo, esvaziar a seringa e volte para o microtubo. </li><li> Prepara-se uma solução de 0,02% w / v de poli-L lisina em água. Desenhar 50 uL para o microtubo e permitir a sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente (RT). </li><li> Desenhar 100 uL solução nanotubo e filtrada para o microtubo e deixa-se incubar durante 3 min a RT. </li><li> Desenhe 100 uL de água através do microtubo para lavar a solução de nanotubos. Permitir microtubo revestido para sentar, cheio de água, durante a noite à RT. </li></ol> 3. Preparação de microtubos para isolamento de células <ol><li> Prepara-se uma solução de 10 mg / g de proteína mL em fosfato de Dulbecco 1X salino tamponado (PBS, pH 7,0 - 7,2). Desenhe 50 uL PBS através microtubo e desenhe 50 mL dea solução de proteína G-e deixa-se incubar durante 1,5 h à RT. </li><li> Prepara-se uma solução contendo 5 ug / mL E-selectina-IgG e 50 anticorpo mcg / ml (anti-EpCAM para a maioria das amostras de cancro, anti-PSMA para amostras de cancro da próstata) em PBS. Desenhar 50 uL da E-selectina e solução de anticorpo para o microtubo e deixa-se incubar durante 2 horas à RT. </li><li> Adesão celular não específica é bloqueado com proteína de leite de 5%. Prepara-se uma solução de 5% (w / v) de proteína de leite em PBS. Desenhar 50 uL solução de proteína do leite no microtubo e deixa-se incubar durante 1 hora à RT. </li><li> Desenhe 50 uL de PBS em tubo e deixar à temperatura ambiente até amostras de sangue ou de buffy coat está pronto para processamento. </li><li> 10 min antes de utilizar o microtubo para o isolamento, desenhar 50 uL de PBS que foi saturada com Ca 2 + (&quot;PBS +&quot;) para activar as moléculas de selectina. </li></ol> 4. Preparação de amostras para o isolamento de células <ol><li> Desenhe ou obter 10 mL de sangue de paciente em heparinizadotubo. </li><li> Colocam-se 10 mL de Ficoll-Paque solução de isolamento de linfócitos em 50 mL tubo de centrífuga. Suavemente camada de sangue 10 mL todo em cima de Ficoll de modo a não misturar o sangue e Ficoll. </li><li> Centrifugar a 2000x g durante 15 min a 4 ° C com desaceleração mínima. </li><li> Retire a camada de revestimento buffy e coloque em novo tubo. </li><li> Buffy coat lavagem com PBS (centrifugue a 230x g durante 10 min, descartar o sobrenadante). </li><li> Suavemente ressuspender as células com 1 mL de tampão de lise de RBC e incubar durante 10 min a RT para lisar os eritrócitos. </li><li> Adicionar 10 ml de PBS, misturar suavemente, e centrifugue a 230x g durante 10 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento suavemente em 3 a 4 ml de PBS +. </li></ol> 5. Isolamento das células <ol><li> Anexar uma extremidade do microtubo funcionalizado a uma seringa de 5 ml usando adaptadores IDEX. </li><li> Inserir a seringa para uma bomba de seringa. </li><li> Submergir a extremidade aberta do microtubo funcionalizado para dentro da célula suspension. </li><li> Processar a suspensão de células através do microtubo de 1 a 4 mL / h. </li><li> Transferir a extremidade aberta do microtubo a um tubo contendo PBS + e desenhar 300 + PBS uL em seringa a 0,016 ml / min para remover as células não ligado e fracamente ligados do microtubo. </li><li> Coloque a extremidade aberta do microtubo para um tubo limpo. Desconecte a seringa do microtubo e anexar uma seringa pré-cheia com Accutase. Suavemente perfundir Accutase suficiente para o microtubo para preencher (~ uL 50) e permitir que a incubar à temperatura ambiente durante 10 min. </li><li> Anexar um seringa pré-carregada com 1 mL de meio de crescimento (79% de RPMI, FBS 20%, 1% de penicilina estreptomicina) e perfundir em microtubo, recolha de efluente em cultura de tecidos bem tratados placa. </li><li> Células de cultura a 37 ° C e 5% de CO2 sob condições humidificado. </li></ol> 6. Os resultados representativos O objectivo desta técnica consiste em isolar as células cancerosas viáveis ​​a partir do sangue de pacientes com cancro. Existem vários métodos para identificar as células cancerosas em cultura; uma verificação necessária de sucesso dispositivo. Nós escolhemos para corar as células em cultura com anticorpos contra porções epiteliais, tais como EpCAM (molécula de adesão celular epitelial) ou PSMA (próstata antigénio de membrana específica), além de DAPI para identificar núcleos de células intactas (Fig. 2 e 3). O número de células cancerosas capturado usando esta técnica é necessariamente uma função do número de CTC na amostra de partida, e variabilidade paciente pode ser elevado. No processamento de amostras colhidas de pacientes diagnosticados com câncer em estágio IV, que rotineiramente capturar entre 100 e 500 células cancerosas por tubo de sangue, com pureza&gt; 50%. Imediatamente após o isolamento, um maior número de leucócitos contaminantes podem estar presentes. No entanto, estes números será esgotada de incubação a seguir no meio de cultura para até 5 dias. <img alt="A Figura 1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <strong&gt; Figura 1. esquemático de microtubo funcionalizado para CTC isolamento, mostrando-selectina mediada circulante seguido por mediada por anticorpo de adesão estática. <img alt="A Figura 2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> Figura 2. Dados representativos de isolamento CTC a partir de amostras de sangue colhido de uma paciente com câncer de mama e um paciente com câncer de pulmão. O número de células viáveis ​​positivamente identificados como CTC com base na coloração de EpCAM é representada pelas barras sólidas e pertencem à ordenadas da esquerda e da percentagem de células que foram identificados como CTC em comparação com o número total de células capturadas é representada pelas barras abertas e medido na ordenada a direita. Os resultados são depois de cinco dias em cultura. <img alt="A Figura 3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> Figura 3. Micrografias representativos de dadores separadas (A e B) de CTC em cultura de 5 dias subsequentes para isolatiem a partir de uma amostra de sangue do cancro do paciente. As células foram coradas com fluorescência para EpCAM com AlexaFluor 488 (verde) e 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar o núcleo (azul).

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
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</ol>

MRK é consultor científico de CellTraffix, Inc. (Rochester, NY).

É frequentemente o caso em que os primeiros passos na descoberta de novas terapêuticas do cancro utilizam linhas de células cancerosas, que se assemelham questionável para as células cancerosas primárias ainda continuar a ser utilizado, devido à sua facilidade de utilização no laboratório. A investigação sobre o desenvolvimento de novas terapias contra o câncer poderia ser acelerada se as células cancerosas humanas primárias foram utilizados no início da pesquisa romance. CTC são o tipo mais facilmente acessível de célula cancerosa, devido à sua presença no sangue e da facilidade de uma colheita de sangue padrão. Além disso, células tumorais circulantes representam um passo necessário no processo de metástase 5,6, pelo que a sua relevância para a doença e utilidade para o direcionamento de novas drogas é clara. Isolamento de CTC a partir de sangue in vitro é complicada pelas suas baixas concentrações: da ordem de um por milhão leucócitos ou a uma por bilhão eritrócitos 7. A maioria dos métodos actuais para a detecção de CTC no sangue, incluindo a célula única técnica aprovado pela FDA<html> Pesquisa (Veridex), danos ou destruir as células no processo de detecção, impedindo o uso além de enumeração. O método descrito acima não comprometer a viabilidade celular e, assim, abre a porta para a investigação clínica sobre o cancro futuro. Como a recuperação de células intactas é o objetivo desta técnica, é imperativo que as células ser manuseados com cuidado, especialmente durante as etapas de separação de sangue. Há um certo número de parâmetros ajustáveis ​​no presente sistema que possa ser alterada para atingir rendimento melhorado, dependendo das características críticas, tais como o tipo de cancro. Nos passos acima descritos, que tinha escolhido para usar EpCAM como um anticorpo CTC-específico para todos os tipos de cancro, excepto quando o processamento de amostras de cancro da próstata, em que anti-PSMA foi usado. Outras substituições de cancro com anticorpos monoclonais específicos pode certamente ser usado para melhorar o desempenho para pacientes individuais. Além disso, as concentrações de selectina e anticorpo pode ser alterada para melhorar a captação 8. &quot;&gt; Uma característica essencial do dispositivo é a incorporação de E-selectina moléculas sobre a superfície. E-selectina é normalmente expressa na superfície luminal das células endoteliais e de função para recrutar rápidas leucócitos que se deslocam para locais de inflamação. Leucócitos Flowing ligar transitoriamente para moléculas de selectina, resultando em um ritmo mais lento, comportamento circulante que facilita a ligação mais lento e mais forte da célula para o endotélio, por integrinas. evidência experimental convincente existe que faz o caso que CTC pode extravasamento por um mecanismo semelhante 9,10. A inclusão de selectina também permite que o dispositivo a ser operado a maiores taxas de fluxo, as taxas de que, caso contrário evitar que as células de se ligarem a anticorpos 11. Assim nosso dispositivo fisiologicamente imita uma vénula para capturar biomimetically fluindo CTC sem causar dano celular. O desempenho do dispositivo melhorado pode ser atribuída à adição do revestimento nanotubo haloisite para a superfície luminaldo dispositivo. Estudos anteriores demonstraram que existem três principais componentes do revestimento nanotubo que permite a funcionalidade melhorada. Em primeiro lugar, o revestimento de nanotubos proporciona uma área de superfície aumentada, permitindo maior deposição de proteína sobre a superfície 4. Em segundo lugar, na realização de microscopia de força atómica no revestimento nanotubo determinámos que nanotubos individuais sobressair da superfície para o fluxo. Isto permite que as moléculas de selectina a ser apresentada tanto como um micron acima da superfície de modo que as células podem ser capturados e recrutados para a superfície anterior no seu percurso através do tubo 4. Finalmente, o revestimento nanotubo haloisite é capaz de prevenir a adesão de leucócitos e espalhamento à superfície, permitindo a um número reduzido de leucócitos capturados juntamente com o CTC e, assim, uma maior purezas subsequentes CTC 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td></tr><tr><td> 300 tubos ID hum </td><td> Braintree Científico </td><td> MRE025 </td></tr><tr><td> Aumentar a tubagem para ligação a uma seringa </td><td> IDEX Saúde &amp; Ciência </td><td> 1507L </td></tr><tr><td> Seringa de 5 ml para a bomba </td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Pequeno conector para tubos de grande </td><td> IDEX Saúde &amp; Ciência </td><td> P-770 </td></tr><tr><td> Um tubo conector grande para seringa </td><td> IDEX Saúde &amp; Ciência </td><td> F-120 e P-659 </td></tr><tr><td> Seringa para microtubo (seringa de insulina 3/10cc U-100 29G 1/2 &#39;) </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MP Biomedicals LLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol-Paque Plus </td><td> GE Curathcare Bio-Sciences AB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC Lysis Buffer (Buffer de EL, 1000ml) </td><td> Qiagen </td><td> 1014614 </td></tr><tr><td> Proteína G, 5 mg </td><td> Calbiochem (calbiochem.com) </td><td> 539303 </td></tr><tr><td> Anticorpo EpCAM/TROP-1 Humanos </td><td> R &amp; D Systems </td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA Antibody (GCP-04) </td><td> Abcam </td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> Placas de 96 poços (Microtest 96) </td><td> BD Falcon </td><td> 35-3072 </td></tr><tr><td> Blotting Grau Bloqueador de leite sem gordura a seco, 300g </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> 216005508 </td></tr><tr><td> Nanotubos de haloisita </td><td> NaturalNano </td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td> Carbonato de cálcio, 5g </td><td> Aldrich Química </td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fc ug, Chimera 100 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> Meio RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td> Poli-L-lisina a 0,1% w / v em água </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td> Sonic Dismembrator </td><td> Fisher Scientific </td><td> Modelo 100 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Bioquímicos Atlanta </td><td> S11056H </td></tr><tr><td> Estreptomicina penicilina </td><td> Sigma Vida Siiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

Células tumorais circulantes (CTC) são células que divulgam a partir de um tumor primário em todo o sistema circulatório e que em última instância pode formar tumores secundários em locais distantes. CTC contagem pode ser utilizado para seguir a progressão da doença com base na correlação entre a concentração de CTC no sangue e gravidade da doença 1. Como uma ferramenta de tratamento, CTC poderia ser estudado em laboratório para desenvolver terapias personalizadas. Para este fim, o isolamento CTC deve causar nenhum dano celular, e contaminação por outros tipos de células, em particular de leucócitos, devem ser evitados tanto quanto possível 2. Muitas das técnicas atuais, incluindo o dispositivo aprovado pela FDA único para a enumeração CTC, CTC destruir como parte do processo de isolamento (para mais informações, consulte Ref. 2). Um dispositivo micro para capturar CTC viável é descrito, constituído por uma superfície funcionalizada com E-selectina glicoproteína além de anticorpos contra marcadores epiteliais 3. Para melhorar desempenho do dispositivonho um revestimento de nanopartículas foi aplicado consistindo de nanotubos haloisite, um aluminossilicato de nanopartículas colhidas a partir de argila 4. As moléculas de E-selectina fornecer um meio para captar rápido CTC movendo que são bombeados através do dispositivo, dando uma vantagem sobre alternativos dispositivos microfluídicos em que vezes mais processamento são necessárias para fornecer células alvo com o tempo suficiente para interagir com uma superfície. Os anticorpos para alvos epiteliais fornecer CTC-especificidade para o dispositivo, bem como proporcionar um parâmetro prontamente ajustável para sintonizar o isolamento. Finalmente, o revestimento nanotubo haloisite permite o isolamento significativamente melhorada em comparação com outras técnicas, ajudando a captura de forma rápida células que se deslocam, proporcionando maior área de superfície para adsorção de proteínas, e repelindo leucócitos contaminantes 3,4. Este dispositivo é produzido por uma técnica simples usando de prateleira de materiais, e tem sido utilizado com sucesso para capturar as células cancerosas do sangue de metastáticopacientes com câncer. Células capturadas são mantidos durante até 15 dias em cultura após isolamento, e estas amostras consistem tipicamente de&gt; 50% viáveis ​​células cancerosas primárias a partir de cada paciente. Este dispositivo tem sido utilizado para capturar CTC viável tanto sangue diluído todo e amostras do buffy coat. Por fim, apresentamos uma técnica com a funcionalidade em uma clínica para desenvolver terapias contra o câncer personalizados.

Células tumorais circulantes são isolados a partir do sangue de pacientes com cancro sem causar danos celulares. Isolamento de células tumorais é realizada usando uma superfície bimolecular da E-selectina para além de anticorpos contra marcadores epiteliais. Um revestimento de nanotubo especificamente promove a adesão de células cancerosas, resultando em purezas de captura elevadas.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

Células tumorais circulantes (CTC) são células que se disseminam de um tumor primário por todo o sistema circulatório e que podem, futuramente, formar tumores secundários...

O objetivo geral deste procedimento é isolar células tumorais viáveis e circulantes a partir de amostras de sangue. Comece com a preparação dos microtubos de isolamento, depois isole a camada de buffy coat das amostras de sangue. Em seguida, processe o buffy coat utilizando o dispositivo de microtubo funcionalizado.Colete as células capturadas do tubo micro e mantenha a cultura utilizando um dispositivo que mimetiza fisiologicamente um vaso para capturar biomimeticamente CTCs em fluxo, sem causar lesão celular. Esta técnica oferece funcionalidade em um ambiente clínico para desenvolver terapias personalizadas contra o câncer. As principais vantagens são que se trata de uma técnica simples que utiliza materiais comumente disponíveis e que ela reproduz o processo natural de tecido sólido que ocorre nos vasos sanguíneos.Sou Mike King, professor associado de engenharia biomédica na Universidade Cornell, e o procedimento será demonstrado por Jeff Madison, um técnico sênior do meu laboratório. O protocolo a seguir é para a produção de um único dispositivo de microtubo: sonique 250 microlitros de uma solução de nanotubo a 6,6% Halo site por 30 segundos e resfrie a solução com água fria.Após uma segunda sonicagem, aspire a solução para dentro de uma seringa. Filtre a solução através de um filtro de seringa de 0,45 mícrons para um tubo de microcentrífuga limpo e vórtice. A solução de nanotubos no local do halo periodicamente.Para manter a homogeneidade, obtenha um trecho de 50 centímetros de comprimento de tubo micro rehan. Corte a entrada do microtubo em diagonal e insira uma das extremidades do microtubo em um pequeno adaptador IDEXX, inserindo uma agulha de seringa na outra extremidade do microtubo. Para limpar o microtubo, coloque a extremidade aberta do microtubo em etanol 70% e aspire cerca de 50 microlitros de etanol para dentro da seringa, preenchendo o microtubo para enxaguar o etanol para fora do microtubo.Aspire um volume generoso de água destilada para dentro da seringa. Agora, desprenda a seringa do microtubo, esvazie a seringa e, em seguida, reconecte-a ao microtubo. Aspire 50 microlitros de 0,02 por cento em peso por volume.Adicione poliol lisina ao tubo micro e incube por cinco minutos à temperatura ambiente. Em seguida, aspire 100 microlitros da solução filtrada de nanotubo para dentro do tubo micro e incube por três minutos à temperatura ambiente. Para remover a solução de nanotubo, aspire 100 microlitros de água através do tubo micro e incube durante a noite à temperatura ambiente; depois, aspire 50 microlitros de PBS através do tubo micro, seguidos por 50 microlitros de 10 microgramas por mililitro.Equilibre a solução de proteína G por 90 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, aspire 50 microlitros de solução de IgG de E-selectina a cinco microgramas por mililitro e 50 microgramas por mililitro para o tubo microcêntrifuga. Incube por duas horas à temperatura ambiente e bloqueie a adesão celular não específica com proteína de leite a 5%.Em seguida, incubar o PBS à temperatura ambiente até que as amostras de sangue ou camada leucócita estejam prontas para processamento, 10 minutos antes de usar o tubo micro para isolamento celular. Aspirar 50 microlitros de PBS saturado com cálcio para ativar as moléculas de seletina em um tubo heparinizado. Coletar uma amostra de sangue de 10 mililitros de um paciente para isolamento de linfócitos.Coloque 10 mililitros da solução fol pack em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Sobreponha suavemente a amostra de 10 mililitros de sangue total e centrifugue a 2000 vezes G durante 15 minutos, a quatro graus Celsius, com desaceleração mínima. Em seguida, transfira a camada de buffy coat para um novo tubo.Lave a camada leucocitária com PBS e centrifugue para lisar os eritrócitos. Re-suspenda suavemente os pellets celulares em um mililitro de tampão de lise de hemácias e incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, adicione 10 mililitros.Adicione PBS suavemente e as células do palato por centrifugação. Re-suspenda suavemente as células em PBS com o uso de adaptadores IDEXX. Fixe uma extremidade do microtubo funcionalizado a uma seringa de cinco mililitros.Insira a seringa em uma bomba de seringa e submerja a extremidade aberta do microtubo funcionalizado na prevenção de células. Processe a suspensão celular através do microtubo para remover as células não ligadas e fracamente ligadas. Transfira a extremidade aberta do microtubo para um tubo contendo PBS mais.Aspire 300 microlitros de PBS para dentro da seringa. Em seguida, coloque a extremidade aberta do microtubo em um tubo limpo. Desconecte a seringa do microtubo e conecte uma seringa contendo acuate, perfundindo suavemente com acuate para preencher o microtubo.Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, acople uma seringa contendo um mililitro de meio de crescimento, perfunda o microtubo e colete o efluente em tecido apropriado. Placas de cultura seguem para cultivo. As células circulantes tumorais isoladas foram obtidas de amostras de sangue de um paciente com câncer de mama e de um paciente com câncer de pulmão após cinco dias.Em cultura. Essas preparações foram caracterizadas quanto à captura de CTCs com base na coloração para a molécula celular epitelial epican, bem como a pureza de captura do núcleo foi calculada como a porcentagem de células identificadas como CTC em relação ao número total de células capturadas. Esta imagem mostra micrografias representativas de CTCs isoladas dos doadores A e B. Após cinco dias em cultura, as células foram coradas com fluorescência para EPAM com Alexa Fluor 488.Os núcleos foram visualizados pela coloração com DPI. Após este procedimento, CTCs viáveis e culturas podem ser utilizadas para obter informações específicas do paciente, como suscetibilidade a medicamentos ou expressão de marcadores celulares. Obrigado por assistir e boa sorte.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo descreve um protocolo detalhado para isolar células tumorais circulantes da amostra de sangue total de um modelo de camundongo com tumor colorretal sacrificado. Essas CTCs isoladas podem ser cultivadas e usadas para análise downstream pretendida.

Isolamento CTC de uma amostra de sangue total: um método para obter CTCs de modelo de câncer colorretal murino

As células tumorais circulantes (CTCs) demonstraram desempenhar um papel importante na metástase tumoral. Aqui, um método para o isolamento e propagação de CTCs a partir do sangue total de um modelo de tumor singênico de camundongo de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC) é descrito.

Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Um protocolo para utilizar um poli (N-iso-propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro revestido para captura e libertação eficaz thermoresponsive de células viáveis tumorais circulantes (CTC) é apresentada. Este método permite a captura de CTC de sangue dos pacientes e posterior liberação dos CTC viável para a cultura off-chip jusante, análises e caracterização.

Captura e libertação de viáveis ​​circulantes células tumorais do sangue

Descrevemos o estabelecimento de tumores colorretais ortotópicos através da injeção de células tumorais ou organoides no ceco de camundongos e o subsequente isolamento de células tumorais circulantes (CTCs) deste modelo.

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Este protocolo é para recuperar e preparar células alvo rara de uma mistura com células de fundo não-alvo molecular caracterização genética a nível de célula única. Qualidade do DNA é igual a não-tratados de células únicas e permite a aplicação de célula única (ambos triagem com base e direcionados a análise).

Amplificação de genoma pré-enriquecimento e toda célula alvo para jusante caracterização única célula

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho integrado para identificar características fenotípicas e moleculares que caracterizam células tumorais circulantes (CTCs). Combinamos imunocoloração ao vivo e micromanipulação robótica de CTCs simples e clusterizadas com técnicas baseadas em células únicas para análise a jusante e avaliação da capacidade de propagação de metástases.

Micromanipulação de células tumorais circulantes para análise molecular a jusante e avaliação do potencial metastático

A caracterização de células tumorais circulantes (CTCs) é um tema popular na pesquisa translacional. Este protocolo descreve um ensaio semiautomático da imunofluorescência (se) para a caracterização do PD-L1 e a enumeração dos CTCs em amostras pacientes do cancro do pulmão da não-pequena pilha (NSCLC).

Caracterização e enumeração semiautomáticas de PD-L1 de células tumorais circulantes de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas por imunofluorescência

Os CTCs de cultivo permitem uma caracterização funcional mais profunda do câncer, através do ensaio de expressão específica do marcador, e da avaliação da resistência medicamentosa e da capacidade de colonizar o fígado entre outras possibilidades. No geral, a cultura CTC pode ser uma ferramenta clínica promissora para a medicina personalizada para melhorar o resultado do paciente.

Linhas celulares tumorais circulantes: uma ferramenta inovadora para pesquisa fundamental e translacional

O chip microfluídico clínico é uma importante técnica de análise biomédica que simplifica o pré-processamento de amostras de sangue de pacientes clínicos e cora por imunofluorescência as células tumorais circulantes (CTCs) in situ no chip, permitindo a rápida detecção e identificação de uma única CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis

As células tumorais circulantes (CTCs) são críticas para o estudo da progressão e metástase do câncer. Este artigo apresenta um protocolo integrado de alto rendimento para enriquecimento de CTC e sequenciamento de CTC única, melhorando a eficiência de captura e a pureza da CTC, reduzindo os custos de contaminação e sequenciamento, avançando assim na pesquisa de oncologia de precisão e aplicações clínicas.

Tecnologia de Classificação de Células Tumorais Circulantes de Alto Rendimento e Tecnologia de Sequenciamento de Célula Única Baseada em Microfluídica

Aqui apresentamos um protocolo para ilustrar o isolamento de células cancerígenas raras a partir de uma amostra artificial contendo sangue total e com células de câncer de pulmão com picos. O protocolo utiliza uma plataforma de isolamento de células semi-automatizada e sem rótulos. Células enriquecidas são posteriormente analisadas para mutações nos receptores do fator de crescimento epidérmico usando PCR digital de gotículas.

Perfilamento de mutações do DNA do receptor do fator de crescimento epidérmico em células raras circulantes usando um sistema de isolamento celular e PCR digital por gotículas

Aprenda a isolar células tumorais circulantes viáveis de amostras de sangue usando um dispositivo de microtubos funcionalizado com E-selectina. Esta técnica biomimética captura CTCs sem danificar as células, permitindo análises personalizadas para terapias oncológicas.

Isolamento rápido de células tumorais viáveis ​​circulantes de amostras de sangue de doentes

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