Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

O objetivo geral dos experimentos descritos é o monitoramento da integração do sinal de potencial de membrana e processamento de informações por uma célula nervosa individual opticamente com resolução submicrométrica e submilissegundo de vários locais em um neurônio. Isso é obtido primeiro construindo uma configuração de imagem com sensibilidade apropriada para permitir o registro de pequenas mudanças fracionárias na intensidade da luz correspondente ao transiente potencial da membrana. Em seguida, selecione os neurônios com anatomia apropriada para neurônios de imagem eficazes com processos longos e intactos em um único plano focal próximo à superfície da fatia.

Em seguida, carregue os neurônios pré-selecionados com corantes sensíveis à voltagem para permitir o rastreamento óptico das mudanças no potencial da membrana. Os resultados mostram a capacidade única dessa abordagem de obter informações sobre a integração de sinais elétricos por células nervosas individuais, monitorando sinais de potencial de membrana de axônios, dendritos e espinhas dendríticas. Em neurofisiologia celular.

Novas ferramentas estão sendo desenvolvidas devido às duas limitações de longa data da eletrofisiologia convencional, baixa resolução espacial das medições de eletrodos e incapacidade de registrar a partir de pequenas estruturas, como colaterais de axônios ou espinhas dendríticas. Para superar essas desvantagens, a abordagem do eletrodo de patch pode ser combinada com técnicas ópticas que permitem gravações paralelas de todas as partes de um neuro. Aqui descrevemos tal técnica, gravação óptica de múltiplos lados de transientes de potencial de membrana com resolução de coluna única.

Neste experimento, um microscópio vertical e três câmeras são usados para ajustar a iluminação uniforme. Primeiro, insira um filtro de densidade neutra apropriado no caminho do feixe de laser. Em seguida, concentre a objetiva na superfície da lâmina fluorescente padrão.

Enquanto observa a imagem CCD do campo de view na tela do monitor, ajuste a posição da extremidade receptora da guia de luz de quartzo e a posição da extremidade de saída da guia de luz usando atuadores apropriados no condensador de epifluorescência para obter uma iluminação centralizada e uniforme do campo de view. Para determinar o ruído vibracional, use uma lâmina fluorescente padrão com uma marca não fluorescente na superfície. Registre a intensidade da luz com o neuro CCD no modo contínuo.

Foque a objetiva em uma borda escura da marca preta e grave a intensidade da luz por cerca de 100 milissegundos a uma taxa de quadros de dois kilohertz. Em seguida, exiba a média espacial dos traços de intensidade de luz fracionária de aproximadamente 20 pixels recebendo luz da área uniformemente iluminada e de aproximadamente 20 pixels ao longo da borda da marca preta. O excesso de ruído na média espacial dos pixels com bordas de alto contraste reflete o ruído vibracional no sistema.

É essencial ter o obturador mecânico montado fora da mesa de isolamento de vibração para que a abertura do obturador não introduza ruído vibracional na gravação óptica. Este é um passo crítico. Monte o obturador usando parafusos de plástico e material de isolamento de vibração para reduzir o ruído vibracional acústico que pode ser captado pelo sistema de gravação óptica.

Para isolar a vibração, ajuste a tabela de isolamento de vibração até que o ruído de vibração dos pixels que cobrem a borda nítida da imagem seja menor que o ruído da captura. Os fios do equipamento na mesa devem estar soltos para evitar a transmissão das vibrações mecânicas para o osciloscópio do microscópio. Neste procedimento, prepare as fatias de cérebro de 300 a 400 mícrons de espessura de acordo com os procedimentos padrão com uma linha de camundongo expressando EGFP em células nervosas individuais de interesse com um sistema confocal de disco giratório.

Visualize os neurônios marcados com EGFP na fatia. Em seguida, selecione os neurônios com árvores axonais dendríticas intactas e com processos paralelos e próximos à superfície da fatia para imagens de potencial de membrana. Em seguida, encha uma pipeta de vidro a partir da ponta com solução intracelular sem corante até dois terços do cone do eletrodo, aplicando pressão negativa por cerca de 15 segundos.

Depois disso, preencha o eletrodo com a solução contendo o corante sensível à tensão de permeado de membrana IMP dissolvido na solução intracelular. Agora, remende um neurônio previamente selecionado dentro de um minuto após carregar o corante no eletrodo. Aplique baixa pressão positiva de cerca de 10 milímetros de mercúrio antes que a pipeta seja baixada para o banho e, ao posicionar o eletrodo na fatia, isso garante que nenhum corante vaze do eletrodo antes que a vedação seja estabelecida.

Aumente para alta pressão em torno de 100 milímetros de mercúrio pouco antes de o eletrodo entrar em contato com a superfície da célula. Estabelecendo a vedação em toda a configuração celular, permita a difusão livre do corante de uma pipeta somática para o soma por 20 a 45 minutos. Durante a difusão tingida, monitore o estado fisiológico do neurônio registrando os potenciais de ação evocados no modo de pinça de corrente.

Além disso, monitore a quantidade de coloração registrando a intensidade da luz em repouso do soma celular a uma taxa de quadros de dois quilohertz e a uma fração da intensidade total da luz ajustada com filtros de densidade neutra. Continue o processo de download até que o potencial de ação comece a se ampliar. No final da coloração, puxe cuidadosamente a pipeta de remendo para longe do soma na configuração do grampo de tensão para garantir que a transição de toda a célula para a configuração de remendo de fora para fora seja alcançada no processo.

S então incuba a fatia por mais 1,5 a duas horas em temperatura ambiente para permitir que o corante sensível à voltagem se espalhe para os processos neuronais. Depois que uma quantidade significativa de corante se difundiu do soma para os processos dendríticos e axonais, a forma de onda do potencial de ação deve ser completamente restaurada. Na próxima etapa, localize o soma do neurônio da coloração sob a fluorescência de baixa intensidade.

Reduza a intensidade da luz com filtros de densidade neutra ao mínimo necessário para visualizar o objeto de interesse usando um estágio XY Examine a área da fatia que contém o neurônio fluorescente até que o soma fluorescente seja identificado. Posicione o soma da célula corada no centro do campo do microscópio e represente o neurônio com um eletrodo de patch padrão sem corante sob o DIC. Em seguida, visualize os processos neuronais sob a fluorescência de baixa intensidade a uma taxa de quadros de 10 a 40 hertz no modo de gravação contínua do CCD para imagens de tensão.

Usando uma posição de estágio XY, o processo neuronal de interesse no meio da área de imagem. Além disso, proteja o SOMA da luz de excitação usando a íris de parada de campo parcialmente fechada do microscópio para reduzir o dano fotodinâmico. Em seguida, registre os sinais ópticos relacionados aos potenciais de ação de retropropagação nos ramos dendríticos individuais.

Em seguida, registre os sinais ópticos relacionados aos potenciais de ação no axônio. Depois disso, registre os sinais ópticos relacionados aos potenciais de ação de propagação reversa nas espinhas dendríticas. Use a taxa de quadros apropriada para uma reconstrução precisa da forma de onda do sinal.

Ao mesmo tempo, mantenha os períodos de gravação e a exposição à luz de excitação de alta intensidade o mais curtos possível para minimizar o branqueamento do corante e os danos fotodinâmicos. A gravação de sinais ópticos é mostrada aqui. Aqui. O painel superior mostra a imagem confocal de alta resolução de um neurônio corado com seu axônio na posição de gravação.

Enquanto o painel do meio mostra a imagem de fluorescência de baixa resolução espacial do axônio obtida pelo CCD usado para imagens de potencial de membrana, o painel inferior apresenta as gravações de eletrodos do soma e gravações ópticas do A IS e do nó de rvi. Os dados brutos e os sinais processados são mostrados. Esta figura mostra os sinais de potencial de ação do axônio de um neurônio cortical L cinco carregado com a ação do corante sensível à voltagem.

Sinais potenciais relacionados foram registrados a uma taxa de quadros de 10 kilohertz. Esses traços indicam o potencial de ação transitório de três locais. Um, o eletrodo que registra o soma.

Dois, as gravações ópticas da colina do axônio, e três, a gravação óptica da primeira nota de vie, e aqui estão os sinais sobrepostos dos mesmos três locais. Esta figura mostra uma explosão de quatro sinais de potencial de ação de propagação reversa de vários locais na árvore dendrítica de um neurônio cortical L cinco iniciado por pulsos curtos de corrente despolarizante a 100 hertz. Aqui são mostrados os sinais de potencial de ação de uma coluna dendrítica individual.

Aqui está a reconstrução anatômica obtida a partir de uma pilha de imagens confocais de disco giratório, e aqui está a imagem de fluorescência da mesma região obtida com a câmera CCD. Para imagens de potencial de membrana, os traços de intensidade de fluorescência correspondentes aos potenciais de ação de propagação reversa dos locais de um a três, conforme descrito na imagem CCD, são mostrados no painel direito. O traço inferior indica o registro do eletrodo do soma.

A preparação da pré-gravação leva cerca de três horas, incluindo o período de espera para que os dados se espalhem para os processos distais. O tempo de gravação é limitado pelo resumo normal da preparação e pelo dano fotodinâmico do PO. A quantidade de dano fotodinâmico é proporcional à intensidade da luz de excitação e à duração e número de tentativas de gravação individuais.

Em alguns experimentos, é possível realizar mais de 50 tentativas de gravação em uma ou duas horas. Outras medições requerem alta excitação, intensidades de luz e gravações mais longas, e são limitadas por danos fotodinâmicos a apenas várias tentativas de gravação. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar imagens de voltagem de toda a estrutura axonal e endr de neurônios individuais em fatias cerebrais.