Ensaio de placas para Norovirus Murine

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as partículas de norovírus de neurônios infecciosos. Isso é feito preparando primeiro a diluição dez vezes maior do inóculo do vírus. O segundo passo consiste em transferir a diluição do inóculo do vírus para uma monocamada bruta 2 6 4 0,7 e incubar as placas à temperatura ambiente durante uma hora.

Em seguida, aspire o inóculo e a cobertura com uma proporção de um para um de placa C aros e dois XMEM e incube as placas por 48 horas em uma incubadora de cultura de tecidos. A etapa final é cobrir com solução de coloração vermelha neutra e incubar as placas por uma a três horas em uma incubadora de cultura de tecidos. Por fim, a solução de coloração vermelha neutra é aspirada cuidadosamente sem remover a camada de revestimento levantada e o plexo é contabilizado usando uma caixa de luz.

Esse método de quantificação de partículas virais infecciosas pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do norovírus, como a quantidade de partículas infecciosas derramadas nas fezes ou quais tecidos suportam a infecção. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldade em manter células saudáveis e viáveis durante todo o ensaio. A demonstração visual desse método é crítica, pois o ensaio de placa para neurovírus espelho pode ser difícil de entender para pessoas sem experiência anterior.

A conclusão bem-sucedida deste ensaio é uma série cumulativa de etapas que requerem a quantidade certa de células, a temperatura correta e o manuseio preciso para observar prontamente as placas. Primeiro, examine a monocamada celular sob um microscópio óptico para verificar a morfologia das células. A maioria das células deve parecer redonda.

Não deixe as células crescerem demais, pois elas normalmente não formam placas para massagear um frasco de cultura de tecidos quadrado de 175 centímetros quase cofluente de 2 6 4 0,7 células cruas para o ensaio de placa de neurovírus murn, aspire a mídia do frasco e adicione 10 mililitros de DMEM 10 fresco às células. Em seguida, raspar as células do fundo do balão com um raspador de células e aspirar com uma pipeta de 10 ml e, em seguida, expelir a suspensão celular contra o fundo do frasco. Repita esta ação pelo menos três vezes para quebrar quaisquer aglomerados de células.

Para se adequar a um frasco de estoque. Remova um a dois mililitros de suspensão celular e deposite-o em um novo frasco quadrado de 175 centímetros contendo 33 a 34 mililitros de DMEM 10. Incube o frasco em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a três dias e massageie novamente.

Uma vez complementado para semear as placas para o ensaio, ajustar a densidade da suspensão celular para uma vez 10 elevado às seis células viáveis por mililitro no DMEM 10 e adicionar dois mililitros desta suspensão a cada poço de 3,5 centímetros de diâmetro. Seis. Placa de poço cubra a placa. Em seguida, balance imediatamente a placa com a mão 10 vezes para distribuir as células uniformemente nos poços.

Não inche a placa, pois isso fará com que as células se agrupem no centro do poço. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora de cultura de tecidos por no mínimo quatro horas ou, idealmente, durante a noite para que as células se fixem, o inóculo do vírus pode ser obtido de tecidos homogeneizados infectados por MNV ou amostras fecais de camundongos infectados com MNV. Se estiver usando amostras de tecido, coloque um pedaço de tecido do tamanho de uma ervilha em um tubo de tampa de rosca de dois mililitros contendo esferas de sílica estéreis e um mililitro de DMEM 10 e homogeneize aqui.

Um magnetizador é usado a 6.000 RPM por um minuto. Se estiver usando amostras fecais, homogeneizar não mais do que três pastilhas fecais da mesma maneira, congelar as amostras homogeneizadas a menos 80 graus Celsius e descongelar o inóculo no dia do ensaio em placa. Use uma repetição da pipeta para dispensar 1,35 mililitros de DMEM cinco em cada poço de uma placa de 24 poços e, em seguida, pipetar 0,15 mililitros do terceiro inóculo do vírus no primeiro poço da placa.

Realize diluições seriais dez vezes maiores aspirando 0,15 mililitros dos primeiros 10 para a diluição menos um e transferindo-os para o segundo poço da placa para diluir 10 para menos dois. Em seguida, repita o processo com a diluição do segundo poço para diluir para 10 elevado a menos três. Note-se que pode ser necessária uma diluição adicional até 10 a menos nove, dependendo da amostra.

Uma vez preparada a diluição em série, rotular as placas de 60 a 80% de confluente em bruto, 2 64 0,7 células com os nomes das amostras e a diluição que está sendo usada. Em seguida, remova todos os meios de uma das placas por aspiração ou sacudindo para fora e adicione 0,5 mililitros de uma amostra diluída a um poço. Repetir com um alvéolo duplicado e prosseguir para a diluição inferior seguinte.

Uma vez que todas as três diluições tenham sido adicionadas a uma placa em duplicata, incline a placa para frente e para trás para garantir que todas as células tenham sido cobertas. Repita o procedimento com a próxima placa de células. Depois que todas as placas forem tratadas, coloque-as em um aparelho de balanço ajustado a cerca de 18 oscilações por minuto por uma hora em temperatura ambiente, leve ao micro-ondas uma garrafa de aros previamente preparado e/ou enclave até derreter.

Em seguida, coloque o aros derretido em um banho-maria a 42 graus Celsius para equilibrar a temperatura. Em seguida, misture os agros fundidos com dois meios estéreis de XMEM em um frasco estéril na proporção de um para um. Coloque o frasco contendo esta solução de revestimento em banho-maria a 37 graus Celsius até que esteja pronto para uso.

No final da incubação de uma hora, aspire o inóculo de cada poço e adicione lentamente dois mililitros da solução de sobreposição a cada poço, garantindo que a ponta da pipeta seja colocada contra a parede de cada poço. Para evitar o deslocamento das células, cubra as placas e permita que a cobertura solidifique por aproximadamente 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira as placas para a incubadora de cultura de tecidos por 48 horas.

Após o período de incubação, verifique as placas quanto à presença de placas. Se nenhuma placa estiver visível, devolva as placas à incubadora e verifique novamente após quatro horas. Repita o procedimento se necessário, mas a incubação não deve exceder 72 horas.

Primeiro, prepare a solução de coloração vermelha neutra. Em seguida, adicione dois mililitros de solução vermelha neutra a cada poço para este protocolo, o plugue aros não precisa ser removido. Incube as placas a 37 graus Celsius por uma hora.

Decorrido o tempo de incubação, verifique as placas quanto à presença de placas, mantendo a solução vermelha neutra nos poços. Se não houver manchas, incubar as placas durante mais uma hora durante um máximo de três horas. Assim que as placas estiverem visíveis, aspire a solução vermelha neutra, certificando-se de que o tampão levantado não seja perturbado e, em seguida, prossiga para a contagem das placas.

Examinar as placas e encontrar a diluição onde as placas estão claramente separadas. Coloque a placa em uma caixa de luz e conte as placas enquanto marca um ponto nas placas contadas. Para evitar contagens duplicadas.

Em seguida, repita a contagem em um poço com uma diluição diferente do vírus e calcule o título viral em unidades formadoras de placa por mililitro. De acordo com as instruções do protocolo escrito, esta imagem representativa mostra uma monocamada antes da infecção. As células brutas 2 6 4 0,7 foram cultivadas durante a noite e fotografadas sob um microscópio óptico com uma ampliação de 20 vezes.

Esta imagem mostra a mesma monocamada após a formação das placas. As células foram coradas com uma solução vermelha neutra a 0,01% após 48 horas de infecção e visualizadas sob um microscópio óptico com aumento de quatro vezes. Os algarismos romanos um, dois e três indicam três placas visíveis.

Esta imagem mostra uma placa no final do protocolo de ensaio de placa com poços duplicados de três poços de diluição de dez vezes marcados com Roman. Os numerais um e quatro correspondem ao 10, ao menos um. A diluição dois e cinco correspondem à diluição 10, à diluição menos dois e três e seis correspondem à diluição 10 à diluição menos três.

O título viral da amostra é indicado abaixo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de trocar as pontas das pipetas entre as diluições para evitar a contaminação cruzada entre as amostras, equilibrando as soluções na temperatura correta e não deixar as monocamadas das células secarem. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de placa e quantificar as partículas infecciosas do neurovírus mi.

Não se esqueça de que, ao trabalhar com o Mira Norovirus em um gabinete de biossegurança, precauções como o uso de luvas e aventais devem sempre ser tomadas durante a execução Este procedimento e os resíduos devem ser descartados adequadamente seguindo as diretrizes estabelecidas pelo comitê de biossegurança local.