Explorando Arterial Músculo Liso KV7 função dos canais de potássio utilizando electrofisiologia patch clamp e Miografia Pressão

O objetivo geral deste procedimento é medir a atividade dos sete canais de potássio KV em células musculares lisas da artéria mesentérica recém-dissociadas e relacioná-la com as medidas do diâmetro arterial registradas em condições fisiológicas. Isso é feito removendo primeiro cirurgicamente a arcada vascular mesentérica de um rato. O segundo passo é dissecar e limpar os segmentos das artérias mesentéricas.

Em seguida, alguns segmentos são usados para isolar células musculares lisas individuais para medições eletrofisiológicas de patch clamp de correntes de potássio KV sete. A etapa final é a canulação de segmentos arteriais íntegros para medições de pressão mio-constrição ou dilatação arterial em resposta aos moduladores farmacológicos dos sete canais de potássio do KV. Em última análise, a combinação de eletrofisiologia de patch clamp e miografia de pressão é usada para mostrar como um aumento ou diminuição na atividade dos sete canais de potássio do KV afeta a constrição arterial mesentérica.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o uso de canais clones expressos em linhagens celulares, é que as correntes são registradas a partir de células não cultivadas que expressam nativamente os canais e as correntes KV podem ser isoladas de outras classes de canais de potássio que podem ser ativados nas mesmas células. A miografia de pressão permite que as respostas funcionais sejam registradas a partir do mesmo tecido do qual as células isoladas são derivadas, e o método é mais sensível e mais fisiológico do que outras preparações, como anéis arteriais ou tiras arteriais. O Dr. Bareth Mani, um pós-doutorando do meu laboratório, demonstrará as técnicas de canulação arterial e miografia de pressão e a Dra. Luba Brueggeman, professora assistente de pesquisa em meu laboratório, demonstrará os procedimentos de isolamento celular e plano de adesivo.

Para iniciar este procedimento, use uma tesoura cirúrgica para cortar um segmento de 10 a 12 centímetros em ambas as extremidades do intestino delgado de um rato. Em seguida, isole o intestino junto com sua vasculatura anexada. Em seguida, fixe o segmento do intestino delgado.

Espalhe o mesentary sobre o lado mais próximo da câmara, de modo que o ramo primário da artéria mesentérica superior esteja no centro e a ordem subsequente dos ramos irradie do centro. Em seguida, coloque os pinos apenas nos segmentos intestinais visualizando através de um microscópio de dissecação iluminado. Limpe cuidadosamente o tecido adiposo e o tecido conjuntivo ao redor das artérias de segunda a quarta ordem próximas aos intestinos usando microfórceps e tesouras.

Segure as veias adjacentes para facilitar a limpeza do tecido adiposo e do tecido conjuntivo e evitar o alongamento desnecessário das artérias. Agora transfira dois a três segmentos da artéria mesentérica para uma placa de cultura de tecidos de 35 milímetros contendo dois mililitros de solução de isolamento gelada. Coloque o prato no gelo depois, corte os segmentos da artéria mesentérica em pedaços de três a quatro milímetros de comprimento usando um PEs sua pipeta com uma ponta polida a fogo.

Transfira os segmentos arteriais para um frasco de vidro contendo dois mililitros de solução de isolamento pré-quente a 37 graus Celsius. Em seguida, incube-o por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após 30 minutos, aspire cuidadosamente a solução de isolamento a 37 graus Celsius com uma pipeta posterior.

Adicione dois mililitros de solução enzimática quente e incube por 35 minutos a 37 graus Celsius. Imediatamente após a incubação de 35 minutos na solução enzimática, coloque o frasco sobre gelo, aspire a solução enzimática e adicione dois mililitros de solução de isolamento gelada. Repita este procedimento quatro vezes.

Em seguida, em um mililitro de solução de isolamento gelada, itere suavemente os segmentos arteriais com a pipeta posterior polida. 10 a 20 vezes para liberar células musculares lisas individuais da artéria mesentérica. Verifique a aparência dos miócitos periodicamente, colocando uma gota da suspensão celular em uma placa de 35 milímetros e visualizando-os ao microscópio.

Os SMCs MA saudáveis devem ter uma aparência alongada e suave. Em seguida, transfira aproximadamente 100 a 200 microlitros de suspensão de células para a câmara de registro com uma pipeta pastier polida e deixe as células aderirem por 15 minutos. Nesta etapa, encha a ponta da pipeta de adesivo com anfotericina B, solução interna livre, inclinando a ponta da pipeta nela.

Em seguida, aplique a sucção na outra extremidade usando uma seringa de 10 mililitros conectada por meio de um pedaço de tubo e adicione a solução de pipeta de cima para baixo. Usando um micro carregador einor, coloque a ponta da pipeta até que a pipeta esteja cheia até a metade com a solução. Remova quaisquer bolhas de ar batendo suavemente na pipeta.

Depois disso, insira a pipeta no suporte do eletrodo. Use um micromanipulador para abaixar a pipeta até a superfície de um miócito alongado. Quando a resistência da pipeta aumentar para seis a 10 mega ohms, aplique sucção para obter uma vedação giga.

Ao mesmo tempo, defina a tensão de retenção para zero milivolts enquanto aguarda a perfuração da membrana. Em seguida, aplique etapas de tensão de 100 milissegundos para mais 10 milivolts e depois para menos 10 milivolts. Use o amplificador para compensar o transiente de capacitância da pipeta rápida simultâneo com o aparecimento de capacitância de célula inteira.

Correntes positivas sustentadas pequenas transitórias de dois a 10 PICO amp, puras e amplitude indicam a presença de KV funcional de sete canais. A perfuração bem-sucedida com anfotericina B reduzirá a resistência de acesso para 35 mega ohms ou menos. Para registrar a relação de tensão de corrente KV sete, aplique etapas de tensão de cinco segundos a tensões que variam de menos 84 milivolts em que a probabilidade aberta de KV sete canais é mínima a mais 16 milivolts em que a probabilidade aberta de KV sete canais atinge um platô Após cinco segundos em cada tensão de teste, volte para a tensão de retenção em menos quatro milivolts por 10 segundos.

Neste procedimento, suspenda frouxamente duas suturas de náilon fino pré-fabricadas de cada lado. Adjacente à cânula de vidro, transferiu cuidadosamente o segmento da artéria mesentérica dissecada da câmara de dissecação para a câmara de enxerto de pressão, segurando uma extremidade do segmento usando um par de micropinças. Em seguida, visualizando através de um microscópio de dissecação iluminado, segure uma extremidade do segmento da artéria e deslize-o suavemente sobre a cânula de vidro esquerda.

Prenda a extremidade usando as suturas de náilon. Em seguida, lave suavemente o fluido do lúmen através do vaso montado para remover sangue e detritos. A válvula para a seringa esquerda deve então ser fechada de forma que este lado apresente uma coluna estática de fluido contra a qual a pressão é ajustada do lado direito, usando o micro manipulador posicione a cânula de vidro direita móvel mais próxima do segmento da artéria e puxe a extremidade direita do segmento sobre ela.

Finalmente, prenda o segmento da artéria com suturas de náilon e prenda o excesso de fios de sutura. Agora monte a unidade de gráfico de pressão no palco sobre o microscópio de micrografia de pressão. Conecte a coluna de pressão ao lado direito da câmara gráfica e, em seguida, coloque a tampa sobre a câmara.

Levante gradualmente a seringa de 10 mililitros por um período de 15 minutos e verifique se há vazamentos no vaso até que o transdutor de pressão P one leia 80 milímetros de mercúrio, ajuste a distância entre a cânula quando necessário, a distância deve ser ajustada de forma que o segmento da artéria pressurizada seja aproximadamente reto e forme um padrão semelhante a um ombro onde os laços são feitos. Verificar a viabilidade do vaso montado por superfusão transitória com cloreto de potássio a 60 milimolares durante 30 segundos. Um vaso viável se contrai rapidamente com a adição de cloreto de potássio e se dilata imediatamente após sua lavagem.

Em seguida, adicionar a substância de ensaio concentrada à solução de banho pipetá-la directamente para a frente e para trás suavemente perto da extremidade da câmara para misturar a substância de ensaio na solução de banho, obtendo-se a concentração final adequada na câmara de 10 mililitros. As alterações de volume no diâmetro do vaso após a adição da substância de ensaio podem ser monitorizadas na imagem de vídeo em direto e também representadas na janela de análise de imagem enquanto a experiência está em curso. Esta figura mostra uma família de traços de corrente sequencial registrados em resposta a passos de tensão antes do tratamento, conforme mostrado em preto e após a estabilização na presença de 100 nanomolares de zinco perion em um único miócito da artéria mesentérica, conforme mostrado em vermelho, aqui estão as correntes representativas para controle e para 100 nanomolares de zinco perion.

As barras cinzas indicam o intervalo de tempo em que as amplitudes médias de corrente foram medidas Para gráficos de tensão de corrente, as tensões de passo são indicadas à direita por pontas de seta. Este é o curso de tempo do aumento de corrente KV sete por 100 nanomolares de zinco perion medido com grampo de tensão contínua a menos 20 milivolts. Mostrado. Aqui estão as curvas médias de tensão de corrente derivadas de KV sete densidades de corrente registradas antes durante o tratamento com 100 nanomolares de zinco périon e durante o tratamento com 10 micromolares do bloqueador de sete canais KV XC 9 9 1 relaxamento induzido por íons de zinco da artéria mesentérica pré-contraída com 100 picomolar arginina vasopressina.

Esta figura mostra o curso temporal das mudanças no diâmetro externo do vaso em resposta à aplicação de 100 picomolares arginina vasopressina, seguida pela aplicação de 100 nanomolares de íon zinco. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como preparar as artérias para o isolamento de células individuais ou para a medição miográfica da pressão da constrição arterial, respostas dilatadoras. Além disso, você deve saber como registrar as correntes KV sete isoladamente de outras correntes em miócitos arteriais recém-isolados.