Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro

O objetivo geral dos experimentos descritos é o monitoramento óptico da integração de sinais do potencial de membrana e do processamento de informações por uma célula nervosa individual, com resolução submicrométrica e submilissegundo em múltiplos locais de um neurônio. Isso é alcançado primeiramente montando uma configuração de imagem com sensibilidade apropriada para permitir o registro de pequenas mudanças fracionais na intensidade da luz correspondentes ao transiente do potencial de membrana. Em seguida, selecione os neurônios com anatomia apropriada para um imageamento eficaz, com processos longos e intactos em um único plano focal próximo à superfície do corte.

Em seguida, carregue os neurônios previamente selecionados com corantes sensíveis à voltagem para permitir o rastreamento óptico das alterações no potencial de membrana. Os resultados demonstram a capacidade única desta abordagem em obter informações sobre a integração de sinais elétricos por células nervosas individuais, por meio do monitoramento de sinais de potencial de membrana em axônios, dendritos e espinhos dendríticos. Na neurofisiologia celular.

Novas ferramentas estão sendo desenvolvidas devido às duas limitações de longa data da eletrofisiologia convencional: baixa resolução espacial das medições com eletrodos e incapacidade de registrar atividade em estruturas pequenas, como colaterais axônicos ou espinhas dendríticas. Para superar essas desvantagens, a abordagem com eletrodos de patch pode ser combinada com técnicas ópticas que permitem gravações paralelas de todas as partes de um neurônio. Aqui descrevemos tal técnica: gravação óptica múltipla lateral de transientes do potencial de membrana com resolução em nível de espinha única.

Neste experimento, utiliza-se um microscópio ereto e três câmeras para ajustar a iluminação uniforme. Primeiro, insira um filtro neutro de densidade apropriado no trajeto do feixe a laser. Em seguida, foque a objetiva na superfície da lâmina fluorescente padrão.

Enquanto observa a imagem CCD do campo de visão na tela do monitor, ajuste a posição da extremidade receptora da guia de luz de quartzo e a posição da extremidade de saída da guia de luz utilizando os atuadores apropriados no condensador de fluorescência epiluminiscente, a fim de obter uma iluminação centralizada e uniforme do campo de visão. Para determinar o ruído vibracional, utilize uma lâmina fluorescente padrão com uma marca não fluorescente na superfície. Registre a intensidade da luz com o CCD neuro em modo contínuo.

Foque o objetivo em uma borda escura da marca preta e registre a intensidade da luz por cerca de 100 milissegundos com uma taxa de quadros de dois quilohertz. Em seguida, exiba a média espacial dos traços da intensidade luminosa fracionada provenientes de aproximadamente 20 pixels que recebem luz de uma área uniformemente iluminada e de aproximadamente 20 pixels ao longo da borda da marca preta. O ruído excessivo na média espacial proveniente dos pixels com bordas de alto contraste reflete o ruído vibracional no sistema.

É essencial que o obturador mecânico seja montado fora da mesa de isolamento de vibrações, para que a abertura do obturador não introduza ruído vibracional na gravação óptica. Este é um passo crítico. Monte o obturador utilizando parafusos de plástico e material de isolamento de vibrações para reduzir o ruído vibracional acústico que pode ser captado pelo sistema de gravação óptica.

Para isolar a vibração, ajuste a mesa de isolamento de vibração até que o ruído de vibração dos pixels que cobrem a borda nítida da imagem seja menor que o ruído de fundo. Os cabos dos equipamentos sobre a mesa devem estar frouxos para evitar a transmissão de vibrações mecânicas ao microscópio. Neste procedimento, prepare fatias cerebrais com espessura entre 300 e 400 mícrons, de acordo com procedimentos padrão, utilizando uma linhagem de camundongo que expressa EGFP em células nervosas individuais de interesse com um sistema confocal de disco giratório.

Visualize os neurônios marcados com EGFP no corte. Em seguida, selecione os neurônios com árvores dendríticas e axonais intactas e com prolongamentos paralelos e próximos à superfície do corte para a imagem do potencial de membrana. Depois, encha uma pipeta de patch de vidro a partir da ponta com solução intracelular sem corante até dois terços da região cônica do eletrodo, aplicando pressão negativa por cerca de 15 segundos.

Em seguida, reencha o eletrodo com a solução contendo o corante sensível à voltagem do permeato da membrana IMP dissolvido na solução intracelular. Agora, realize o patch em um neurônio previamente selecionado dentro de um minuto após carregar o corante no eletrodo. Aplique uma pressão positiva baixa de cerca de 10 milímetros de mercúrio antes de abaixar a pipeta no banho e enquanto posicionar o eletrodo no corte; isso garante que nenhum corante vaze do eletrodo antes que o selamento seja estabelecido.

Aumente para uma pressão elevada de cerca de 100 milímetros de mercúrio logo antes do eletrodo entrar em contato com a superfície da célula. Ao estabelecer o selamento na configuração de célula inteira, permita a difusão livre do corante a partir de uma pipeta de patch somática até o corpo celular por 20 a 45 minutos. Durante a difusão do corante, monitore o estado fisiológico do neurônio registrando os potenciais de ação evocados no modo de fixação de corrente.

Além disso, monitore a quantidade de marcação registrando a intensidade luminosa de repouso do corpo celular com uma taxa de quadros de dois quilohertz e a uma fração da intensidade luminosa total ajustada com filtros de densidade neutra. Continue o processo de descarga até que o potencial de ação comece a se alargar. Ao final da marcação, retire cuidadosamente a pipeta de patch do corpo celular na configuração de fixação de voltagem para garantir que a transição de configuração de célula inteira para configuração de outside-out seja alcançada no processo.

Em seguida, incubar a fatia por mais 1,5 a duas horas à temperatura ambiente para permitir que o corante sensível à voltagem se espalhe pelos processos neuronais. Após uma quantidade significativa de corante ter difundido para longe do corpo celular, atingindo os processos dendríticos e axonais, a forma de onda do potencial de ação deverá ser completamente restaurada. Na próxima etapa, localizar o corpo celular do neurônio corado sob fluorescência de baixa intensidade.

Reduza a intensidade da luz com filtros de densidade neutra ao mínimo necessário para visualizar o objeto de interesse usando um estágio XY. Varra a área da fatia contendo o neurônio fluorescente até que o soma fluorescente seja identificado. Posicione o soma da célula marcada no centro do campo do microscópio e realize o selamento do neurônio com um eletrodo de patch padrão sem corante sob DIC. Em seguida, visualize os processos neuronais sob fluorescência de baixa intensidade a uma taxa de quadros de 10 a 40 hertz no modo de gravação contínua do CCD para imageamento de voltagem.

Utilizando uma posição do estágio XY, posicione o processo neuronal de interesse no centro da área de imagem. Além disso, proteja o SOMA da luz de excitação utilizando o diafragma de campo parcialmente fechado do microscópio para reduzir os danos fotodinâmicos. Em seguida, registre os sinais ópticos relacionados aos potenciais de ação propagados retrogradamente nos ramos dendríticos individuais.

Em seguida, registre os sinais ópticos relacionados aos potenciais de ação no axônio. Depois disso, registre os sinais ópticos relacionados aos potenciais de ação retrogradamente propagados nas espinhas dendríticas. Utilize a taxa de quadros apropriada para a reconstrução precisa da forma de onda do sinal.

Ao mesmo tempo, mantenha os períodos de gravação e a exposição à luz de excitação de alta intensidade tão curtos quanto possível para minimizar o desbotamento do corante e os danos fotodinâmicos. A gravação de sinais ópticos é mostrada aqui. O painel superior mostra a imagem confocal de alta resolução de um neurônio corado com seu axônio na posição de gravação.

Embora o painel central mostre a imagem de fluorescência de baixa resolução espacial do axônio obtida por CCD utilizada para a imagem do potencial de membrana, o painel inferior apresenta os registros do eletrodo do soma e os registros ópticos do AIS e do nódulo de Ranvier. Os dados brutos e os sinais processados são mostrados. Esta figura mostra os sinais do potencial de ação provenientes do axônio de um neurônio cortical L5 carregado com o corante sensível à voltagem Action.

Sinais potencialmente relacionados foram registrados com uma taxa de quadros de 10 quilohertz. Esses traços indicam o transiente do potencial de ação em três localizações. Um deles, o eletrodo que registra do soma.

Dois, as gravações ópticas do cone axonal, e três, a gravação óptica do primeiro nódulo de Ranvier, e aqui estão os sinais sobrepostos provenientes dessas mesmas três localizações. Esta figura mostra um surto de quatro potenciais de ação retropropagados registrados em múltiplas localizações na árvore dendrítica de um neurônio cortical L5, iniciado por pulsos breves de corrente despolarizante a 100 hertz. São mostrados aqui os sinais de potencial de ação provenientes de uma espinha dendrítica individual.

Aqui está a reconstrução anatômica obtida a partir de uma pilha de imagens confocais de disco giratório e aqui está a imagem de fluorescência da mesma região obtida com a câmera CCD. Para a imagem do potencial de membrana, os traços de intensidade de fluorescência correspondentes a potenciais de ação propagados retrogradamente a partir dos locais um a três, conforme delimitados na imagem CCD, são mostrados no painel direito. O traço inferior indica a gravação do eletrodo a partir do soma.

O preparo pré-gravação leva cerca de três horas, incluindo o período de espera para a disseminação dos dados aos processos distais. O tempo de gravação é limitado pela deterioração normal da preparação e pelo dano fotodinâmico do PO. A quantidade de dano fotodinâmico é proporcional à intensidade da luz de excitação, à duração e ao número de ensaios individuais de gravação.

Em alguns experimentos, é possível realizar mais de 50 ensaios de gravação ao longo de uma ou duas horas. Outras medições exigem alta excitação, intensidades de luz elevadas e gravações mais longas, sendo limitadas pelo dano fotodinâmio a apenas alguns ensaios de gravação. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a imagem de voltagem em toda a estrutura axonal e terminal de neurônios individuais em fatias cerebrais.