Ensaio de placas para Norovirus Murine

O objetivo geral deste procedimento é quantificar partículas infecciosas de norovírus em neurônios. Isso é realizado primeiramente preparando uma diluição decimal do inóculo viral. O segundo passo é transferir a diluição do inóculo viral para uma monocamada bruta de 2 6 4 0,7 e incubar as placas em movimento oscilante à temperatura ambiente por uma hora.

Em seguida, aspire o inóculo e recubra com uma proporção um para um de C plaque aros e dois XMEM e incube as placas por 48 horas em uma incubadora de cultura de tecidos. O passo final é recobrir com solução corante de vermelho neutro e incubar as placas por uma a três horas em uma incubadora de cultura de tecidos. Por fim, a solução corante de vermelho neutro é aspirada cuidadosamente sem remover a camada superior formada, e as placas são analisadas utilizando uma caixa de luz.

Este método de quantificação de partículas virais infecciosas pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do norovírus, como a quantidade de partículas infecciosas eliminadas nas fezes ou quais tecidos sustentam a infecção. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades em manter células saudáveis e viáveis durante todo o ensaio. A demonstração visual deste método é essencial, pois o ensaio de placas para o neurovírus espelho pode ser difícil de compreender para pessoas sem experiência prévia.

A conclusão bem-sucedida deste ensaio é uma série cumulativa de etapas que exigem a quantidade adequada de células, a temperatura correta e um manuseio preciso para observar prontamente as placas. Primeiro, examine a monocamada celular ao microscópio óptico para verificar a morfologia das células. A maioria das células deve parecer arredondada.

Não deixe as células sobrecrescerem, pois normalmente não formarão placas; massageie um frasco de cultura de tecidos de 175 centímetros quadrados quase confluente de células RAW 264.7 para o ensaio de placas de murine neurovirus. Aspire o meio do frasco e adicione 10 mililitros de DMEM 10 fresco às células. Em seguida, raspe as células do fundo do frasco com um espátula celular e use uma pipeta de 10 mililitros para aspirar e depois expelir a suspensão celular contra o fundo do frasco. Repita este procedimento pelo menos três vezes para dispersar eventuais agregados celulares.

Para adaptar um frasco estoque. Remova um a dois mililitros de suspensão celular e transfira para um novo frasco quadrado de 175 centímetros quadrados contendo 33 a 34 mililitros de DMEM 10. Incube o frasco em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a três dias e realize novamente a massagem.

Uma vez completado o preparo para semear as placas para o ensaio, ajuste a densidade da suspensão celular para um vezes 10 à sexta células viáveis por mililitro em DMEM 10 e adicione dois mililitros dessa suspensão a cada poço de uma placa de seis poços com diâmetro de 3,5 centímetros. Tampe a placa e, em seguida, agite-a manualmente imediatamente por 10 vezes para distribuir as células uniformemente nos poços.

Não deixe a placa inchar, pois isso fará com que as células se agrupem no centro do poço. Em seguida, coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos por um mínimo de quatro horas ou, idealmente, durante a noite, para que as células adiram. O inóculo viral pode ser obtido a partir de tecidos homogeneizados infectados pelo MNV ou amostras fecais de camundongos infectados pelo MNV. Se estiver usando amostras de tecido, coloque um pedaço do tamanho de uma ervilha em um tubo com tampa de rosca de dois mililitros contendo esferas de sílica estéreis e um mililitro de DMEM 10 e homogeneíze aqui.

Um magnetizador é usado a 6.000 RPM durante um minuto. Se estiverem sendo usadas amostras fecais, homogeneíze não mais do que três pelotas fecais da mesma maneira, congele as amostras homogeneizadas a menos 80 graus Celsius e descongele o inóculo no dia do ensaio de placa. Use uma pipeta repetidora para dispensar 1,35 mililitros de DMEM 5 em cada poço de uma placa de 24 poços e, em seguida, pipete 0,15 mililitros do terceiro inóculo viral no primeiro poço da placa.

Realize diluições seriadas de dez vezes, aspirando 0,15 mililitros da primeira diluição de 10 elevado a menos um e transferindo para o segundo poço da placa para obter uma diluição de 10 elevado a menos dois. Em seguida, repita o processo com a diluição do segundo poço para obter uma diluição de 10 elevado a menos três. Observe que diluições adicionais, até 10 elevado a menos nove, podem ser necessárias, dependendo da amostra.

Uma vez preparadas as diluições seriadas, rotule as placas com culturas de células RAW 264.7 entre 60 e 80% confluentes com os nomes das amostras e a diluição utilizada. Em seguida, remova todo o meio de uma das placas por aspiração ou descarte rápido e adicione 0,5 mililitros de uma amostra diluída a um poço. Repita o procedimento em um poço duplicado e, em seguida, prossiga para a próxima diluição mais baixa.

Após as três diluições terem sido adicionadas a uma placa em duplicata, incline a placa para frente e para trás para garantir que todas as células tenham sido cobertas. Repita o procedimento com a próxima placa de células. Após todas as placas terem sido tratadas, coloque-as em um agitador orbital regulado em aproximadamente 18 oscilações por minuto durante uma hora à temperatura ambiente; aqueça em forno de micro-ondas um frasco com agar previamente preparado e/ou esterilizado até que derreta.

Em seguida, coloque os ágaros fundidos em um banho-maria a 42 graus Celsius para equilibrar à temperatura. A seguir, misture os ágaros fundidos com meio 2 XMEM estéril em um frasco estéril na proporção de um para um. Coloque o frasco contendo esta solução de sobrecamada em um banho-maria a 37 graus Celsius até o momento do uso.

Após a incubação de uma hora, aspire o inóculo de cada poço e adicione lentamente dois mililitros da solução de cobertura a cada poço, garantindo que a ponta da pipeta seja colocada contra a parede de cada poço. Para evitar deslocar as células, cubra as placas e deixe a cobertura solidificar por aproximadamente 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira as placas para o incubador de cultura de tecidos por 48 horas.

Após o período de incubação, verifique as placas quanto à presença de placas. Se nenhuma placa for visível, retorne as placas ao incubador e verifique novamente após quatro horas. Repita o procedimento, se necessário, mas a incubação não deve exceder 72 horas.

Primeiro, prepare a solução corante de vermelho neutro. Em seguida, adicione dois mililitros da solução de vermelho neutro a cada poço; para este protocolo, não é necessário remover o tampão aros. Incube as placas a 37 graus Celsius por uma hora.

Após o tempo de incubação ter decorrido, verifique as placas quanto à presença de placas, mantendo a solução de vermelho neutro nos poços. Se nenhuma coloração for aparente, incube as placas por mais uma hora, até um máximo de três horas. Assim que as placas ficarem visíveis, aspire a solução de vermelho neutro, garantindo que a tampa levantada não seja perturbada, e então prossiga para a contagem das placas.

Examine as placas e identifique a diluição em que as placas estão claramente separadas. Coloque a placa sobre uma caixa de luz e conte as placas, marcando um ponto sobre cada placa contada. Para evitar contagens duplicadas.

Em seguida, repita a contagem em um poço com uma diluição diferente do vírus e calcule o título viral em unidades formadoras de placa por mililitro. De acordo com as instruções no protocolo escrito, esta imagem representativa mostra uma monocamada antes da infecção. As células RAW 264.7 foram cultivadas durante a noite e analisadas em microscópio óptico com aumento de 20 vezes.

Esta imagem mostra a mesma monocamada após a formação de placas. As células foram coradas com uma solução de vermelho neutro a 0,01% após 48 horas de infecção e visualizadas em um microscópio óptico com ampliação de quatro vezes. Os numerais romanos um, dois e três indicam três placas visíveis.

Esta imagem mostra uma placa ao final do protocolo de ensaio de placa, com poços em duplicata de três diluições sucessivas de dez vezes, rotulados com numerais romanos. Os poços um e quatro correspondem à diluição 10 elevado a menos um. Os poços dois e cinco correspondem à diluição 10 elevado a menos dois, e os poços três e seis correspondem à diluição 10 elevado a menos três.

O título viral da amostra está indicado abaixo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trocar as ponteiras da pipeta entre as diluições para evitar contaminação cruzada entre as amostras, equilibrar as soluções à temperatura correta e não deixar as monocamadas celulares secarem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de placa e quantificar partículas infecciosas de mirovírus.

Não se esqueça de que, ao trabalhar com Mira Norovirus em uma cabine de segurança biológica, precauções como o uso de luvas e avental devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento, e os resíduos devem ser descartados adequadamente seguindo as diretrizes estabelecidas pelo comitê local de biossegurança.