Name: Ensaio de placas para Norovirus Murine (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a realizar ensaio de placas para quantificar partículas infecciosas de norovirus murino em macrófagos de camundongo. Este método viabiliza estudos de infectividade viral e dinâmica de infecção.

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Agradecemos a membros do laboratório Wobus para comentários críticos e sugestões. Trabalhar no laboratório de CEW foi financiado por fundos de arranque da Universidade de Michigan, uma bolsa de desenvolvimento de carreira a partir do Centro NIH / NIAID Regional de Excelência para a Bio-defesa e Emergentes de Pesquisa de Doenças Infecciosas (RCE) Programa, Região V &#39;Grande RCE Lakes &#39;(NIH prêmio 1-U54-AI-057153) e NIH R01 AI080611. MBG-H. foi financiado pelo Imunologia Experimental (NIH T32 A1007413-16) e os Mecanismos moleculares em Patogênese Microbiana (NIH T32 A1007528) bolsas de formação para a Universidade de Michigan. JBC foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Brasília, Brasil.

1. A cultura da linha celular de macrófagos RAW 264.7 <ol><li> Manter células RAW 264.7 (ATCC, catálogo # TIB-71) em meio DMEM-10 media, que consiste em glucose alta DMEM com 10% (v / v) de endotoxina baixa de soro fetal bovino (&lt;10 EU / ml), Hepes 10 mM , 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 1 mM de não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina. As células são normalmente mantidas em 175 cm 2 frascos de cultura de tecidos contendo 35 ml de meio por frasco e incubaram-se a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador de cultura de tecido. Contudo, qualquer tamanho de balão pode ser usado com um volume de meio que seja apropriado para o tamanho do frasco. </li><li> Para dividir células: aspirar os meios velhos, adicionam-se 10 ml de DMEM fresco-10 media para as células e, em seguida, raspar as células a partir do fundo do balão, utilizando um raspador de células. Em seguida, voltar a suspender as células em uma solução homogénea através da elaboração de células para uma pipeta de 10 ml e com força pressionando as células através da ponta de pipeta prEssed contra o fundo do frasco. Repetir esta acção, pelo menos, 3 vezes de modo que as células já não clump juntos. Verificar por microscopia óptica que a suspensão de célula única foi gerada. Em seguida, transferir 1 ml (diluição de 1:10, ou ~ 1x10 7 células) - 2 ml (diluição 1:5 ou ~ 2x10 7 células) de suspensão de células para um novo 2 175 centímetros frasco, e perfazer um volume final de meio até 35 ml. </li><li> Dividir células quando elas são quase confluente (~ 1x10 8 células total/175 cm 2 frascos): de três em três dias, se começando com uma diluição de 1:10, ou de dois em dois dias, se começando com uma diluição de 1:5. Use microscopia de luz para verificar a morfologia das células antes de divisão de células. A maioria das células deve olhar em volta e não ativado. Células ativadas têm grânulos e / ou prolongado, espigado morfologia com apêndices. Não deixe overgrow células como essas células não costumam formar placas. Mantenha o controle do número de passagens e freqüentemente começar de descongelamento por uma alíquota menor passagem de células. (Usamos passagem 30 como um ponto de corte). </li></ol> 2. Infectar células RAW 264.7 com MNV inóculo <ol><li> Semente células RAW 264.7 em placas de 6 poços (3,5 cm de diâmetro) a uma densidade de 1x10 6 células viáveis ​​/ ml em DMEM-10 media, e adicionar 2 ml desta suspensão a cada poço. É importante para distribuir uniformemente as células nos poços de placas, quer por balançar à mão, pelo menos, 10 vezes ou utilizando um aparelho de balanço para ~ 10 min. Não redemoinho as placas como isso vai fazer com que as células de agrupamento, no centro do poço. Colocar em placas de cultura de tecido (incubadora a 37 ° C e 5% CO 2). Permitir que as células fixar durante a noite ou durante pelo menos 4 horas a 37 ° C. As células devem ser 60 - 80% confluentes para o ensaio de placa e distribuídos uniformemente por todo o poço. </li><li> No dia seguinte, preparar o inoculo de vírus, o que pode ser a partir de células infectadas com MNV em cultura de tecidos ou a partir de tecidos homogeneizados ou amostras de fezes de MNV camundongos infectados. Ao utilizar amostras de tecido, pi do tamanho de ervilhaECEs de tecidos são homogeneizados em 2 ml com tampa de rosca contendo contas de tubos estéreis de sílica em 1 mL de DMEM-10, utilizando um homogeneizador de tecidos (por exemplo, MagnaLyser; Roche). Para as amostras de fezes, não mais do que três pelotas fecais devem ser homogeneizadas em uma mídia ml. Todas as amostras são então congeladas (a -80 ° C) e descongelado uma vez antes de realizar o ensaio de placas fágicas. </li><li> Preparar diluições de 10 vezes do inoculo de vírus em DMEM completo meio-5, que consiste em DMEM / concentração elevada de glucose, 5% (v / v) de endotoxina baixa de soro fetal bovino (&lt;10 EU / ml), 10 mM de HEPES, 100 U / ml de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL, 1 mM não-aminoácidos essenciais, 2 mM de L-glutamina. </li><li> Dez diluições em série são preparados em placas de 24 poços: A pipeta repetidora é usada para dispensar 1,35 ml de meio em poços múltiplos, a diluição 10 -1 é feita por mistura de 1,35 ml de meio e 0,15 ml de vírus contendo amostra, e em seguida, 0,15 ml de uma diluição 10 -1 é adicionado 1,35 ml de meios para fazer a 10 -2 dilution e assim por diante. É importante mudar dicas cada vez que você faz uma nova diluição. Uma pipeta multicanal pode ser usado para fazer as diluições de amostras múltiplas de cada vez com duas pontas encaixe para um poço de uma placa de 24 poços a transferência de um volume total de 0,15 ml por poço (ver Figura 3A). </li><li> Uma gama de diluição típico para homogenatos de tecido e conteúdos fecais é de 10 -1 a 10 -3. No entanto, as placas a partir dessas amostras tendem a ser menores em comparação com aqueles a partir de amostras de cultura de tecidos. Além disso, em alguns casos, uma diluição de 1:100 das amostras fecais é necessária para diluir suficientemente para fora quaisquer componentes tóxicos das fezes que podem perturbar a monocamada de células, impedindo assim a possibilidade de contar placas. A gama de diluição de lisados ​​de cultura de tecidos depende do ponto de tempo de interesse durante o ciclo de vida viral. Diluições que vão até 10 -9 pode ser necessária no pico da infecção. </li><li> Após as diluições em série são preparados, rotular a placa de 6 poçoss contendo RAW 264,7 monocamadas (da seção 2.1) com o nome da amostra e diluições sendo banhado. Uma placa de cada vez, remova todas as mídias sacudindo-o ou aspirar ele. Imediatamente depois adicionar 0,5 ml de uma amostra diluída para um poço, em seguida, repita com uma duplicata bem, antes de proceder à diluição seguinte. Uma vez que todos os três diluições são adicionados a uma placa de inclinação da placa, e para trás com a mão para garantir que todas as células foram cobertas. Manipular uma placa de cada vez para assegurar que as células não sequem. </li><li> Após a adição de 0,5 ml das diluições de cada poço, a pilha de placas de pé e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente. Uma vez que o volume adicionado a cada poço, não é suficiente para cobrir completamente a monocamada, as placas têm de ser suavemente inclinada para trás e para a frente com a mão cada 10-15 minutos ou colocada num aparelho de balanço (~ 18 oscilações por minuto). Isso evita que as células de secagem. </li></ol> 3. Baixo ponto de fusão de agarose (SeaPlaque) Preparação Overlay <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Nota: é aconselhável ter várias garrafas com autoclavado SeaPlaque agarose preparado antes do tempo. De agarose podem ser re-fundidas num forno de microondas antes de usar. <ol><li> Calcular a quantidade de sobreposição necessário para o volume total de placas, antes de 1 h de incubação estiver completa. O volume necessário é de 2 ml / cavidade ou 12 ml/6-well placa. Prepare agarose (ver secção 3.2) e media (ver secção 3.3) separadamente. </li><li> Para preparar a agarose, suspender 3 g de agarose SeaPlaque, num volume total de 100 ml de água destilada (3% w / v) num frasco de vidro. Autoclave por 20-30 min. (Se agarose foi já preparado de antemão, re-fundida de agarose em microondas.) É importante equilibrar SeaPlaque agarose a 42 ° C num banho de água antes da sua utilização, porque se a agarose é muito quente, que vai matar as células. Certifique-se o nível de água é igual a ou superior ao nível de agarose a fim de evitar a solidificação indesejável. </li><li> Para preparar os meios de comunicação: fazer 100 ml de 2x MEM mídia, que consiste em2x MEM, 10% (v / v) de endotoxina de soro fetal bovino baixo (&lt;10 EU / ml), 10 mM de HEPES, 100 U / ml de penicilina, 100 ug de estreptomicina / ml, 4 mM de L-glutamina. Equilibre media a 37 ° C num banho de água. </li><li> Misturar ambas a agarose SeaPlaque e os meios de comunicação MEM 2x juntos em um frasco estéril a uma razão de 1:1 imediatamente antes de sobrepor as monocamadas de células infectadas. Se houver mais do que 200 ml de sobreposição é necessário, o volume de divisão em várias garrafas e manter-se em 37 ° C banho de água até que esteja pronto para uso. </li><li> No final da incubação de 1 hora (ver secção 2.7), aspirar o inoculo a partir de cada poço. Lentamente, adicionar 2 ml de sobreposição para a extremidade de cada poço, colocando a ponta da pipeta contra a parede de cada poço. Até 5 placas podem ser tratadas simultaneamente, sem células secar. </li><li> Permitir a sobreposição de solidificar durante aproximadamente 10 min à temperatura ambiente, antes de colocar as placas na vertical para o tecido incubadora de cultura. Incubar as placas durante 48 horas a 37 ° C em 5% de CO 2. </li><li> Depoiso período de incubação, as placas são fracamente visíveis a olho nu, de modo a verificar as placas não coradas para a presença de placas. Se não houver placas são visíveis, incubar por um adicional de 4 horas e verifique novamente. No entanto, o tempo máximo de incubação não deve exceder 72 horas. </li></ol> 4. A visualização das placas por coloração com vermelho neutro <ol><li> Para visualizar as placas, a solução de coloração de vermelho neutro é preparada por adição de 3 ml de vermelho neutro (0,33% w / v em DPBS; Sigma, catálogo # N2889) a cada ml 97 de 1x PBS (grau de cultura de tecidos, Mg 2 + -, Ca 2 + - livre; Gibco, catalogo 10010). Calcula-se o volume da solução de coloração de vermelho neutro necessário para a experiência: 12 ml de solução de coloração de vermelho neutro são necessários para cada placa de 6 poços. Em seguida, adicionar 2 ml a cada poço. Apesar de alguns protocolos de ensaio em placa requer a tomada de agarose para ser removido dos poços, neste protocolo a solução de coloração de vermelho neutro é adicionado directamente sobre a cobertura. </li><li> Depois de uma hora um emcubation a 37 ° C, verifica se as placas são visíveis com solução de coloração de vermelho neutro ainda em poços. Se as placas não são facilmente visíveis, permita a coloração para continuar por mais um hora. Continuar a incubação até que as placas são visíveis. (Nota:. Staining durante mais de 3 horas não é o ideal e, se não placas são visíveis na amostra de controlo positivo, após 3 horas de coloração, o ensaio de placa não funcionar adequadamente) Após a coloração for completa, aspirar a solução de coloração de vermelho neutro , garantindo a ficha de agarose não é perturbada, e então proceder à contagem das placas. </li><li> Conte placas colocando placa de cabeça para baixo em uma caixa de luz e marcando um ponto em placas contados para evitar contagens duplicadas. Escolher a diluição para contar placas em poços de placas, onde estão claramente separados (isto é, sem evidência visual de fusão placas em conjunto). Se possível, a contagem de placas, duas diluições. É importante notar que o tamanho da placa pode variar entre estirpes MNV, inoculo de vírus, e depende docondição das células RAW 264.7, durante o ensaio de placas fágicas. </li><li> Se não houver placas são visíveis num poço, não houve qualquer vírus presente na amostra ou a quantidade de vírus foi abaixo do limite de detecção do ensaio de placas. Neste caso, os poços mancha vermelha com uma cor semelhante como outros placa contendo poços. Alternativamente, a ausência de placas é também observada quando existem demasiados partículas virais presentes em uma dada diluição. Isto leva à lise da monocamada inteiro e poços aparecer laranja / amarelo. </li><li> Calcular os títulos virais. Adicionar o número de placas em ambos os poços com uma diluição única e multiplicar pelo factor de diluição (isto é, se 1 ml 2 poços estão infectados com 0,5 ml). O resultado será a quantidade de unidades formadoras de placas (PFU) no seu volume de inoculo de 1 ml. Por exemplo, na Figura 4, na diluição 10 -2, um poço (marcado &quot;II&quot;) possui 14 placas e o outro bem (marcado &quot;V&quot;) possui 17 placas. Assim, o título viral será de 14x10 2 + 2 = 17x10 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Resultados representativos Infecciosas MNV-1 partículas pode ser quantificada utilizando um ensaio de placas como descrito esquematicamente na Figura 1. Figura 2A mostra um poço com monocamada de células RAW 264.7 imediatamente antes da infecção, enquanto que a Figura 2B mostra três placas visíveis indicadas por números romanos I, II e III em um poço. Passos individuais do ensaio estão representados nas Figuras 3A a F. A Figura 3A mostra a preparação de diluições em série de 10 vezes de uma amostra contendo vírus. Figura 3B mostra a transferência de diluições em duplicado de uma placa de 6 poços. Figura 3C mostra o aparelho de balanço usado para incubar células RAW 264.7 com o inoculo à temperatura ambiente durante 1 hr a Figura 3D mostra células sendo sobreposto com o SeaPlaque:. MEMmistura. Figura 3E mostra uma placa à temperatura ambiente para permitir a sobreposição de solidificar, enquanto que a Figura 3F mostra células a ser coradas com uma solução de 0,01% de vermelho neutro 48 h mais tarde. Depois da coloração das células para hr 1-3 e aspirando a solução de coloração de vermelho neutro, placas são visíveis e podem ser contadas (Figura 4). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figura 1. Esquemática do protocolo de ensaio em placa MNV. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figura 2. Imagens representativas de um poço de uma monocamada antes da infecção e depois da formação de placas. A) células RAW 264.7 foram cultivadas durante a noite e fotografada com um microscópio de luz com ampliação de 20x. B) As células foram coradas com uma solução de 0,01% de vermelho neutro ao fim de 48 hr de infecção e visualizados sob um microscópio de luz com uma ampliação de 4x. Números romanos I, II, e III indicam três placas visíveis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figura 3. Imagens representativas das diferentes etapas do ensaio de placa. A) MNV-1 inóculo é preparado em diluições de 10 vezes. B) O inoculo é adicionado a monocamadas de células em cavidades duplicadas. C) As células e de inoculo são incubadas por balançar durante 1 h à temperatura ambiente. D) As células são revestidas com uma mistura 1:1 de agarose SeaPlaque e MEM 2x media. E) As placas são incubadas durante 10 min à temperatura ambiente para permitir a sobreposição de solidificar. F) A coloração das células com a solução de coloração de vermelho neutro 48 h pós-infecção. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Placas Figura 4. MNV-1 formas na célula monolAyers. Mostrado aqui é uma placa de ensaio representativo da placa 48 horas pós-infecção, mostrando as placas coradas com solução de coloração de vermelho neutro, após 1 h de incubação. A placa apresenta cavidades em duplicado de três diluições de 10 vezes. Wells rotulados com números romanos I e IV correspondem à diluição 10-1; II e V correspondem à diluição 10-2; III e VI correspondem à diluição 10-3. O título viral da amostra é indicado abaixo (ver Seção 4.5 para obter detalhes sobre o cálculo).

<ol><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+norovirus%3A+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li>
<li>Condit, R. C. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCondit%2C+RC+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).</li>
<li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+estimating+50%25+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li>
<li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li>
<li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435(2011).</li>
<li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196(2009).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li>
<li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método de ensaio de placa para MNV-1 aqui apresentado é uma forma de quantificar partículas infecciosas MNV. Seguindo os passos de ensaio ilustrado na Figura 3, pode-se obter títulos virais reprodutíveis. O limite de detecção do ensaio depende da diluição de partida utilizado. Ao iniciar com uma diluição de 1:10 da amostra, tal como descrito acima, o limite de detecção do ensaio de placa é de 10 pfu (isto é, uma placa visível na diluição 10 -1). Uma vez que cada placa representa um único vírus, o ensaio de placa pode também ser utilizado para purificar as populações clonais de MNV escolhendo placas isoladas e propagando-los conforme descrito anteriormente 1. Além disso, a purificação de placas também pode ser usado para separar uma população de vírus individuais a partir de populações mistas de vírus. Uma limitação do uso de um ensaio de placas para a detecção de infecção MNV é que nem todas as estirpes mnv formar placas 4. No entanto, pode ser possível ultrapassar o inabilidade de algumas estirpes de MNV, isolados a partir de animais, para formar placas em série passaging destes vírus em cultura de tecido 7. Uma alternativa para o ensaio de placa é o de medir partículas infecciosas por meio da técnica de TCID 50 3, 4. Este ensaio quantifica a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas seguintes diluições de ponto de extremidade e leva 1 semana para completar para MNV 4. Além de ser mais lento do que um ensaio de placa, o ensaio de TCID 50 também não é tão sensível (limite de detecção = 200 TCID 50 / ml), devido à toxicidade de amostras de tecido de células RAW 264.7 4. Embora passos críticos no âmbito do protocolo foram descritos ao longo do protocolo, a seção seguinte apresenta um resumo para facilitar a resolução de problemas. Os passos mais importantes do protocolo é o de assegurar que as células RAW 264.7 permanecem viáveis ​​ao longo do ensaio para suportar a replicação do vírus. Isto podeser monitorizado em cada fase do ensaio por meio de microscopia de luz. A viabilidade celular é assegurada de duas maneiras. Primeiro, deve ser tomado cuidado para não deixar secar as células durante o manuseio de placas. Assim, as placas são inoculadas um de cada vez, agitou durante o período de infecção, e devem permanecer fechadas quando não estão a ser tratadas. Em segundo lugar, as soluções adicionado em células devem ser equilibradas para ~ 37 ° C. Além disso, é essencial para a saúde geral das células RAW 264.7 de mantê-las em meio contendo soro de endotoxina baixa (&lt;10 EU / ml), o que limita a activação de células. Além disso, observou-se uma maior taxa de falha do teste de placa quando são usadas células de passagem 30 ou superior. Embora isso provavelmente irá variar de laboratório para laboratório, é importante incluir um controlo positivo (por exemplo, uma amostra com um título conhecido viral) para assegurar títulos reprodutíveis, especialmente quando se utiliza mais elevadas de passagem células RAW 264.7. Para limitar a utilização de células mais elevadas de passagem, é aconselhável congelar frascos de Passa precocecélulas ge após o recebimento de células RAW 264.7 e iniciar uma nova cultura dos frascos congelados freqüência. Começando por cima, com culturas de células de passagem baixa também será útil quando as células apresentam características alteradas, tais como a incapacidade de aderir, as alterações na morfologia celular (por exemplo, de volta para espigado e espalhar-se), ou quando a contaminação por micoplasma foi detectado. Outro ponto importante a prestar atenção é para garantir que ponteiras são trocadas entre as amostras e durante diluições. Isto irá assegurar precisas diluições seriadas e evitar a contaminação cruzada entre as amostras. O primeiro passo no protocolo em que a ponta da pipeta mesmo pode ser utilizado de novo, quando é diluições em série de uma mesma amostra são adicionados aos poços. Nesse caso, a pessoa deve começar a partir do inóculo mais diluído para o mínimo, e vigorosamente pipetar cima e para baixo ao elaborar uma nova diluição. O protocolo de ensaio de placa pode ser alterada a várias modificações. Uma modificação que pode ser feita quando taqui não são suficientes para a inoculação de células de poços em duplicado é apenas para inocular um único poço de cada diluição. No entanto, uma vez que o volume de inoculo é de 0,5 ml, o número de placas, em seguida, tem de ser multiplicado por um factor de 2 para normalizar a pfu / ml. O ensaio de placa pode também ser adaptado para utilização com qualquer linha celular aderente outro que é capaz de suportar a replicação de MNV, e esta tem sido descrita para a linha microglial murino BV-2 de 8 células. Outras modificações que podem ser aplicadas são as adaptações que foram descritas para os protocolos de ensaio de placas desenvolvidas em outros vírus. Em caso de MNV, as seguintes modificações já foram implementadas com sucesso, a utilização de celulose de metilo em vez de agarose Sea Plaque 9, e coloração das células com violeta de cristal ou azul de metileno em vez de vermelho neutro 10, 11. No geral, este protocolo pode ser facilmente adaptado, conforme necessário para quantificar outros formadoras de placas de vírus ou utilizados para other vírus que causam infecções líticas em RAW 264,7 células, tornando-se uma ferramenta útil para quantificar partículas virais infecciosas em geral.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> DMEM / glicose alta </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x penicilina e estreptomicina </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM não-aminoácidos essenciais </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x), L-glutamina </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Mar Plaque Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Neutral Red 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 milímetros de zircônia / sílica contas </td><td> Produtos Biospec </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Modelo Rocker Velocidade 35 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Instrumento Lyser Magna </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Linha de células RAW 264.7 </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> De cultura de tecidos incubadora </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

ensaio de placas para norovirus murine

Plaque Assay for Murine Norovirus

Norovirus murino (MNV) é o único membro do género Norovirus que cresce de forma eficiente em cultura de tecido 1, 2. A lise celular e efeito citopático (CPE), são observados durante MNV-1 infecção de células dendríticas ou macrófagos murinos 1. Esta propriedade de MNV-1 pode ser utilizado para quantificar o número de partículas infecciosas de uma amostra dada pela realização de um ensaio de placas 1. O ensaio de placa depende da capacidade de MNV-1 para lisar as células e para formar buracos em uma monocamada confluente de células, as quais são chamadas placas 3. Várias técnicas podem ser usadas para detectar infecções virais em culturas de tecidos, o tecido colhido, clínicas e amostras ambientais, mas não toda a medida do número de partículas infecciosas (por exemplo, qRT-PCR). Uma forma de quantificar partículas virais infecciosas é realizar um ensaio de placa 3, que será descrita em detalhe abaixo. Uma variação no ensaio de placa é o flúor MNVensaio de focagem escent, onde o antigénio é MNV imunocoradas em monocamadas de células 4. Este ensaio pode ser mais rápido, uma vez que a expressão do antigénio viral precede a formação de placa. Também é útil para a titulação de vírus incapazes de formar placas. No entanto, o ensaio de foco fluorescente exige recursos adicionais para além dos do ensaio de placa, tais como anticorpos e um microscópio para contagem de unidades formadoras de foco. Infecciosa MNV pode também ser quantificada por meio da determinação dos 50% Dose infecciosa em cultura de tecidos (TCID 50) 3. Este ensaio mede a quantidade de vírus necessária para produzir CPE em 50% das células de cultura de tecidos inoculadas por titulação de ponto de extremidade 5. No entanto, o seu limite de detecção é maior em comparação com um ensaio de placa 4. Neste artigo, descreve-se um protocolo de ensaio de placa que podem ser usados ​​para determinar de forma eficaz o número de partículas infecciosas mnv presentes nas amostras biológicas ou ambientais 1, 4, 6. Este método é based sobre a preparação de diluições de 10 vezes em série de amostras contendo MNV, que são utilizados para inocular uma monocamada de células permissivas (células RAW 264.7 de macrófagos murinos). Vírus é permitido para anexar a monocamada de células durante um determinado período de tempo e, em seguida, aspirado antes de cobrir as células com uma mistura de agarose e meio de cultura celular. O agar permite a propagação da descendência virai de células vizinhas, enquanto limita a propagação de células distantemente localizado. Em consequência, as células infectadas são lisadas e os furos formam na monocamada conhecidos como placas. Após a propagação de vírus suficiente, as placas tornam-se visíveis após a coloração das células com corantes, como o vermelho neutro, azul de metileno ou violeta de cristal. Em diluições baixas, cada placa origina de uma partícula infecciosa viral e sua descendência, que se espalhou para as células vizinhas. Assim, a contagem do número de placas permite calcular unidades formadoras de placas (PFU) presentes na amostra não diluída 3.

Descrevemos aqui um método para quantificar a partículas infecciosas de norovirus murino (MNV), que é o único que norovirus replica eficientemente em cultura celular. O ensaio de placas aproveita tropismo MNV por macrófagos murinos e pode ser adaptado para utilização com amostras biológicas ou ambientais que contenham MNV.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

O norovírus murino (MNV) é o único membro do gênero Norovirus que cresce eficientemente em cultura de tecidos 1, 2. A lise celular e o efeito citopático (ECP) são ...

O objetivo geral deste procedimento é quantificar partículas infecciosas de norovírus em neurônios. Isso é realizado primeiramente preparando uma diluição decimal do inóculo viral. O segundo passo é transferir a diluição do inóculo viral para uma monocamada bruta de 2 6 4 0,7 e incubar as placas em movimento oscilante à temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, aspire o inóculo e recubra com uma proporção um para um de C plaque aros e dois XMEM e incube as placas por 48 horas em uma incubadora de cultura de tecidos. O passo final é recobrir com solução corante de vermelho neutro e incubar as placas por uma a três horas em uma incubadora de cultura de tecidos. Por fim, a solução corante de vermelho neutro é aspirada cuidadosamente sem remover a camada superior formada, e as placas são analisadas utilizando uma caixa de luz.Este método de quantificação de partículas virais infecciosas pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área do norovírus, como a quantidade de partículas infecciosas eliminadas nas fezes ou quais tecidos sustentam a infecção. Geralmente, indivíduos novos neste método terão dificuldades em manter células saudáveis e viáveis durante todo o ensaio. A demonstração visual deste método é essencial, pois o ensaio de placas para o neurovírus espelho pode ser difícil de compreender para pessoas sem experiência prévia.A conclusão bem-sucedida deste ensaio é uma série cumulativa de etapas que exigem a quantidade adequada de células, a temperatura correta e um manuseio preciso para observar prontamente as placas. Primeiro, examine a monocamada celular ao microscópio óptico para verificar a morfologia das células. A maioria das células deve parecer arredondada.Não deixe as células sobrecrescerem, pois normalmente não formarão placas; massageie um frasco de cultura de tecidos de 175 centímetros quadrados quase confluente de células RAW 264.7 para o ensaio de placas de murine neurovirus. Aspire o meio do frasco e adicione 10 mililitros de DMEM 10 fresco às células. Em seguida, raspe as células do fundo do frasco com um espátula celular e use uma pipeta de 10 mililitros para aspirar e depois expelir a suspensão celular contra o fundo do frasco. Repita este procedimento pelo menos três vezes para dispersar eventuais agregados celulares.Para adaptar um frasco estoque. Remova um a dois mililitros de suspensão celular e transfira para um novo frasco quadrado de 175 centímetros quadrados contendo 33 a 34 mililitros de DMEM 10. Incube o frasco em uma incubadora de cultura de tecidos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois a três dias e realize novamente a massagem.Uma vez completado o preparo para semear as placas para o ensaio, ajuste a densidade da suspensão celular para um vezes 10 à sexta células viáveis por mililitro em DMEM 10 e adicione dois mililitros dessa suspensão a cada poço de uma placa de seis poços com diâmetro de 3,5 centímetros. Tampe a placa e, em seguida, agite-a manualmente imediatamente por 10 vezes para distribuir as células uniformemente nos poços.Não deixe a placa inchar, pois isso fará com que as células se agrupem no centro do poço. Em seguida, coloque a placa em um incubador de cultura de tecidos por um mínimo de quatro horas ou, idealmente, durante a noite, para que as células adiram. O inóculo viral pode ser obtido a partir de tecidos homogeneizados infectados pelo MNV ou amostras fecais de camundongos infectados pelo MNV. Se estiver usando amostras de tecido, coloque um pedaço do tamanho de uma ervilha em um tubo com tampa de rosca de dois mililitros contendo esferas de sílica estéreis e um mililitro de DMEM 10 e homogeneíze aqui.Um magnetizador é usado a 6.000 RPM durante um minuto. Se estiverem sendo usadas amostras fecais, homogeneíze não mais do que três pelotas fecais da mesma maneira, congele as amostras homogeneizadas a menos 80 graus Celsius e descongele o inóculo no dia do ensaio de placa. Use uma pipeta repetidora para dispensar 1,35 mililitros de DMEM 5 em cada poço de uma placa de 24 poços e, em seguida, pipete 0,15 mililitros do terceiro inóculo viral no primeiro poço da placa.Realize diluições seriadas de dez vezes, aspirando 0,15 mililitros da primeira diluição de 10 elevado a menos um e transferindo para o segundo poço da placa para obter uma diluição de 10 elevado a menos dois. Em seguida, repita o processo com a diluição do segundo poço para obter uma diluição de 10 elevado a menos três. Observe que diluições adicionais, até 10 elevado a menos nove, podem ser necessárias, dependendo da amostra.Uma vez preparadas as diluições seriadas, rotule as placas com culturas de células RAW 264.7 entre 60 e 80% confluentes com os nomes das amostras e a diluição utilizada. Em seguida, remova todo o meio de uma das placas por aspiração ou descarte rápido e adicione 0,5 mililitros de uma amostra diluída a um poço. Repita o procedimento em um poço duplicado e, em seguida, prossiga para a próxima diluição mais baixa.Após as três diluições terem sido adicionadas a uma placa em duplicata, incline a placa para frente e para trás para garantir que todas as células tenham sido cobertas. Repita o procedimento com a próxima placa de células. Após todas as placas terem sido tratadas, coloque-as em um agitador orbital regulado em aproximadamente 18 oscilações por minuto durante uma hora à temperatura ambiente; aqueça em forno de micro-ondas um frasco com agar previamente preparado e/ou esterilizado até que derreta.Em seguida, coloque os ágaros fundidos em um banho-maria a 42 graus Celsius para equilibrar à temperatura. A seguir, misture os ágaros fundidos com meio 2 XMEM estéril em um frasco estéril na proporção de um para um. Coloque o frasco contendo esta solução de sobrecamada em um banho-maria a 37 graus Celsius até o momento do uso.Após a incubação de uma hora, aspire o inóculo de cada poço e adicione lentamente dois mililitros da solução de cobertura a cada poço, garantindo que a ponta da pipeta seja colocada contra a parede de cada poço. Para evitar deslocar as células, cubra as placas e deixe a cobertura solidificar por aproximadamente 10 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, transfira as placas para o incubador de cultura de tecidos por 48 horas.Após o período de incubação, verifique as placas quanto à presença de placas. Se nenhuma placa for visível, retorne as placas ao incubador e verifique novamente após quatro horas. Repita o procedimento, se necessário, mas a incubação não deve exceder 72 horas.Primeiro, prepare a solução corante de vermelho neutro. Em seguida, adicione dois mililitros da solução de vermelho neutro a cada poço; para este protocolo, não é necessário remover o tampão aros. Incube as placas a 37 graus Celsius por uma hora.Após o tempo de incubação ter decorrido, verifique as placas quanto à presença de placas, mantendo a solução de vermelho neutro nos poços. Se nenhuma coloração for aparente, incube as placas por mais uma hora, até um máximo de três horas. Assim que as placas ficarem visíveis, aspire a solução de vermelho neutro, garantindo que a tampa levantada não seja perturbada, e então prossiga para a contagem das placas.Examine as placas e identifique a diluição em que as placas estão claramente separadas. Coloque a placa sobre uma caixa de luz e conte as placas, marcando um ponto sobre cada placa contada. Para evitar contagens duplicadas.Em seguida, repita a contagem em um poço com uma diluição diferente do vírus e calcule o título viral em unidades formadoras de placa por mililitro. De acordo com as instruções no protocolo escrito, esta imagem representativa mostra uma monocamada antes da infecção. As células RAW 264.7 foram cultivadas durante a noite e analisadas em microscópio óptico com aumento de 20 vezes.Esta imagem mostra a mesma monocamada após a formação de placas. As células foram coradas com uma solução de vermelho neutro a 0,01% após 48 horas de infecção e visualizadas em um microscópio óptico com ampliação de quatro vezes. Os numerais romanos um, dois e três indicam três placas visíveis.Esta imagem mostra uma placa ao final do protocolo de ensaio de placa, com poços em duplicata de três diluições sucessivas de dez vezes, rotulados com numerais romanos. Os poços um e quatro correspondem à diluição 10 elevado a menos um. Os poços dois e cinco correspondem à diluição 10 elevado a menos dois, e os poços três e seis correspondem à diluição 10 elevado a menos três.O título viral da amostra está indicado abaixo. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de trocar as ponteiras da pipeta entre as diluições para evitar contaminação cruzada entre as amostras, equilibrar as soluções à temperatura correta e não deixar as monocamadas celulares secarem. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio de placa e quantificar partículas infecciosas de mirovírus.Não se esqueça de que, ao trabalhar com Mira Norovirus em uma cabine de segurança biológica, precauções como o uso de luvas e avental devem sempre ser tomadas durante a realização deste procedimento, e os resíduos devem ser descartados adequadamente seguindo as diretrizes estabelecidas pelo comitê local de biossegurança.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Os norovírus são a principal causa de gastroenterite ainda técnicas moleculares para sua caracterização são ainda relativamente novo. Aqui relatamos duas diferentes abordagens genética reversa para a recuperação eficiente de norovírus murino (MNV), o único membro do gênero que podem ser propagadas em cultura de células.

Recuperação de reversão genética mediada por norovírus Murina Infecciosas

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar a ligação de partículas semelhantes a vírus de norovírus humano (VLPs) a bactérias intestinais humanas. As suspensões bacterianas são misturadas com as VLPs e incubadas para permitir a formação de complexos VLP-bactérias. Os complexos são então marcados com anticorpos específicos de VLP marcados com fluoróforo, seguidos de visualização e quantificação baseadas em citometria de fluxo para identificar a porcentagem de bactérias ligadas à VLP.

Um ensaio para quantificar a ligação de VLPs de norovírus humano a bactérias intestinais

Os ensaios de placa são o padrão-ouro para quantificação viral, utilizando sobreposições de aprisionamento em monocamadas celulares hospedeiras para determinar os títulos virais. Embora várias sobreposições semissólidas tenham sido tradicionalmente usadas, aqui demonstramos técnicas de placa comparando sobreposições semissólidas a uma nova celulose microcristalina líquida entre várias famílias de vírus.

Concentração Determinação Viral Através de placa Ensaios: Usando tradicionais e novos Sistemas de sobreposição

Aqui apresentamos um procedimento para quantificar enterovírus e norovírus em águas ambientais e potáveis usando PCR quantitativo de transcrição reversa. A recuperação média do vírus das águas subterrâneas com este procedimento padronizado do Método EPA 1615 foi de 20% para o poliovírus e 30% para o norovírus murino.

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

Este estudo descreve uma   -Imagem baseada ensaio de micro-neutralização para analisar as relações antigênicas entre vírus. O protocolo emprega um digitalizador de mesa e tem quatro passos, incluindo titulação, a quantificação de titulação, neutralização, e quantificação de neutralização. O ensaio funciona bem com pdm09 corrente circulante vírus influenza A (H1N1), A (H3N2), e B vírus.

Optimização de um Micro-quantitativa Ensaio de neutralização

Uma metodologia de amostragem baseada em macroespuma foi desenvolvida e avaliada para a detecção e quantificação de norovírus em superfícies duras ambientais.

Swab método de amostragem para a detecção do norovírus Humano em Surfaces

Aqui nós apresentamos dois protocolos, um para medir a taxa de crescimento específico e outro para a capacidade de ligação de celular de rotavírus usando o ensaio de placa e RT-qPCR. Esses protocolos são disponível para confirmar as diferenças de fenótipos entre cepas de rotavírus.

Ensaios para a taxa de crescimento específico e a capacidade de ligação de celular de rotavírus

O objetivo deste protocolo é quantificar a ligação do norovírus humano eucaiótico às bactérias. Após a realização de um teste inicial de fixação vírus-bactéria, a citometria de fluxo é usada para detectar bactérias viralmente ligadas à população.

Quantificando partículas semelhantes a vírus norovírus humanos ligando-se a bactérias commensal usando citometria de fluxo

Aprenda a realizar ensaio de placas para quantificar partículas infecciosas de norovirus murino em macrófagos de camundongo. Este método viabiliza estudos de infectividade viral e dinâmica de infecção.

Ensaio de placas para Norovirus Murine

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