Name: Criação e injeção de Manduca sexta As larvas para avaliar a virulência bacteriana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Aprenda a avaliar a patogenicidade bacteriana em larvas de Manduca sexta por injeção direta na hemolinfa. Este método permite analisar interações hospedeiro-patógeno e determinar a virulência de cepas bacterianas.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do laboratório Goodrich-Blair: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, e Youngjin Parque por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation concessão IOS-0950873 e os Institutos Nacionais de Saúde NRSA comunhão FAI084441Z.

1. Esterilização ovo do inseto e criação <ol><li> Na preparação de dietas, primeiro autoclave 15 g de agar fornecida em 900-1.000 ml de H 2 O. Imediatamente após a mistura em autoclave, com 166 g de dieta de gérmen de trigo e de mistura bem em um misturador de laboratório. Despeje em um prato (ou pratos) para esfriar, em seguida, transferir dieta para folha de alumínio, enrole firmemente, loja e a 4 ° C. </li><li> Após a chegada, esterilizar M. Sexta ovos com 250 ml de solução de lixívia a 0,6% durante 2-3 min em um suporte de filtro de vidro e um aparelho com um frasco de vácuo de papel filtro de 90 milímetros, agitando ocasionalmente. </li><li> Ligue vácuo a drenagem da solução de lixívia de lavagem e ovos 3-4 vezes com 250 ml estéril H2O destilada por lavagem. </li><li> Transferir os ovos para 90 mm de papel de filtro fresco colocado numa placa de Petri tampa e deixe secar até que já não vara juntos (cerca de 20-30 min). </li><li> Transferir os ovos para a parte inferior dos recipientes de plástico com uma dieta de insectos, colocando aproximadamente 40 ovos em cada recipiente(Figura 1A). Os ovos são separados a partir da dieta para prevenir a humidade induzida contaminação fúngica. Manter os ovos, a 26 ° C com uma luz hr 16: 8 horas fotoperíodo escuro. Ovos irá iluminar a uma cor amarelo-branco antes da eclosão. </li><li> Quando incubação estiver completa, transferir cuidadosamente cerca de 25 larvas cada uma para novos recipientes com dieta sobre a parte inferior (Figura 1B). É importante para pegar cada larva pelo chifre longo preto usando uma pinça para evitar prejudicá-los durante suas frágeis primeiras fases de desenvolvimento. Incubar durante 2 dias, como anteriormente. Embora a morte larval é incomum nesta fase, alguns mortos ou, mais provavelmente, larvas developmentally atrofiado pode ser observado. Tais insectos devem ser excluídos do estudo e sacrificados por congelamento. </li><li> Para evitar os comportamentos de canibalismo, larvas de transferência para recipientes individuais, com pequenos pedaços de comida (Figura 1C) e incubar como acima. Acompanhar o desenvolvimento do inseto, fezes substituindo alimentos e limpeza UOt de embalagens de todos os dias até que eles sofrem a muda larval terceiro (geralmente 6-9 dias após a eclosão). Esta é a 4 º instar larval, caracterizada pelo aparecimento de preto do gancho como crochets em cada proeminência proleg e aumento de listras ao longo do corpo de insectos (Figura 1D). As larvas podem variar consideravelmente de tamanho, mas normalmente pesam 0,15-,4 g ao entrar na 4 ª etapa estádio. Larvas de tamanho similar deve ser escolhido para injecção. </li></ol> 2. Preparação de bactérias para Injeção <ol><li> Crescer a estirpe bacteriana (s) a ser testado de acordo com os procedimentos padrão para a fase de crescimento que pretende testar. </li><li> Pellet ul 500 de cada estirpe bacteriana a ser testado por fiação durante 2 min numa microcentrífuga a 13.000 rpm, à temperatura ambiente. </li><li> Ressuspender as células em 1 ml de fosfato salino tamponado estéril 1x (PBS) e de pelotas de novo como acima. </li><li> Ressuspender as células em 0,5 ml de 1x PBS estéril e meacerteza a densidade óptica (DO) da suspensão. Diluir todas as suspensões para o mesmo diâmetro externo, se necessário. Meio de crescimento estéril pode também ser utilizado para a ressuspensão das células e diluição em lugar de 1x PBS, se desejado. </li></ol> 3. Injeção de 4 larvas ínstares <ol><li> Prepare seriais diluições de 10 vezes da primeira estirpe bacteriana em 6 poços de uma placa de microtitulação de 96 poços em PBS 1x estéril, utilizando-se uma ponta de pipeta nova para cada diluição (Figura 2A). O volume final da suspensão de células em cada poço deve exceder o volume necessário para a injecção (10 ul por insectos) mais 20 uL para a placa de inoculo (ver passos 3.2 e 3.7). </li><li> Ul 10 cada ponto durante 5 diluições (10 ~ 2 a 10 -6) ao longo do topo de uma placa de Petri contendo um meio de crescimento adequado. Inclinar a placa, de modo que os pontos se espalhar para o centro (Figura 2B). </li><li> Remover dieta de insetos e fezes e insetos lugar em recipientes com gelo paracerca de 5 min. </li><li> Esterilizar a agulha da seringa, por lavagem 3 vezes cada em 2 tubos de etanol 70-100%, seguido de um tubo estéril de H 2 O (Figura 2C). O volume do líquido deve ser suficiente para submergir a agulha. </li><li> Quantificar as suspensões de células diluídas sob um microscópio usando um hemocitómetro. Dependendo do inoculo desejado, extrair 10 ul do microtitulação bem apropriado (Figura 2D). </li><li> Cotonete superfície do insecto com etanol a 95%, e injectar a 10 ml de suspensão celular para o insecto a um ângulo (inferior a 45 °) para trás a uma das patas falsas abdominais. Tome cuidado para não perfurar o intestino e injetar o conteúdo logo abaixo da camada epidérmica (Figura 2E). Embora alguma perda de hemolinfa (líquido límpido, verde, azul) é normal, as partículas eo líquido amarelo que emerge do local de injecção são indicativos de punção do intestino. Se isso ocorrer, sacrificar o insecto e obter um novo larva de recolocá-lo. </li><li> Repetir o passo 3.6 para cada insecto remanescente no grupo da primeira injecção. Agulha de esterilização não é necessária entre cada insecto injectado com a mesma diluição e estirpe de bactérias a menos que a contaminação ocorre. Alternativamente, um dispensador de repetição podem ser usados ​​para uma maior consistência no volume de injecção, entre as amostras. </li><li> Após a injecção de cada insecto com a primeira linhagem de bactérias, repita a etapa 3.2, desta vez manchar as suspensões de células no meio do prato e deixá-los fluir para a parte inferior (Figura 2F). Incubar as placas a temperatura adequada e contar colônias para enumerar o inóculo. Esta etapa de revestimento segundo é usado para verificar que as amostras não foram contaminadas durante o processo de injecção, uma vez que tal resultará em números de colónias diferentes entre os primeiro e segundo revestimentos. </li><li> Repita os passos 3.1 a 3.8 para cada estirpe de bactérias no experimento. Finalmente, injetar 3-5 com insetos estéreis 1x PBS usando uma sterile agulha como grupo controle negativo. Incubar os insectos a 26 ° C com uma luz hr 16: 8 hr fotoperíodo escuro. </li><li> Monitorar sobrevivência do inseto ao longo do tempo após a injeção. Morte de insectos é caracterizada como uma falta de movimento voluntário após estimulação. Insetos freqüentemente apresentam perda de apetite, diarreia (fezes, aguado amarelo), e / ou perda de água (&quot;suor&quot;) durante a infecção antes da morte; essas características pode-se notar também. </li></ol>

<ol><li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li>
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<li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li>
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<li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A injecção directa de M. sexta larvas com bactérias entomopatogênicos, como aqui descrito, serve como um meio simples e eficaz para analisar a virulência bacteriana. O método também é altamente adaptável para se adequar a diferentes sujeitos experimentais e / ou condições. As bactérias podem ser preparados de várias maneiras, antes da injecção. No caso de X. nematophila, células selvagens cultivadas em rico em nutrientes Luria-Bertani (LB) até meados de log-fase são tipicamente o mais virulento, matand...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Papel de 90 milímetros filtro </td><td> Whatman </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Vidro do porta-filtro </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta ovos </td><td> Carolina Alimentação Biológica </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Dieta Gypsy Moth agar + </td><td> Biomedicals MP </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 onças recipientes de plástico e tampas </td><td> Empresa Individual Cup </td><td> URC55-0090-0090 PL4 </td><td></td></tr><tr><td> 1 onça recipientes de plástico e tampas </td><td> DART Container Corporation </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mM de NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM de Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Seringa </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> Calibre 30, 0,375 &quot;Comprimento estilo de ponto, 2 </td></tr></tbody></table>

criação e injeção de<em&gt; manduca sexta</em&gt; as larvas para avaliar a virulência bacteriana

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, vulgarmente conhecido como o hornworm tabaco, é considerada uma importante praga agrícola, alimentando-se de plantas solanáceas, incluindo o tabaco e tomate. A susceptibilidade de M. sexta larvas para uma variedade de espécies bacterianas entomopatogênicos 1-5, bem como a riqueza da informação disponível sobre o sistema imunitário do insecto 6-8, e a sequência do genoma pendente 9 torná-lo um organismo modelo bom para ser utilizado no estudo de interacções hospedeiro-microorganismo durante a patogênese. Além disso, M. sexta larvas são relativamente grandes e fáceis de manipular e manter no laboratório relação a outras espécies de insetos suscetíveis. O seu grande tamanho, também facilita a extracção dos tecidos / hemolinfa eficiente para a análise da resposta do hospedeiro à infecção. O método aqui apresentado descreve a injecção directa de bactérias no hemocelo (cavidade de sangue) de M. larvas sexta. Esta abordagempode ser utilizado para analisar e comparar as características de virulência em várias espécies bacterianas, estirpes ou mutantes, por simplesmente controlar o tempo até à morte de insectos após a injecção. Este método foi desenvolvido para o estudo da patogenicidade de Xenorhabdus Photorhabdus e espécies, que normalmente se associam com os vectores de nematóides como um meio de ganhar a entrada do insecto. Nematóides entomopatogênicos tipicamente infectar larvas através digestivo natural ou aberturas respiratórias, e liberar os seus conteúdos simbióticas bacterianas no inseto hemolinfa (sangue) pouco depois 10. O método de injecção aqui descrito evita a necessidade de um vector nemátodo, assim, desengatar os efeitos das bactérias e nematóides sobre o insecto. Este método permite a enumeração exacta de material infeccioso (células ou proteínas) dentro do inoculo, que não é possível utilizar outros métodos existentes para a análise de entomopathogenesis, incluindo nicking 11 e ensaios de toxicidade oral 12 <em&gt;. Além disso, os ensaios de toxicidade oral abordar a virulência de toxinas segregadas introduzidos no sistema digestivo de larvas, ao passo que o método de injecção directa elimina a virulência dos inóculos de células inteiras. A utilidade do método de injecção directa, tal como descrito aqui é analisar patogênese bacteriana por monitorização da mortalidade de insectos. No entanto, este método pode ser facilmente expandido para uso no estudo dos efeitos da infecção com o M. sexta sistema imunitário. O insecto responde à infecção por meio de ambas as respostas humoral e celular. A resposta humoral inclui o reconhecimento de bactérias associadas a padrões e subsequente produção de diversos péptidos antimicrobianos 7, a expressão de genes que codificam estes péptidos pode ser monitorizada após a infecção directa através de extração de RNA e PCR quantitativa 13. A resposta celular à infecção envolve nodulação, encapsulamento, e a fagocitose dos agentes infecciosos por hemócitos 6 </sup&gt;. Para analisar estas respostas, insectos injectados podem ser dissecados e visualizadas por microscopia de 13, 14.

Um exemplo representativo de um ensaio de mortalidade dos insectos é descrito na Figura 3. Nesta experiência, os insectos foram injectados com cerca de 50 unidades formadoras de colónias (CFU) de um ou outro tipo selvagem (ATCC19061) ou uma estirpe mutante atenuada (lrp 13) de Xenorhabdus nematophila crescido a fase mid-log (n = 6 por insectos estirpe). As larvas foram observadas para, aproximadamente, 72 horas, e a percentagem de insectos vivos injectados em cada instante d...

O método descrito aqui utiliza a injecção directa de bactérias entomopatogênicos no hemocelo de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larvas de insetos.<em&gt; M. sexta</em&gt; É um inseto disponível comercialmente e bem estudado. Assim, este método representa uma abordagem simples para analisar interacções hospedeiro-bacteriana a partir da perspectiva de um ou de ambos os parceiros.

Criação e injeção de<em&gt; Manduca sexta</em&gt; As larvas para avaliar a virulência bacteriana

*Manduca sexta*, comumente conhecida como lagarta-do-tabaco, é considerada uma praga agrícola significativa, alimentando-se de plantas solanáceas, incluindo o tabaco e ...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a patogenicidade bacteriana contra larvas de insetos utilizando o manduka seca como organismo modelo. Isso é realizado primeiramente criando as larvas de insetos a partir de ovos esterilizados até a fase de quarto estádio do desenvolvimento. Na segunda etapa, as amostras bacterianas são preparadas para injeção.Em seguida, as bactérias são injetadas nas larvas de manduka seca do quarto ínstar. Na etapa final, a morte dos insetos ao longo do tempo após a injeção é monitorada. Por fim, o tempo até a morte dos insetos é registrado e utilizado para avaliar a virulência bacteriana.Este método pode ajudar a abordar aspectos fundamentais na área de simbiose, incluindo a descoberta de novos patógenos de insetos e a determinação de diferenças na virulência entre espécies ou cepas bacterianas. Comece primeiramente autoclavando 15 gramas de ágar em 900 a 1000 mililitros de água. Imediatamente após a autoclavação.Misture a ração com 166 gramas de dieta de gérmen de trigo. Em um liquidificador de laboratório, despeje a dieta para insetos misturada em um recipiente. Após esfriar, transfira a dieta do recipiente para um pedaço de papel de alumínio.Enrole firmemente e armazene a quatro graus Celsius. Após a chegada, coloque os machos sobre os ovos em um suporte de filtro de vidro e aparelho com frasco de vácuo contendo um papel filtro de 90 milímetros. Em seguida, despeje 250 mililitros de solução de hipoclorito a 0,6% sobre os ovos por dois a três minutos, agitando ocasionalmente.Agora ligue o vácuo para drenar a solução de água sanitária e, em seguida, lave os ovos esterilizados três a quatro vezes com 250 mililitros de água destilada estéril por lavagem. Em seguida, coloque um novo pedaço de papel de filtro de 90 milímetros na tampa de uma placa de Petri e, depois, transfira os ovos para o papel de filtro para que sequem em uma câmara de fluxo até que não grudem mais uns nos outros. Agora, coloque a dieta para insetos recentemente preparada sobre uma rolha de borracha fixada em vários recipientes plásticos e transfira aproximadamente 40 ovos para cada recipiente, separando os ovos da dieta para evitar contaminação fúngica induzida pela umidade.Mantenha os ovos a 26 graus Celsius com um fotoperíodo de 16 horas de luz e oito horas de escuro. Os ovos clarearão para uma cor branca amarelada antes da eclosão, quando a eclosão estiver completa. Usando pinças para pegar cada larva pelo longo chifre preto, transfira cuidadosamente cerca de 25 larvas cada para novos recipientes com dieta no fundo.Incube as larvas por dois dias nas mesmas condições utilizadas para os ovos; embora a morte larval seja incomum nesta fase, alguns exemplares mortos ou, mais provavelmente, larvas com desenvolvimento estagnado podem ser observados. Agora, transfira as larvas para recipientes individuais com pequenos pedaços de alimento para evitar comportamentos canibais e incube-as novamente. Substitua o alimento e remova as fezes dos recipientes a cada dois dias, até que os insetos passem pela terceira muda larval.A terceira muda larval é o estágio larval de quarta instar, caracterizado pelo aparecimento de ganchos pretos semelhantes a crochés em cada prola e por um aumento na evidência das listras ao longo do corpo do inseto. Após cultivar as linhagens bacterianas desejadas para teste, centrifugue 500 microlitros de cada linhagem bacteriana por dois minutos em uma microcentrífuga a 17.000 × g, à temperatura ambiente. Em seguida, lave os pellets com um mililitro de PBS estéril nas mesmas condições.Após ressuspender as células em meio mililitro adicional de PBS estéril, meça a densidade óptica das suspensões antes de iniciar as injeções, utilizando uma ponteira nova para cada diluição. Prepare seis diluições seriadas de dez vezes da primeira cepa bacteriana em PBS estéril em uma placa de microtitulação de 96 poços. Em seguida, aplique 10 microlitros de cada diluição, de 10 elevado a menos dois até 10 elevado a menos seis, ao longo da parte superior de uma placa de Petri contendo o meio de crescimento apropriado. Em seguida, incline a placa para que as gotas se espalhem até o centro.Em seguida, após remover a dieta e as fezes dos insetos, coloque os recipientes com os insetos sobre gelo por aproximadamente cinco minutos enquanto os insetos esfriam. Enxágue uma agulha de seringa três vezes em cada um de dois tubos contendo etanol a 70 a 100%, seguido por um tubo com água estéril. Em seguida, utilize um hemocitômetro para quantificar as suspensões celulares diluídas em microscópio.Dependendo do inóculo desejado, retire 10 microlitros do microtítulo apropriado. Em seguida, passe um cotonete na superfície do inseto a ser injetado com etanol a 95%. É mais difícil manter o inseto na posição apropriada para a injeção, ao mesmo tempo em que se manipula a agulha e se toma cuidado para não perfurar o intestino do inseto.Além disso, tenha cuidado para trabalhar rapidamente, para que o inseto não aqueça e comece a se mexer enquanto você o segura para a injeção. Injete a suspensão celular de 10 microlitros no inseto em um ângulo inferior a 45 graus, atrás de uma das pernas proabdominais. Tendo o cuidado de não perfurar o intestino, injete o conteúdo logo abaixo da camada epidérmica.Após injetar cada inseto com a primeira cepa de bactérias, placa novamente as diluições de 10 à menos dois até 10 à menos seis, desta vez no centro da placa. Deixe escorrer em direção à parte inferior da placa. Incube, então, as placas na temperatura apropriada e conte as colônias para enumerar o inóculo.Após repetir o processo de diluição, plaqueamento e injeção para cada cepa bacteriana, injete três a cinco insetos com PBS estéril para o grupo controle negativo. Em seguida, incube todos os insetos a 26 graus Celsius e com um fotoperíodo de 16 horas de luz e oito horas de escuro. Por fim, monitore a sobrevivência dos insetos ao longo do tempo após as injeções; frequentemente, os insetos exibem perda de apetite, diarreia aquosa e amarelada, excremento e/ou perda de água durante a infecção, antes da morte.A morte dos insetos é caracterizada pela ausência de movimento voluntário após estimulação. Neste ensaio, os insetos foram injetados com aproximadamente 50 unidades formadoras de colônia de uma cepa selvagem ou de uma cepa mutante atenuada de Xer Haus NLA groan na fase média de crescimento logarítmico. Os insetos foram observados por aproximadamente 72 horas e foi registrado o percentual dos insetos injetados que ainda estavam vivos em cada ponto temporal.Neste experimento, a linhagem atenuada exibiu um atraso evidente na morte dos insetos, enquanto a linhagem selvagem matou todas as seis larvas dentro de 30 horas após a injeção, antes mesmo da morte de qualquer larva infectada com o mutante. Os dados são estatisticamente distintos após esta procedimento. Outros métodos, como extração de RNA e reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como determinar se a bactéria é ou não capaz de manipular a resposta imune do inseto.

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