Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade dos canais de potássio KV sete em células musculares lisas de artérias mesentéricas recém-dissociadas e relacionar isso às medições do diâmetro arterial registradas em condições fisiológicas. Isso é realizado primeiramente pela remoção cirúrgica do arco vascular mesentérico de uma rata. O segundo passo consiste em dissecar e limpar os segmentos das artérias mesentéricas.

Em seguida, alguns segmentos são utilizados para isolar células musculares lisas individuais para medições eletrofisiológicas por grampo de tensão das correntes de potássio KV sete. O passo final é a canulação de segmentos arteriais intactos para medições miográficas sob pressão da constrição ou dilatação arterial em resposta aos moduladores farmacológicos dos canais de potássio KV sete. Em última análise, a combinação de eletrofisiologia por grampo de tensão e miografia sob pressão é utilizada para demonstrar como um aumento ou diminuição na atividade dos canais de potássio KV sete afeta a constrição arterial mesentérica.

A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de canais clonados expressos em linhagens celulares, é que as correntes são registradas a partir de células não cultivadas que expressam nativamente os canais, e as correntes KV podem ser isoladas de outras classes de canais de potássio que possam ser ativados nas mesmas células. A microssonda de pressão permite que as respostas funcionais sejam registradas a partir do mesmo tecido do qual as células isoladas são derivadas, e o método é tanto mais sensível quanto mais fisiológico do que outras preparações, como anéis ou tiras arteriais. Dr. Bareth Mani, pesquisador pós-doutorando do meu laboratório, demonstrará as técnicas de cânulação arterial e microssonda de pressão, e a Dra. Luba Brueggeman, professora assistente de pesquisa no meu laboratório, demonstrará os procedimentos de isolamento celular e de patch plan.

Para iniciar este procedimento, use uma tesoura cirúrgica para cortar um segmento de 10 a 12 centímetros em ambas as extremidades do intestino delgado de um rato. Em seguida, isole o intestino juntamente com sua vasculatura anexa. Depois, fixe o segmento do intestino delgado.

Espalhe o mesentério sobre o lado próximo da câmara de modo que o ramo principal da artéria mesentérica superior fique no centro e os ramos subsequentes irradiem a partir do centro. Em seguida, posicione os pinos somente nos segmentos intestinais visualizando por meio de um microscópio estereoscópico iluminado. Remova cuidadosamente o tecido adiposo e o tecido conjuntivo ao redor das artérias da segunda à quarta ordem próximas aos intestinos, utilizando pinças e tesouras microcirúrgicas.

Segure as veias adjacentes para facilitar a remoção do tecido adiposo e do tecido conjuntivo e evitar o estiramento desnecessário das artérias. Em seguida, transfira dois a três segmentos da artéria mesentérica para uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo dois mililitros de solução de isolamento gelada. Coloque a placa sobre gelo posteriormente e corte os segmentos da artéria mesentérica em pedaços de três a quatro milímetros de comprimento usando uma pipeta com ponta polida ao fogo.

Transfira os segmentos arteriais para um frasco de vidro contendo dois mililitros de solução de isolamento pré-aquecida a 37 graus Celsius. Em seguida, incube por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após 30 minutos, aspire cuidadosamente a solução de isolamento a 37 graus Celsius com uma pipeta posterior.

Adicione dois mililitros de solução enzimática morna, seguido de uma incubação de 35 minutos a 37 graus Celsius. Imediatamente após a incubação de 35 minutos na solução enzimática, coloque o frasco sobre gelo, aspire a solução enzimática e adicione dois mililitros de solução de isolamento gelada. Repita este procedimento quatro vezes.

Em seguida, em um mililitro de solução de isolamento gelada, itere suavemente os segmentos arteriais com a pipeta posterior polida de 10 a 20 vezes para liberar células individuais do músculo liso da artéria mesentérica. Verifique periodicamente a aparência dos miócitos colocando uma gota da suspensão celular em uma placa de 35 milímetros e observando-as ao microscópio.

As CMLs de MA saudáveis devem apresentar uma aparência alongada e lisa. Em seguida, transfira aproximadamente de 100 a 200 microlitros da suspensão celular para a câmara de gravação com uma pipeta Pasteur polida e deixe as células aderirem por 15 minutos. Nesta etapa, encha a ponta da pipeta de patch com solução interna livre de anfotericina B, mergulhando a ponta da pipeta nela.

Em seguida, aplique sucção na outra extremidade usando uma seringa de 10 mililitros conectada por um pedaço de tubo, adicionando a solução do pipetador contida no frasco B pela parte superior. Utilize uma ponteira de micropipeta tipo microloader até que a pipeta esteja aproximadamente pela metade cheia de solução. Remova quaisquer bolhas de ar batendo suavemente na pipeta.

Em seguida, insira a pipeta no suporte do eletrodo. Utilize um micromanipulador para posicionar a pipeta na superfície de um miócito alongado. Quando a resistência da pipeta aumentar para seis a 10 megaohms, aplique sucção para obter um selo giga.

Ao mesmo tempo, ajuste a voltagem de retenção para zero milivolts enquanto aguarda a perfuração da membrana. Em seguida, aplique passos de voltagem de 100 milissegundos para mais 10 milivolts e depois para menos 10 milivolts. Use o amplificador para compensar o transitório rápido de capacitância da pipeta simultaneamente ao aparecimento da capacitância de célula inteira.

Correntes positivas pequenas e sustentadas transitórias de dois a 10 picoampères, puras e de amplitude, indicam a presença de canais KV7 funcionais. A perfuração bem-sucedida com anfotericina B reduzirá a resistência de acesso a 35 megaohms ou menos. Para registrar a relação corrente-voltagem dos canais KV7, aplique degraus de voltagem de cinco segundos a voltagens que variam de menos 84 milivolts, em que a probabilidade de abertura dos canais KV7 é mínima, até mais 16 milivolts, em que a probabilidade de abertura dos canais KV7 atinge um platô. Após cinco segundos em cada voltagem de teste, retorne à voltagem de retenção de menos 4 milivolts por 10 segundos.

Neste procedimento, suspenda vagamente dois fios de sutura de náilon finos pré-confeccionados em cada lado. Adjacente à cânula de vidro, transfira cuidadosamente o segmento da artéria mesentérica dissecado da câmara de dissecação para a câmara de miógrafo de pressão, segurando uma extremidade do segmento com um par de pinças microcirúrgicas. Em seguida, visualizando por meio de um microscópio estereoscópico iluminado, segure uma extremidade do segmento arterial e deslize-o suavemente sobre a cânula de vidro esquerda.

Fixe a extremidade usando os pontos de náilon. Em seguida, lave suavemente o fluido do lúmen através do vaso montado para remover o sangue e os detritos. A válvula da seringa esquerda deve então ser fechada, de modo que este lado apresente uma coluna estática de fluido contra a qual a pressão é ajustada a partir do lado direito; usando o micromanipulador, posicione a cânula de vidro móvel da direita mais próxima do segmento arterial e puxe a extremidade direita do segmento sobre ela.

Finalmente, fixe o segmento arterial com suturas de náilon e corte os excessos dos fios de sutura. Agora, monte a unidade de gráfico de pressão sobre a platina, acima do microscópio de micrografia de pressão. Conecte a coluna de pressão ao lado direito da câmara de gráfico e, em seguida, coloque a tampa sobre a câmara.

Eleva-se gradualmente a seringa de 10 mililitros ao longo de um período de 15 minutos e verifica-se a presença de vazamentos no vaso até que o transdutor de pressão P1 indique 80 milímetros de mercúrio; ajusta-se a distância entre a cânula quando necessário, de modo que o segmento arterial pressurizado fique aproximadamente reto e forme um padrão semelhante a um ombro nos pontos onde são feitos os laços. Verifica-se a viabilidade do vaso montado mediante superfusão transitória com cloreto de potássio 60 milimolar por 30 segundos. Um vaso viável contrai-se rapidamente com a adição de cloreto de potássio e dilata-se imediatamente após sua remoção.

Em seguida, adicione a substância-teste concentrada diretamente à solução do banho, pipetando suavemente para frente e para trás próximo à extremidade da câmara para misturar a substância-teste na solução do banho, obtendo a concentração final apropriada na câmara de 10 mililitros. As alterações no diâmetro do vaso após a adição da substância-teste podem ser monitoradas na imagem de vídeo em tempo real e também registradas na janela de análise de imagem durante a realização do experimento. Esta figura mostra uma série de traçados de corrente sequenciais registrados em resposta a degraus de voltagem antes do tratamento, mostrados em preto, e após a estabilização na presença de 100 nanomolares de zinco perion em um único miócito de artéria mesentérica, mostrados em vermelho; aqui estão as correntes representativas para o controle e para 100 nanomolares de zinco perion.

As barras cinzas indicam o intervalo de tempo em que foram medidas as amplitudes médias da corrente. Para os gráficos de corrente versus voltagem, as voltagens em degrau são indicadas à direita pelas cabeças de seta. Este é o curso temporal do aumento da corrente KV sete por 100 nanomolares de íon zinco, medido com clampeamento de voltagem contínuo em menos 20 milivolts, conforme mostrado. Aqui estão as curvas médias de corrente versus voltagem derivadas das densidades de corrente KV sete registradas antes e durante o tratamento com 100 nanomolares de íon zinco, e durante o tratamento com 10 micromolares do bloqueador do canal KV sete XC 9 9 1. Relaxamento induzido por íon zinco em artéria mesentérica pré-constrita com 100 picomolares de arginina vasopressina.

Esta figura mostra a evolução temporal das alterações no diâmetro externo do vaso em resposta à aplicação de 100 picomolares de arginina vasopressina, seguida pela aplicação de 100 nanomolares de íon zinco. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar artérias para o isolamento de células individuais ou para a medição miográfica sob pressão da constrição arterial e das respostas de dilatação. Além disso, você deverá saber como registrar correntes KV sete isoladas de outras correntes em miócitos arteriais recém-isolados.