Name: Granulócitos-dependente Blistering pele induzida por auto-anticorpos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Aprenda a induzir bolhas cutâneas em camundongos por transferência passiva de anticorpos IgG específicos contra colágeno VII. Este modelo reproduz as características histopatológicas da epidermólise bolhosa adquirida humana.

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Os autores reconhecem o apoio por concessões do Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 e BIOS da Faculdade de Medicina da Universidade de Freiburg (para CS).

1. Preparação de Anticorpo Pathogenic Nota: A purificação e concentração dos anticorpos deve ser realizada no mesmo dia, na forma de anticorpos não são para ser armazenada em glicina 0,1 M pH 2,5-3 (tampão de eluição) durante a noite (ON). A purificação por afinidade de IgG: usar 25 ml de soro de coelho imune: <ol><li> Descongelar o soro de coelho ON a 4 ° C, mistura-a 1:1 com tampão de corrida (1xPBS) e centrifugar a 1260 ela xg durante 10 min a 20 ° C. Opcionalmente, um passo de filtração com papel de filtro pode ser incluída no processo, após a centrifugação do soro é gordurosa. </li><li> Enquanto isso, lava-se a proteína G matriz cheia de coluna com 10 volumes de leito (volume do leito = volume da matriz) de 1xPBS (tampão de corrida). </li><li> Aplicar o soro diluído e filtrou-se para a coluna e incuba-se 1 hora na plataforma de balanço à temperatura ambiente (RT). </li><li> Recolher o flow-through (FT) num tubo de Flacon de 50 ml. Não descartá-lo até a concentraçãoe titulação da IgG purificada é conhecido. </li><li> Lava-se a matriz com 5 volumes de leito de 1xPBS e, entretanto, se preparar tubos de 50 ml Falcon para recolher a fracção de IgG eluida. Pipetar 1 ml de tampão de neutralização de pH: Tris 1 M pH 10, em cada um dos tubos (caso contrário, a proporção de 01:20 de tampão TRIS em relação à quantidade de fluido a ser recolhido). </li><li> Aplicar 100-150 ml de tampão de eluição: glicina 0,1 M pH 2,5-3 para a coluna e recolher 50 ml fracção (s). Virar o tubo 2-3x, medir o pH e adicionar tampão de neutralização até que tenha atingido o pH 7,2-7,4. </li><li> Recolher gotas de fluido e IgG utilizando o tampão de eluição, como etalon medir a densidade óptica a 280 nm. Se a DO for &lt;recolha de paragem 0,1. </li><li> Regenerar a proteína da matriz G e armazená-la seguindo as instruções do fabricante. </li></ol> Concentração por ultrafiltração Amicon com tubos: <ol><li> Lavar o Ultra Amicon (15 ml / 30 kDa) em tubos de ultraf iltração com 1xPBS por centrifugação 15-20 minem 3220 xg, a 4 ° C. Descarte o FT do Amicon. </li><li> Encha as Amicons com 15 ml da fracção de IgG eluida e centrifugar durante 25-30 minutos a 3220 xg e 4 ° C, o tempo de centrifugação sempre depende do teor de proteína do eluato. </li><li> Descarte FT e repetir ultrafiltração até que você tem nenhuma fração eluída esquerda. </li><li> Lava-se a IgG concentrado extensivamente, por duas vezes, com 1xPBS 25-30 min por centrifugação. </li><li> Recolher o &quot;adesivo&quot;, a solução de anticorpo amarelado a partir do filtro Amicon, num volume final de 1.500-2.000 ul de 1xPBS. </li><li> Concentração medida de preparação de IgG utilizando um espectrofotómetro ou NanoDrop: Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x factor de diluição / 1,4 </li><li> Lavar e armazenar os Amicons seguindo as instruções do fabricante. </li></ol> 2. A injeção de colágeno VII IgG específica em camundongos Antes de iniciar o procedimento real experimental, certifique-se de que o pró experimentalprotocolo é escrito e todos os materiais são preparados para o experimento. <ol><li> Prepare as folhas de dados para o placar doença, ELISA, imunofluorescência (IF) análise e mieloperoxidase (MPO) ensaio 4. </li><li> Rotular os tubos de sangue e órgãos, cryomolds bem como histologia de processamento e incorporação de cassetes. </li><li> As soluções de anticorpo deve ser preparado fresco ou descongelado a partir de stocks e caracterizado quanto à sua reactividade (título por microscopia de IF e / ou ELISA). A solução filtrada estéril anticorpo deve ser diluído em PBS, de forma que a dose necessária para a injecção varia entre 250-1000 ul. Certifique-se de que você tem IgG suficiente para realizar todo o experimento. </li><li> Preparar fresco anticoagulante heparina de 20 U / ml e 8,7 mg / ml de cetamina / xilazina 1,3 mistura mg / ml para a anestesia. Quando sacrificar os ratos têm rotulado tubos com formaldeído 3,7% preparado. </li><li> Esterilizar instrumentos cirúrgicos (bisturi, tesouras, ponta fina e Curvforcipes ed) e preparar seringas (seringas de insulina, 1 e 2 seringas ml), agulhas, câmera digital e cartão de memória extra. </li></ol> Nota: Execute todos os procedimentos de cetamina / xilazina ou isoflurano ratos narcotizada isoflurano é a opção preferida para anestesia as verificações diárias de pele, como os ratos recuperar rapidamente.. No entanto, ao tirar fotos, 87 cetamina mg / kg e xilazina 13 mg / kg é geralmente administrado por via subcutânea. Para a eutanásia a dosagem de cetamina / xilazina é aumentada para 130 mg de cetamina / kg de xilazina e 20 mg / kg. <ol><li> Verifique os animais já marcados para a sua saúde da pele estado geral, e da aparência da pele, pesá-los e medir a sua espessura orelha (sempre manter a mesma orelha). </li><li> Registre-se valores observados e mudanças na folha de avaliação clínico. </li><li> Recolher 20-30 ul (2-3 gotas) de sangue a partir da veia da cauda de uma seringa contendo o mesmo volume de anticoagulante. </li><li> Desinfectar a pele eda pele utilizando etanol a 80%. </li><li> Injectar a solução de anticorpo por via subcutânea na parte de trás utilizando uma seringa de insulina. (Para certos sítios (por exemplo, as orelhas) apenas pequenos volumes (10-50 ul) são viáveis ​​para ser injectada.) </li></ol> As injeções devem ser repetidas a cada dois dias, quatro vezes. Balb / c e ratinhos C57BL6 de um peso corporal de aproximadamente 20 g de começar a desenvolver a doença de 3-4 dias após a primeira administração de 400-500 até 750 ug / g de peso corporal / injecção auto-anticorpos. Ao terminar a experiência: <ol><li> Colocar os ratos sob narcose profunda por injecção de 130 mg / kg e 20 mg / kg de cetamina / xilazina por via subcutânea, desangrar los da veia cava posterior e cortar o coração. </li><li> Coletar amostras de tecidos / órgãos como a pele: rabo, orelha, sangue e esôfago e colocá-los em tubos previamente identificados e PBS ou 3,7% de formaldeído preenchido. </li></ol> Ao retornar para olaboratório: <ol><li> Centrifuga-se o sangue a 1200 xg, 10 min à temperatura ambiente para separar o plasma, transferir o plasma para tubos adequadamente etiquetados e armazená-los em conformidade. </li><li> Incorporar o biópsia da pele em meio corte de óptima temperatura através cryomolds, devidamente etiqueta, e armazená-los a -80 ° C. </li><li> Coloque as amostras de tecidos destinados a histologia nos moldes de incorporação rotulados e mantê-los em formol 3,7% até parafina. </li></ol> 3. Avaliação clínica de gravidade da doença Ratos devem ser examinados diariamente para lesões de pele e mucosa e os resultados devem ser registradas utilizando formulários apropriados. Os critérios para a eutanásia precoce é lesões da pele que afectam mais do que 20% da superfície do corpo e uma perda de peso de 5-10% do peso corporal total, em três dias consecutivos, contados a doença para uma pontuação de 5 (Tabela 1). <ol><li> Posicione o mouse sobre sua barriga. Comece com a área da cabeça, ou seja, com o direitoorelha e verificar se há bolhas, erosões, crosta no interior, bem como sobre o lado exterior. Continuar da mesma maneira com a orelha esquerda. </li><li> Olhos direito e esquerdo são controlados por sinais de eritema, alopecia, erosões e / ou crosta. </li><li> Testa e área focinho são escovados através seguinte, continuando com a parte ventral do focinho, lábio e da mucosa da boca. </li><li> Examine a perna dianteira direita a partir da pata, movendo-se para cima; mudar para a perna dianteira esquerda. Mesmo procedimento com as pernas traseiras direita e esquerda. </li><li> Pincele com a pele no pescoço e nas costas com uma área de curvas pinça de ponta fina. </li><li> Vire o mouse em sua parte traseira e verifique a parte ventral, bem como nos lados ventral dos membros da mesma forma que anteriormente. </li><li> Verifique a cauda. </li><li> Tire fotos de partes relevantes do corpo onde os ratos desenvolvem a doença. Atenção deve ser dada à qualidade e quantidade de fotos. </li><li> Calcular as pontuações clínicos da doença. </li></ol> 4. Análise de amostras de pele e Plasma <ol><li> Preparar, armazenar e / ou processar todos os tecidos coletados de acordo com o plano. </li><li> Corte cortes de tecidos congelados para se a detecção de anticorpos de coelho e rato componentes do sistema complemento. </li><li> Analisar o teor de proteína e de enzima diferente (ensaio de MPO) de tecidos congelados e / ou extractos de órgãos. </li><li> Secção do tecido embebido em parafina e coradas com H &amp; E para visualizar a extensão do dano tecidual. </li><li> Analisar o plasma por ELISA, imunotransferência. </li></ol>

<ol><li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li>
<li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li>
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<li>Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+transfer+model+of+the+organ-specific+autoimmune+disease%2C+bullous+pemphigoid%2C+using+antibodies+generated+against+the+hemidesmosomal+antigen%2C+BP180%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180.</a> J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).</li>
<li>Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pemphigus+in+neonatal+mice+by+passive+transfer+of+IgG+from+patients+with+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.</a> N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).</li>
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<li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li>
<li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A transferência passiva de anticorpos em animais experimentais é uma abordagem importante para a demonstração da sua patogenicidade 7, -12. Os modelos animais obtidos por meio deste método, para além de ser a evidência indirecta para autoimunidade 13, permite a investigação da fase eferente do mecanismo patogénico. O modelo de transferência passiva de anticorpos induzida pela pele de granulócitos-dependente de bolhas Epidermólise bolhosa adquirida (EBA), foi usada para dissecar os mecanismos de dan...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> antigénio recombinante </td><td></td><td></td><td> A codificação de plasmídeos para as formas recombinantes do colagénio murino VII estão disponíveis a partir do autor correspondente. </td></tr><tr><td> soro de coelho imune </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> Tivemos coelhos New Zealand White imunizados com 200 ug de antigénio, 3 vezes em 2 semanas de intervalo. Para isso, usaram os serviços de Eurogentec SA, Bélgica. </td></tr><tr><td> Proteína G agarose </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> Camundongos Balb / c </td><td> Charles Ri ver Laboratories </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Outubro composto, Tissue-Tek </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td><td> OCT, a temperatura de corte óptima </td></tr><tr><td> Cryomold padrão </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 milímetros × 20 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Cryomold intermediário </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 mm × 15 mm × 5 mm </td></tr><tr><td> Uni-Link Einbettkassette- </td><td> R. Langenbrinck </td><td> 09-0503 </td><td> Histologia processamento e cassetes de incorporação </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe Schwarz </td><td> H. Hauptnerund &amp; Richard Herberholz GmbH &amp; Co. KG </td><td> 71492000 </td><td> tatuagem pasta </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> EBECO E. Becker &amp; Co GmbH </td><td></td><td> tatuagem dispositivo </td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7692,1 </td><td></td></tr><tr><td> De formaldeído a 37% </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co. </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de cetamina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> Cloridrato de xilazina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> PBS estéril </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> câmera digital </td><td> Nikon </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa conduzida unidade de filtro de 0,45 um </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Compasso de calibre </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (distribuidor) </td></tr><tr><td> folha de pontuação doença </td><td></td><td></td><td> exemplo recintosed </td></tr></tbody></table>

granulócitos-dependente blistering pele induzida por auto-anticorpos

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Fenómenos auto-imunes ocorrem em indivíduos saudáveis, mas, quando a auto-tolerância falhar, a resposta auto-imune pode resultar na patologia específica. De acordo com os postulados de Witebsky, um dos critérios para o diagnóstico de uma doença auto-imune, como seja a reprodução da doença em animais experimentais por uma transferência passiva de anticorpos. Para epidermólise bolhosa adquirida (EBA), uma doença órgão-específica protótipo auto-imune da pele e membranas mucosas, vários modelos experimentais foram recentemente estabelecida. No modelo animal descrito no nosso trabalho, purificou anticorpos IgG contra uma extensão de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colagénio VII são injectados repetidamente em ratinhos que reproduzem o fenótipo empolar, bem como a histo-e imunopatológicas características de humano EBA 1. Full-blown doença generalizada é normalmente visto 5-6 dias após a primeira injecção e a extensão da doença está correlacionada com a dose administrada de a collagen VII-IgG específico. A lesão tecidual (a formação de bolhas) na EBA experimental é, dependendo do recrutamento e ativação de granulócitos por tecidos ligados auto-anticorpos 2, -4. Portanto, este modelo permite a dissecção da via dependente de granulócitos-inflamatório envolvido no dano de tecido auto-imune, como o modelo reproduz apenas a fase de células T independente da resposta auto-imune eferente. Além disso, o seu valor é sublinhado por uma série de estudos que demonstram o potencial de indução de blister de anticorpos in vivo e investiga o mecanismo da formação de bolhas na EBA 1,3, -6. Finalmente, o modelo vai facilitar grandemente o desenvolvimento de novas terapias anti-inflamatórios em doenças induzidas por auto-anticorpos. No geral, o modelo animal passiva transferência da EBA é um modelo de doença acessível e instrutivo e vai ajudar os pesquisadores a analisar não só a patogênese EBA, mas a resposta fundamental biológica e clinicamenteperguntas essenciais autoimunidade.

A transferência passiva de anticorpos específicos de antigénio resulta numa doença soprado em ratinhos, assemelhando-se a níveis clínicos, histológicos e imunopatológicas, a ABE humano. Bolhas, crostas, erosões e alopecia desenvolver nas orelhas, focinho, patas, pernas, costas e ao redor dos olhos dos camundongos. Os primeiros sinais clínicos da doença, muito provavelmente aparecer nas orelhas e / ou área de cabeça. Deposição de coelho específico IgG e complemento do mouse C3 é detectado pelo IF direta na junção dermo e...

No modelo animal descrito no nosso trabalho, purificou anticorpos IgG contra uma extensão de 200 aminoácidos (aa 757-967) de colagénio VII são injectados repetidamente em ratinhos que reproduzem o fenótipo empolar, bem como a histo-e imunopatológicas características de humano epidermólise bolhosa adquirida (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

Granulócitos-dependente Blistering pele induzida por auto-anticorpos

Fenômenos autoimunes ocorrem em indivíduos saudáveis, mas quando a autotolerância falha, a resposta autoimune pode resultar em patologia específica. De acordo com...

Sou Cassian RO do Departamento de Dermatologia da Universidade de Fryberg, Alemanha. A pesquisa do nosso laboratório está focada na patogênese de doenças cutâneas autoimunes. Uma das doenças autoimunes que nos interessa é a Epidermólise QUISTA ou EBAA, uma doença autoimune específica de órgão com um sistema de autoanticorpos e antígenos bem definido, e modelos complementares mútuos ex vivo e animais estão disponíveis para esta doença.A formação de bolhas na EBA pode ser reproduzida pela transferência passiva de anticorpos contra o colágeno tipo sete em camundongos. Portanto, neste artigo em vídeo, apresentaremos a indução e análise do aparecimento de bolhas na pele de camundongos por meio da transferência passiva de anticorpos específicos para o colágeno sete. Olá, sou King OBA do Grupo CAS do Departamento de Dermatologia do Hospital Universitário de Freberg.Neste vídeo, vamos demonstrar como o modelo experimental de EBA em camundongos é induzido pela transferência passiva de autoanticorpos patogênicos. Utilizamos este procedimento ao investigar possíveis mecanismos patogênicos em doenças cutâneas autoimunes ou ao buscar epítopos patogênicos. Ao estabelecer o modelo de transferência passiva para EBA, algumas etapas adicionais devem ser realizadas antes da injeção de autoanticorpos em camundongos palpe palp do tipo selvagem.Como primeiro passo, coelhos brancos são imunizados por via subcutânea com o antígeno recombinante purificado. A IgG total do soro de coelho é isolada por cromatografia em coluna de afinidade e posteriormente injetada em camundongos selvagens. As injeções são administradas por via subcutânea a cada dois dias, quatro vezes, e o sangue é coletado em intervalos de dois dias.Os camundongos são examinados diariamente quanto ao seu estado geral e à presença de lesões cutâneas. Durante o experimento, escores clínicos que refletem a atividade da doença são calculados para cada indivíduo, e duas semanas após a primeira injeção, os animais são sacrificados, coletando-se amostras de soro e biópsias de pele para análises posteriores. Após o tempo de incubação, coloca-se uma coluna em um suporte vertical, abre-se a extremidade inferior, bate-se levemente e coleta-se o fluxo que atravessa.Em tubos Falcon de 50 mililitros, mantenha o fluxo passante até obter a confirmação por análise de imunofluorescência de que se trata de um concentrado livre de anticorpos específicos, com IgG diluída por ultrafiltração em tubos Amicon especiais a 3.220 × g durante 30 minutos a quatro graus. A concentração consiste em deixar o eluato passar por um filtro, descartar o fluxo passante, reabastecer o tubo e repetir o processo até que não reste eluato. Como etapa final, lave com PBS 1×, colete a IgG concentrada, viscosa e amarelada, meça sua concentração e armazene-a em tubos devidamente rotulados.Antes de iniciar a injeção propriamente dita dos autoanticorpos, avalie sua especificidade e seu título por imunofluorescência indireta. Incube cortes criostáticos de pele normal de camundongo com diluições seriadas da preparação concentrada de IGT e visualize seu depósito por meio de um anticorpo secundário adequado marcado com fluoróforo, documentando por meio de imagens antes de ir à instalação animal. Certifique-se de que o protocolo para animais esteja redigido e que todos os materiais estejam preparados.Fichas de dados para a pontuação clínica da atividade da doença, tubos rotulados para amostras de sangue e tecido. Solução de anticorpo diluída de modo que o volume adequado possa ser injetado. Instrumentos cirúrgicos esterilizados com anticoagulante e anestésico frescos, bem como seringas.Um paquímetro e uma câmera digital também devem ser incluídos na lista de verificação. Após limpar a superfície de trabalho e preparar o equipamento de isoflurano, heparinize a seringa para coleta de sangue e preencha uma seringa de insulina com a solução de anticorpo. Retire o camundongo da gaiola, verifique seu número de identificação e pese-o.Registre todos os dados medidos e observados na planilha de dados pessoais e escore clínico dos camundongos. Quando o camundongo já estiver sob anestesia, meça a espessura da orelha e, em seguida, verifique a aparência da pele e do pelo do animal. Preste especial atenção à região da cabeça, costas, abdome e membros.Retire sangue da veia da cauda por meio de uma pequena incisão feita em seu terço superior, desinfete o pelo e, levantando a pele nas costas, injete cuidadosamente a solução de IgG por via subcutânea. Ao retornar ao laboratório, centrifugue o sangue por 10 minutos a 1.200 ×g em temperatura ambiente para obter o soro. Transfira a amostra para tubos devidamente identificados e armazene-os conforme o plano.Examine os camundongos diariamente em busca de sinais de doença quando começarem a desenvolver eritema, alopecia e lesões cutâneas. Além de medir seu peso, avalie a atividade da doença. Injete subcutaneamente uma mistura de cetamina cila para colocar o camundongo sob anestesia.Meça a espessura da orelha e, em seguida, inicie o exame geral do corpo. Use pin&ccedil;as curvas de ponta fina para escovar o p&ecirc;lo no sentido contr&aacute;rio ao do seu crescimento, a fim de expor poss&iacute;veis &aacute;reas afetadas. Prossiga ao redor do rosto.O olho e o focinho movendo-se em direção à parte externa e interna da orelha, e então verifique também o outro lado da cabeça. Continue com a mucosa da cavidade oral, a parte ventral do focinho e a região abdominal. A região dorsolateral, dorsal e do pescoço, bem como os membros anteriores e as patas dianteiras.Quantifique a extensão das lesões no registro, os achados no formulário com base na área da pele afetada, percentual de certas partes e regiões do corpo em comparação com a superfície cutânea total do camundongo. Um escore clínico de doença é calculado com base na área total de pele e mucosa afetada. Por fim, tire fotos das partes do corpo relevantes e das áreas doentes.No final do experimento, sacrifique os animais sob anestesia profunda e colete amostras de sangue e tecidos. As orelhas, a cauda e o esôfago são os tecidos mais frequentemente coletados neste contexto experimental. Corte as biópsias da pele lesada em tiras menores.Coloque-os em caixas para processamento e inclusão histológica e mantenha-os em formaldeído a 3,7% até a inclusão em parafina. Posteriormente, processe as amostras para coloração com hematoxilina e eosina para análise de imunofluorescência. Inclua as tiras de pele peral em meio de temperatura ótima para corte e use um criostato para cortar seções de seis micrômetros.Realize uma análise de imunofluorescência direta para visualizar os anticorpos específicos de coelho ligados ao tecido e os componentes do complemento de camundongo; como ensaio adicional, realize ELISA utilizando placas de microtitulação revestidas com antígeno recombinante e diluições seriadas do soro de camundongo, a fim de mensurar os níveis de autoanticorpos circulantes. A transferência passiva de anticorpos específicos contra colágeno VII resulta em uma doença completa em camundongos, semelhante à doença humana em níveis clínicos, histológicos e imunopatológicos. Bolhas, crostas, erosões e alopecia semelhantes à EBA humana desenvolvem-se nas orelhas, ao redor dos olhos, focinho, patas, pernas e dorso dos camundongos.A atividade da doença, que apresenta uma tendência crescente ao longo do experimento, é calculada com base na área da pele e da membrana mucosa afetadas. Resultados representativos que mostram a deposição de IgG de coelho específica e do complemento C3 de camundongo detectados por imunofluorescência indireta na junção dérmico-epidérmica. Em cortes criosecionados de pele periférica são mostrados aqui.Nenhuma IgG ou complemento C3 foi detectada nos controles. A análise histológica subsequente da pele lesada revela bolhas subepidérmicas e infiltrado inflamatório. No entanto, a formação de bolhas subepidérmicas não é observada no controle quando realizado.Como mostrado aqui, o modelo de autoanticorpo em uso para bolhas subepidérmicas será de grande valia para a análise das vias inflamatórias dependentes de ROY desencadeadas por autoanticorpos, resultando em dano tecidual. Seu design robusto e protocolo simples tornam-no adequado também para o desenvolvimento e teste de novas terapias anti-inflamatórias em doenças induzidas por autoanticorpos.

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Dermatite herpetiforme (DH) é uma condição inflamatória crônica caracterizada por uma reação auto-imune entre IgA e transglutaminase epidérmica (ETG). DH se desenvolve em uma parcela muito pequena dos pacientes glúten-sensíveis e / ou doença celíaca. Os resultados deste estudo indicam que a DH também pode se desenvolver em um hospedeiro macaco rhesus com sintomas da dermatite idiopática.

Reconhecimento da transglutaminase epidérmica por 2 Anticorpos IgA transglutaminase tecidular e em um caso raro de Rhesus Dermatite

Imunofluorescência indireta (IFI) ensaios têm sido tradicionalmente utilizados para a detecção de anticorpos antinucleares (ANA) no soro humano. A presença destes anticorpos pode ajudar no diagnóstico de doenças reumáticas sistémicas auto-imunes (SARD). Este protocolo demonstra como executar efetivamente a técnica IIF para detectar com precisão essas auto-anticorpos.

Anti-Nuclear Antibody Triagem Usando Células HEp-2

A transferência de linfócitos bm12 para um receptor C57BL/6 é um modelo estabelecido de lúpus eritematoso sistêmico. Aqui descrevemos como iniciar a doença usando este modelo e como caracterizar células T foliculares auxiliares, células B do centro germinativo e células plasmáticas por citometria de fluxo.

O Inducible Modelo BM12 de Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) em camundongos C57BL / 6

Aqui, nós fornecemos uma demonstração do modelo sucção bolha cutâneo de recordação. O modelo permite um acesso simples ao estudo humano na vivo adaptável respostas imunes, por exemplo, no contexto do desenvolvimento de vacinas.

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Este protocolo descreve a geração de quimeras misto murino da medula óssea com espontâneas centros germinativos auto-imune, na qual auto-reativas linfócitos transportar um repórter de proteína verde fluorescente (GFP-PA) photoactivatable. Isto fornece a capacidade de ligar a localização celular em tecidos com análises moleculares e funcionais a jusante.

Interrogando os centros germinativos auto-reativas individuais por Photoactivation em um modelo misto de quimérico de auto-imunidade

O teste de ativação basófila é um teste complementar de diagnóstico in vitro para a avaliação de reações alérgicas mediadas por IgE com base na detecção de ativação basofílica na presença de um estímulo específico através da medida de marcadores de ativação por citometria de fluxo.

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Leishmaniose cutânea na pele do dorso de Hamsters: um modelo útil para o rastreamento de drogas leishmanicidas

Este artigo descreve um método para visualizar a formação de uma sinapse envelope de HIV-1 induzida por virológica em vidro suportados bicamadas planares por reflexão total interna de fluorescência microscopia (TIRF). O método pode também ser combinado com coloração de imunofluorescência para detectar a activação e redistribuição de moléculas de sinalização que ocorrem durante o HIV-1 a formação de sinapses envelope induzida virológica.

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Granulócitos-dependente Blistering pele induzida por auto-anticorpos

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