Name: Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Aprenda a medir a atividade dos canais de potássio Kv7 em células musculares lisas de artéria mesentérica de rato usando eletrofisiologia de patch clamp e miografia de pressão. Este método correlaciona a atividade iônica com mudanças no diâmetro arterial.

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Este trabalho foi financiado por uma concessão do National Heart, Lung, and Blood Institute (NIH R01-HL089564) para KLB e pré-doutoramento da American Heart Association (09PRE2260209) e J. Arthur Schmitt Fundação BKM.

<ol><li>Passmore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ%2FM+Currents+in+Sensory+Neurons%3A+Significance+for+Pain+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy.</a> J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).</li>
<li>Falloon, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+artery+sensitivity+and+morphology+in+pressurized+and+wire-mounted+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).</li>
<li>Dunn, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+artery+sensitivity+to+agonists+under+isobaric+compared+with+isometric+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).</li>
<li>Buus, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sensitivity+of+rat+mesenteric+small+arteries+to+agonists+when+studied+as+ring+preparations+or+as+cannulated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations.</a> Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).</li>
<li>Abdelhalim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+big+endothelin-1+in+comparison+with+endothelin-1+on+the+microvascular+blood+flow+velocity+and+diameter+of+rat+mesentery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo.</a> Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).</li>
<li>Altura, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+relationships+for+arginine+vasopressin+and+synthetic+analogs+on+three+types+of+rat+blood+vessels%3A+possible+evidence+for+regional+differences+in+vasopressin+receptor+sites+within+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).</li>
<li>Henderson, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin-induced+vasoconstriction%3A+two+concentration-dependent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways.</a> J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).</li>
<li>Mackie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+KCNQ+potassium+channels+as+novel+targets+for+the+control+of+mesenteric+artery+constriction+by+vasopressin%2C+based+on+studies+in+single+cells%2C+pressurized+arteries%2C+and+in+vivo+measurements+of+mesenteric+vascular+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).</li>
<li>Brueggemann, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+selective+cyclooxygenase-2+inhibitors+on+vascular+smooth+muscle+ion+channels+may+account+for+differences+in+cardiovascular+risk+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles.</a> Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Patch+Clamp+Technique%22">Patch Clamp Technique</a>. Kaneez, F. S. , Intech. (2012).</li>
<li>Berra-Romani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+voltage-gated+Na%2B+channels+are+expressed+in+mesenteric+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos e abordagens experimentais aqui descritas são bastante robustos e podem produzir resultados claros e reprodutíveis quando aplicado com atenção meticulosa aos detalhes. Boas gravações electrofisiológicos e constrição / dilatação dos segmentos arteriais são dependentes da saúde das células e os segmentos de artéria, respectivamente. Preparações de células pode variar de dia para dia, mesmo usando o mesmo protocolo. Soluções de isolamento podem ser utilizadas durante até 2 semanas, mas, se a qualidade da prepara...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> Solução Dissecando: 145 Solução do banho de Eletrofisiologia *: 140 Solução interna para eletrofisiologia: 10 Solução de isolamento para os miócitos *: 140 Solução do banho para Miografia pressão: 145 Solução lúmen para Miografia pressão: 145 </td></tr><tr><td> Cloreto de potássio </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> Solução Dissecando: 4,7 Solução do banho de Eletrofisiologia *: 5,36 Solução interna para eletrofisiologia: 135 Solução de isolamento para os miócitos *: 5,36 Solução do banho para Miografia pressão: 4,7 Solução lúmen para Miografia pressão: 4,7 </td></tr><tr><td> EGTA de potássio </td><td> Sigma </td><td> E4378 </td><td> Solução interna para eletrofisiologia: 0,05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H9136 </td><td> Solução do banho de Eletrofisiologia *: 10 Solução interna para eletrofisiologia: 10 Solução de isolamento para os miócitos *: 10 </td></tr><tr><td> Hidrogenofosfato dissódico </td><td> Sigma </td><td> S5136 </td><td> Solução de isolamento para os miócitos *: 0,34 </td></tr><tr><td> Hidrogeno-fosfato de potássio </td><td> Sigma </td><td> P5655 </td><td> Solução de isolamento para os miócitos *: 0,44 </td></tr><tr><td> Cloreto de Magnésio </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> Solução do banho de Eletrofisiologia *: 1,2 Solução interna para eletrofisiologia: 1 Solução de isolamento para os miócitos *: 1,2 </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma </td><td&gt; C7902 </td><td> Solução do banho de Eletrofisiologia *: 2 Solução de isolamento para os miócitos *: 0,05 </td></tr><tr><td> Fosfato de sódio </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP331-1 </td><td> Solução Dissecando: 1,2 Solução do banho para Miografia pressão: 1,2 Solução lúmen para Miografia pressão: 1,2 </td></tr><tr><td> Sulfato de magnésio </td><td> Sigma </td><td> M2643 </td><td> Solução Dissecando: 1,17 Solução do banho para Miografia pressão: 1,17 Solução lúmen para Miografia pressão: 1,17 </td></tr><tr><td> MOPS </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP308 </td><td> Solução Dissecando: 3 Solução do banho para Miografia pressão: 3 Solução lúmen para Miografia pressão: 3 </td></tr><tr><td> Ácido pirúvico </td><td> Sigma </td><td> P4562 </td><td> Solução Dissecando: 2 Solução para banhoMiografia pressão: 2 Solução lúmen para Miografia pressão: 2 </td></tr><tr><td> Dihidratado EDTA </td><td> Research Organics </td><td> 9572E </td><td> Solução Dissecando: 0,02 Solução do banho para Miografia pressão: 0,02 Solução lúmen para Miografia pressão: 0,02 </td></tr><tr><td> D-Glucose </td><td> Sigma </td><td> G7021 </td><td> Solução Dissecando: 5 Solução do banho de Eletrofisiologia *: 10 Solução interna para eletrofisiologia: 20 Solução de isolamento para os miócitos *: 10 Solução do banho para Miografia pressão: 5 Solução lúmen para Miografia pressão: 5 </td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> Sigma </td><td> A3912 </td><td> Solução Dissecando: 1% Lumen solução para Miografia pressão: 1% </td></tr><tr><td> pH </td><td></td><td></td><td> Dissecando Solution: 7.4 Solução do banho de Eletrofisiologia *: 7,3 Solução interna para eletrofisiologia: 7,2 Solução de isolamento para os miócitos *: 7,2 Solução do banho para Miografia pressão: 7,4 Solução lúmen para Miografia pressão: 7,4 </td></tr><tr><td> Osmolaridade </td><td></td><td></td><td> Solução Dissecando: 300 Solução do banho de Eletrofisiologia *: 298 Solução interna para eletrofisiologia: 298 Solução de isolamento para os miócitos *: 298 Solução do banho para Miografia pressão: 300 Solução lúmen para Miografia pressão: 300 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 11 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. Componentes das soluções utilizadas no experimento. </td></tr></tbody></table>

explorando arterial músculo liso kv7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e miografia pressão

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contracção ou relaxamento das células do músculo liso nas paredes das artérias de resistência determina o diâmetro da artéria e, assim, controla o fluxo de sangue através do vaso e contribui para a pressão arterial sistémica. O processo de contracção é regulado principalmente pela concentração de cálcio citosólico ([Ca 2 +] cit), que por sua vez é controlada por uma variedade de transportadores de iões e de canais. Canais iônicos são intermediários comuns em vias de transdução de sinal ativadas por hormônios vasoativas para efetuar vasoconstrição ou vasodilatação. E canais de iões são frequentemente alvo de agentes terapêuticos, quer intencionalmente (por exemplo, bloqueadores de canal de cálcio utilizado para induzir a vasodilatação e baixa pressão arterial) ou não intencionalmente (por exemplo, para induzir a indesejados efeitos secundários cardiovasculares). KV7 (KCNQ) dos canais de potássio activados têm sido recentemente implicada como targ fisiológico e terapêutico importanteets para a regulação da contração do músculo liso. Para elucidar as funções específicas de canais em ambos KV7 transdução de sinal fisiológico e na acção dos agentes terapêuticos, é necessário estudar o modo como a sua actividade é modulada a nível celular, bem como de avaliar a sua contribuição no contexto da artéria intacta. As artérias mesentéricas de rato proporcionar um sistema modelo útil. As artérias podem ser facilmente dissecados, limpos de tecido conjuntivo, e usada para preparar isolados miócitos arteriais em patch clamp electrofisiologia, ou canulada e pressurizado para medições de vasoconstritor / vasodilatador respostas sob condições relativamente fisiológicas. Aqui descrevemos os métodos utilizados para ambos os tipos de medições e fornecer alguns exemplos de como o projeto experimental pode ser integrado para fornecer uma compreensão mais clara dos papéis desses canais iônicos na regulação do tônus ​​vascular.

Medidas do KV7 atividade do canal (KCNQ) de potássio em miócitos isolados arteriais (usando patch braçadeira técnicas eletrofisiológicas) em paralelo com medidas de constritores / dilatador respostas (usando Miografia pressão) pode revelar informações importantes sobre os papéis do KV7 canais em fisiologia do músculo liso vascular e farmacologia.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

A contração ou o relaxamento das células musculares lisas nas paredes das artérias de resistência determina o diâmetro da artéria e, consequentemente, controla o fluxo de...

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade dos canais de potássio KV sete em células musculares lisas de artérias mesentéricas recém-dissociadas e relacionar isso às medições do diâmetro arterial registradas em condições fisiológicas. Isso é realizado primeiramente pela remoção cirúrgica do arco vascular mesentérico de uma rata. O segundo passo consiste em dissecar e limpar os segmentos das artérias mesentéricas.Em seguida, alguns segmentos são utilizados para isolar células musculares lisas individuais para medições eletrofisiológicas por grampo de tensão das correntes de potássio KV sete. O passo final é a canulação de segmentos arteriais intactos para medições miográficas sob pressão da constrição ou dilatação arterial em resposta aos moduladores farmacológicos dos canais de potássio KV sete. Em última análise, a combinação de eletrofisiologia por grampo de tensão e miografia sob pressão é utilizada para demonstrar como um aumento ou diminuição na atividade dos canais de potássio KV sete afeta a constrição arterial mesentérica.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como o uso de canais clonados expressos em linhagens celulares, é que a

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Biologia

Corrente iônica de canais BK é gravado usando técnicas de patch clamp. Canais BK são expressos...

Grampo patch e Técnicas de Perfusão para estudar canais iônicos Expresso em Xenopus Oócitos

Kv canal disfunção está associada a arritmias cardíacas. Para estudar os mecanismos moleculares que conduzem à ocorrência de arritmias tais que utilizam um protocolo sistemático para o isolamento dos cardiomiócitos atriais e ventriculares do canal Kv auxiliares ratinhos knockout de subunidade. Cardiomiócitos isolados podem então ser imediatamente utilizados para celulares estudos eletrofisiológicos, bioquímicos ou imunofluorescência (IF) ensaios.

Isolamento e gravações de canais Kv em Murino cardiomiócitos atriais e ventriculares

Aqui, descrevem o isolamento de cardiomyoctyes ratinho adulto usando um sistema de perfusão de Langendorff. As células resultantes são Ca2 +-tolerantes, electricamente quiescente e podem ser cultivadas e transfectadas com lentivírus para manipular a expressão de genes ou vírus adeno-. A sua funcionalidade, também pode ser analisada utilizando o sistema de MMSYS e técnicas de fixação de membranas.

Isolamento, cultura e caracterização funcional de rato adulto Cardiomyoctyes

Miografia pressão é utilizado para avaliar a vasoactividade das pequenas artérias que se desenvolvem constrição prolongada quando pressurizado. Este manuscrito proporciona um protocolo detalhado para avaliar em segmentos isolados de pequenas artérias mesentéricas de ratos, vasoactividade e o efeito da pressão intraluminal no diâmetro vascular.

Avaliando Miogênica Resposta e vasoactividade em artérias mesentéricas de resistência Usando Miografia Pressão

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

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Este protocolo descreve um método rápido e eficiente para isolar células musculares lisas da artéria basilar de rato e registrar as correntes retificadoras internas dos canais de potássio nessas células usando a técnica de patch clamp de células inteiras. Ele oferece uma nova abordagem para pesquisadores que estudam a artéria basilar e os canais iônicos.

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Aprenda a medir a atividade dos canais de potássio Kv7 em células musculares lisas de artéria mesentérica de rato usando eletrofisiologia de patch clamp e miografia de pressão. Este método correlaciona a atividade iônica com mudanças no diâmetro arterial.

Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

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