Name: Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Aprenda a medir perfis metabólicos in vivo em embriões de zebrafish usando o analisador Seahorse XF 24. Este método permite comparar função mitocondrial em organismos inteiros geneticamente ou farmacologicamente modificados.

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Os autores gostariam de agradecer aos membros do pessoal da Facilidade Deakin University Zebrafish para a prestação de cuidados de criação excelente curso. YG é apoiado por uma Bolsa de Investigação Alfred Deakin pós-doutorado e um Grant Central de Pesquisa da Universidade Deakin. SLM é apoiado por uma Bolsa NHMRC Desenvolvimento de Carreira. ACW é apoiado por um Grant NHMRC de habilitação. Todos os autores são suportados pelo Molecular e Centro Médico de Pesquisa de Pesquisa Estratégica da Universidade Deakin.

Parte 1: Tratamento Químico de Embriões Zebrafish <ol><li> Coletar embriões zebrafish após a fertilização. Incubar a 28,5 ° C em meio de Nota E3 em 100 x 15 milímetros pratos de Petri:. Para a hibridização in situ ou óleo-Red-O coloração, 1-fenil-2-tioureia (PTU) a uma concentração final de 0,2 mM é adicionado a inibir a formação de pigmentos, 1, mas não é necessário para a análise Seahorse. </li><li> Para os estudos farmacológicos, adicione a química requerida para uma concentração final adequada para o desenvolvimento de embriões de peixes-zebra a cerca de 26 hr pós-fertilização (hpf), com uma nota de veículo somente para o controlo adequado:. Sensíveis à luz, para inibidores farmacológicos, os embriões podem ser autorizados a desenvolver em o prévio escuro para análise. </li></ol> Parte 2: Perfil Metabólico ao vivo usando o cavalo marinho XF 24 Analyser <ol><li> Antes de cada corrida, o cavalo marinho XF cartucho Analyser 24 que abriga o 2 O e H <saté&gt; + fluoróforos é calibrado por meio de um processo automatizado realizada pelo analisador. </li><li> Preparação da placa de 24 poços de ilhotas XF 24. A seguinte seqüência experimental é empregado: <ol><li> Uma vez que o consumo de oxigénio é sensível a variações de temperatura, quatro poços são usadas para controlar as flutuações de temperatura possíveis através da placa. Estes poços não contêm embriões, mas são preenchidos com 700 ul de meio E3 (Figura 2A). </li><li> Os restantes 20 poços (ver parte 2.2) são preenchidos com 700 ul de meio E3 e um embrião cada (Figura 2B). </li><li> Para cada experiência, 10 embriões foram tratados com o veículo apenas (controlo) e 10 tratados com o inibidor químico (tratado). Embriões de controlo e tratado são alternados (por exemplo, bem A2: embrião de controlo; bem A3: embriões tratados com: A4 bem: embrião de controlo; embrião A5 assim tratado, etc.) </li><li> Uma captura de tela ilhota é adicionado no topo da. cada poço para assegurar que a amostra se mantenha na câmara de medição em todo o ensaio (Figura 2B) Nota: tratados quimicamente embriões permanecem com a solução química original durante todo o processo, sem a necessidade de lavar o produto químico, antes de executar o analisador Seahorse programa. </li><li> Uma vez terminado, a placa é carregada no Analyser Seahorse e o ensaio é iniciado. </li></ol></li><li> A análise de amostras. Dois ensaios diferentes são rotineiramente realizados. <ol><li> Programa de respiração basal respiração / Máximo (duração de aprox. 90 min). Alterações na respiração basal subjacente disfunção metabólica, enquanto que a respiração máxima é uma medida da capacidade total de produção de energia e as alterações neste parâmetro associado com um número de estados patológicos e fisiológicos tanto. A capacidade respiratória de reserva, ou a capacidade para o sistema para aumentar a produção de ATP, é também calculadaa partir deste teste pela subtração dos basal de respiração máxima. Três repetições de cada mistura (2 min) / espera (1 min) / medição (2 min) ciclo é realizado para estabelecer primeiro respiração basal. No final do terceiro ciclo, a uma concentração final de 2,5 uM de FCCP (mitocondrial protonophore / desacoplador) é adicionado a cada poço permitindo a medição da respiração máxima. O ciclo de medição é então repetido 5-8 vezes (Figura 3). </li><li> ATP programa vazamento de volume de negócios / Proton (duração aprox. Min 60). Respiração devido ao volume de negócios ATP representa a principal função da mitocôndria na forma de produção de ATP, enquanto a respiração devido a vazamento de prótons, ou respiração desacoplado, está intimamente ligado com outros parâmetros da função mitocondrial, incluindo respiração basal e formação de espécies reativas de oxigênio. Respiração devido à rotação de ATP é representada pela diferença de respiração após a adição de 25 uM oligomicina (um inibidor do ATP-sintase), em comparação com a respiração basal. Respiração desacoplado, ou respiração devido a fugas de protões, é determinada através do cálculo da diferença entre a oligomicina mediada respiração e respiração após a adição de 25 uM rotenona (um inibidor do complexo I). Ciclos de medição são repetido 8 vezes, após a adição de cada um inibidor mitocondrial. </li></ol></li></ol> No final dos ensaios, os valores médios de controlo 10 e 10 embriões tratadas quimicamente são calculados. Parte 3: Oil-Red-O Coloração <ol><li> Os embriões a 50 hpf são dechorionated utilizando uma pinça fina e fixadas em PFA a 4% durante a noite a 4 ° C. </li><li> Oil Red-O-coloração é realizada, tal como anteriormente descrito 2 (ver Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li>
<li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652(2011).</li>
<li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li>
<li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes%3A+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li>
<li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Endocrinol.+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li>
<li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li>
<li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Zebrafish é um modelo bem estabelecido genético para a frente (ENU mutagénese) e reverso (Tilling, dedo de zinco nuclease específica de knock-out, knockdown morfolino) abordagens genéticas 3,4, enquanto que a função do gene em embriões de peixe-zebra também podem ser facilmente bloqueados ou activados selectivas compostos farmacológicos específicos para os produtos codificados. Devido ao seu desenvolvimento e externo pequeno tamanho, de embriões zebrafish são particularmente adequadas para análise metabólica. No entanto, a medição do perfil metabólico robusto e função mitocondrial in vivo em embriões de peixe-zebra não tenha sido alcançado, com apenas uma descrição preliminar relatada 5. Análise Seahorse foi originalmente concebido para os estudos baseados em células metabólicas e tem sido demonstrado para dar resultados precisos e fiáveis ​​6. A aplicação desta nova metodologia de embriões zebrafish é significativo, e provavelmente para aumentar o uso mais amplo deste modelo para estudos metabólicos. Neste estudo, demonstramos a medição de uma série de parâmetros da respiração em embriões de peixes-zebra usando o Analisador Seahorse, incluindo respiração basal, respiração máxima, a capacidade respiratória de reposição, o volume de ATP e vazamento de prótons. Também fornecemos um exemplo de como tais medições podem ser correlacionados com outros parâmetros fisiológicos, neste caso, acumulação de lípidos e da utilização de inibidores farmacológicos neste sistema de ensaio. Combinado com o uso de embriões geneticamente alterados, isso proporciona uma poderosa plataforma experimental para a compreensão de fatores que impactam sobre o metabolismo. Há uma variedade de aplicações para esta nova metodologia, com a disfunção mitocondrial está implicada em muitas doenças humanas, tais como Diabetes mellitus 7, obesidade 8, esclerose múltipla 9, doenças de Parkinson 10, a doença de Alzheimer 11 e algum tipo de cancros 12. É importante ressaltar que our trabalho é realizado in vivo, em que todas as influências ambientais - tais como as citoquinas, o desenvolvimento relacionado com o crescimento, etc - são activas, proporcionando assim uma vista fisiologicamente relevante na respiração vivo e metabólico. Como telas químicas também são rotineiramente realizados em tipo selvagem e mutantes de peixe-zebra embriões de fundo (Figura 1), produtos farmacêuticos novos que influenciaram a respiração, função mitocondrial ou metabolismo possam ser facilmente identificados utilizando o analisador Seahorse. Os resultados obtidos utilizando o analisador Seahorse poderia ser usado em conjunto com outros ensaios para fornecer informações adicionais. Isto pode incluir a análise fisiológico, tais como óleo de coloração vermelho-, ou a análise molecular, tais como hibridação in situ por adipócitos marcadores específicos tais como cebpα, PPARa, PPARy, etc FAS Restam algumas limitações para esta metodologia. Embora nós e outros foram capazes de usar a medição oligomicinaure produção de ATP e de vazamento de protões em embriões jovens 5 (ver Figura 3), em embriões com mais de 60 tratamento oligomicina hpf é ineficiente. Acreditamos que em embriões mais antigos oligomicina não pode difundir tão facilmente do que em embriões jovens que fazem os resultados impossíveis de interpretar. Como os resultados oligomicina são obrigatórios para a determinação da respiração devido à ATP volume de negócios e respiração desacoplado, estamos investigando maiores concentrações de oligomicina de embriões mais velhos. No entanto, antimicina A tratamentos eficazes permanecem por mais tempo, com outras medidas, tais como a respiração basal, respiração e da capacidade respiratória máxima de reposição, podem ser realizados em embriões mais velhos zebrafish, até 68 hpf (não mostrado). Outra limitação na utilização da configuração corrente Analyser Seahorse é o espaço físico no interior de cada uma das placas de captura de ilhota bem, de tal forma que eles só são adequados para os embriões zebrafish e larvas jovens. Portanto, a realização MetabolEstudos sobre ic obesidade induzida por dieta, em peixes adultos, por exemplo, ainda não é tecnicamente viável. No entanto, este estudo pode propiciar o desenvolvimento de placas projetadas especificamente para juvenis e adultos, ampliando assim o escopo de análises possíveis.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> XF 24 analisador de fluxo extracelular </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> 24 formato bem </td></tr><tr><td> Islet microplaca de Captura </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> 24 formato bem </td></tr><tr><td> XF solução de calibração </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XF Médio Ensaio </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Oil-Red-O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-fenil-2-tioureia (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (médio embrionário) </td><td> Self made </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100X15 milímetros placas de Petri </td><td> Falcão </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomicina </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Antimicina A </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

análise do perfil metabólico de embriões zebrafish

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A meta de crescimento no campo do metabolismo é determinar o impacto da genética em diferentes aspectos da função mitocondrial. Compreender essas relações vão ajudar a entender a etiologia subjacente para uma série de doenças relacionadas à disfunção mitocondrial, como diabetes e obesidade. Os recentes avanços na instrumentação, tem permitido o monitoramento de parâmetros distintos de função mitocondrial em linhas de células ou explantes de tecido. Aqui apresentamos um método para uma análise rápida e sensível de parâmetros da função mitocondrial in vivo durante o desenvolvimento embrionário zebrafish utilizando o cavalo marinho de biociências XF 24 analisador de fluxo extracelular. Este protocolo utiliza o Captura Islet microplacas onde um único embrião é colocado em cada cavidade, o que permite a medição da bioenergética, incluindo: (i) a respiração basal, (ii) da respiração mitocondrial respiração basal (iii) mitocondrial devido à rotação de ATP, (iv) mitocondrial respiração desacoplado ou prOton vazamento e (iv) a respiração máxima. Utilizando esta abordagem parâmetros da respiração zebrafish embrionárias podem ser comparadas entre o tipo selvagem e os embriões geneticamente alteradas (mutante, a sobre-expressão do gene ou gene knockdown) ou aqueles manipulado farmacologicamente. Prevê-se que a disseminação de este protocolo irá proporcionar aos investigadores novas ferramentas para analisar a base genética de doenças metabólicas in vivo neste modelo relevante vertebrado animal.

<html> Estamos interessados ​​em compreender o papel de genes específicos no metabolismo, especialmente a taxa de respiração e metabolismo lipídico. Portanto, tratamos os embriões zebrafish tipo selvagem a partir de 26 em diante HPF com um inibidor específico farmacológico da enzima codificada por um destes genes. Aos 50 hpf, metade do veículo e tratados com inibidor embriões foram analisados ​​utilizando o Seahorse para a função mitocondrial, enquanto a outra metade foi fixada em 4% de PFA durante a noite a 4 ° C e subsequentemente coradas durante a deposição de lípidos com Oil Red-O-. O tratamento com o inibidor da enzima específica conduziu a ~ um aumento de 2 vezes na respiração basal (Figura 4A), a qual estava associada a um aumento da deposição de lípidos, especialmente no telencéfalo e debaixo da vesícula ótica (Figura 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Representação esquemática do tratamento químico de embriões de zebrafish. Selvagem, geneticamente manipuladas, ou farmacologicamente tratada embriões zebrafish são de fundo. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Figura 2. XF24 placa ilhota configurado. (A) contêm quatro poços médio embrionário apenas como controlo de temperatura (marcado por um X) e os outros contêm um embrião / cavidade. (B) Close-up de um bem (C6) mostrando um 50 hpf embrião tipo selvagem tratados com o veículo (DMSO) coberto por uma tela de captura ilhota (seta). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Figura 3. Respiratparâmetros de iões de tipo selvagem 50 embriões zebrafish HPF. (A) Para cada medição, a média dos 20 embriões individuais são apresentadas. Respiração basal (média: 299,7; DP: 75,7; SEM: 16,9), respiração máxima (média: 387,4; DP: 93,3; SEM: 20,9), Capacidade respiratória Spare (média: 87,7; DP: 72,0; SEM: 16,1). (B) Para cada medição, a média dos resultados individuais 20 é apresentado. Respiração mitocondrial basal; respiração mitocondrial devido a ATP volume de negócios; respiração mitocondrial desacoplada e não-mitocondrial respiração. MT: mitocondrial; SRC: a capacidade respiratória Spare, DP: Desvio Padrão, SEM: erro padrão da média. Os resultados são apresentados em pmol de O 2 consumido / min / embrião. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Repreresultados representativos da exposição a substâncias químicas sobre a respiração basal e deposição de lípidos. (A, B) de embrião de hpf 50 coradas com Oil Red O, em vista lateral. O embrião incubado com o inibidor selectivo (B) mostra a coloração mais Oil Red-O-, no telencéfalo (ponta de seta) e por baixo da vesícula ótica (seta) em comparação com um embrião de controlo tratado com veículo. (C) mostra uma respiração Basal ~ 2 vezes de aumento em embriões quimicamente tratado (n = 10 embriões por grupo). Os resultados são apresentados em pmol de O 2 / min / embrião.

Zebrafish representam um modelo de vertebrados poderosa que tem sido sub-utilizado para estudos metabólicos. Aqui descrevemos uma forma rápida para medir a<em&gt; In vivo</em&gt; Perfil metabólico de zebrafish desenvolvimento que permite a comparação dos diferentes parâmetros da função mitocondrial entre geneticamente ou farmacologicamente embriões manipulados, aumentando assim a aplicabilidade deste organismo.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

Um objetivo crescente no campo do metabolismo é determinar o impacto da genética em diferentes aspectos da função mitocondrial. Compreender estes...

O objetivo geral do protocolo a seguir é medir o perfil metabólico de embriões de peixe-zebra em resposta a alterações genéticas ou fisiológicas específicas. Isso é alcançado primeiramente pela modulação de uma via genética ou fisiológica particular por meio de um composto farmacológico seletivo. Em seguida, quando os estágios de desenvolvimento desejados forem atingidos, a respiração basal é medida em embriões controle e tratados utilizando o analisador seahorse XF 24.Em seguida, os parâmetros de respiração são calculados a partir dos dados, obtendo-se resultados que revelam que os perfis metabólicos podem ser estudados no peixe-zebra em desenvolvimento in vivo, e que esses perfis podem ser modulados por meio da ativação de um gene específico durante o desenvolvimento embrionário. A principal vantagem do método em relação às técnicas já disponíveis, como ensaios baseados em células ou medições indiretas da respiração, é que se trabalha com o organismo inteiro, um embrião completo, permitindo analisar todos os aspectos da respiração mitocondrial. Esta técnica pode ajudar a responder questões fundamentais na área do metabolismo por meio da medição da respiração e da função mitocondrial em animais inteiros.Para iniciar o tratamento, colete embriões de peixe-zebra após a fertilização para hibridização in C dois ou coloração com vermelho de óleo O em 0,2 milimolar um, PHENYL dois, theo uia. Para prevenir a formação de pigmento, incube os embriões por cerca de 26 horas. Adicione o composto desejado em uma concentração final apropriada com um controle contendo apenas veículo antes de utilizar o analisador Seahorse XF 24, execute a calibração que aloja o oxigênio e a força fluoro de hidrogênio para preparar a placa de ilhotas XF 24 de 24 poços.Inicie adicionando 700 microlitros de meio E três a cada poço. Em seguida, adicione um embrião a 20 dos poços para garantir que o espécime permaneça na câmara de medição. Durante todo o ensaio, aplique uma tela de captura com orifício na parte superior de cada poço.Dez dos poços são usados para embriões controle indicados com C e dez dos poços são usados para embriões tratados indicados com T. As caixas pretas indicam os poços sem embriões, que são usados para controlar flutuações de temperatura ao longo da placa. Agora, carregue a placa no analisador Seahorse. Para medir a respiração, utilize o programa de respiração basal e respiração máxima para estabelecer a respiração basal.Meça três vezes, durante dois minutos cada vez, esperando um minuto entre cada medição, em seguida, na protonofora mitocondrial FCCP em concentração final de 2,5 micromolar. Repita o ciclo de medição de cinco a oito vezes após estabelecer a respiração basal. Utilize o programa de rotação de ATP e vazamento de prótons para medir a rotação de ATP com 25 micromolar de oligomicina, inibidor da ATP sintase, e realize o ciclo de medição oito vezes.Em seguida, utilize os valores de respiração resultantes para calcular a diferença entre a respiração com ligante e a respiração mediada e a respiração basal. Repita este processo adicionando 25 micromolares de rotenona, um inibidor do complexo I. Em seguida, determine a respiração desacoplada calculando a diferença entre a respiração oligomicina-mediada e a respiração após a adição de rotenona quando o programa estiver concluído.O analisador de seahorse calcula os valores médios dos 10 embriões controle e dos 10 embriões tratados quimicamente para realizar o ensaio de óleo. Coloração com vermelho de óleo para analisar o depósito de lipídios. Quando os embriões tratados e não tratados atingirem 50 horas pós-fertilização, utilize pinças finas para manipulá-los e fixá-los em paraformaldeído 4% em PBS durante a noite a quatro graus Celsius.Lave os embriões uma vez em PBT durante cinco minutos, depois incube-os em propanol a 60% por uma hora, seguido de duas horas em óleo vermelho O a 0,3% e propanol a 60%. Enxague brevemente os embriões duas vezes em propanol a 60%, seguido por uma vez em PBT. Finalmente, transfira os embriões para 30 a 50, e então para glicerol a 75% para fotografia, conforme mostrado aqui. O tratamento dos embriões com um inibidor enzimático específico levou a um aumento de cerca de duas vezes na respiração, o que foi associado a um aumento no depósito de lipídios, especialmente no cefalópodo e abaixo da vesícula otica. Ao tentar este procedimento, é importante trabalhar com embriões no mesmo estágio de desenvolvimento.Isso é particularmente verdadeiro quando se está comparando a respiração mitocondrial entre um embrião controle e um embrião mutante ou tratado farmacologicamente, que pode apresentar um certo atraso no desenvolvimento. Assim, o desenvolvimento dessa técnica permitiu aos pesquisadores na área do metabolismo explorar a respiração de animais inteiros e a função mitocondrial utilizando peixe-zebra como modelo vertebrado.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Relata-se o desenvolvimento de um sistema automatizado para geração de imagens e análise de zebrafish embriões transgênicos em placas de vários poços. Isso demonstra a capacidade de medir os efeitos dose-dependente de uma pequena molécula, BCI, na expressão do gene Fator de Crescimento de Fibroblastos repórter e fornecer tecnologia para o estabelecimento de high-throughput telas química zebrafish.

Desenvolvimento de imagem automatizada e análise química para as telas de zebrafish.

Este vídeo demonstra o uso da cromatografia gasosa headspace para determinar as concentrações de etanol em embriões de peixe-zebra. Este método fornece uma ferramenta útil para análise qualitativa e quantitativa de compostos orgânicos voláteis.

Cromatografia gasosa Headspace: uma técnica para avaliar a concentração de etanol em embriões de peixe-zebra

Aqui relatamos um protocolo para medir o estresse oxidativo em embriões vivos de peixe-zebra. Este procedimento permite a detecção de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tecidos embrionários inteiros e populações unicelulares. Este protocolo realizará análises qualitativas e quantitativas.

Análise do estresse oxidativo em embriões Zebrafish

O peixe-zebra é um importante organismo modelo para o estudo da homeostase energética.  Ao utilizar um indicador redox sensível ao NADH2, alamar Blue, desenvolvemos um ensaio que mede a taxa metabólica de larvas de peixe-zebra em um formato de placa de 96 poços e pode ser aplicado à descoberta de medicamentos ou genes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Energia Despesas Assay

Este protocolo apresenta uma abordagem para a análise do transcriptoma toda de zebrafish embriões, larvas, ou células de classificados. Nós incluímos o isolamento do RNA, análise de caminho de dados de RNASeq e validação de qRT-PCR-baseados de mudanças de expressão do gene.

Preparação da amostra e análise de dados da expressão do Gene RNASeq-baseado de Zebrafish

Zebrafish recentemente foram usados como um sistema de modelo na vivo para estudar tempo de replicação do ADN durante o desenvolvimento. Aqui está detalhado os protocolos para o uso de embriões de peixe-zebra para sincronismo de replicação de perfil. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para estudar tempo de replicação em mutantes, tipos de células individuais, modelos de doença e outras espécies.

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

Este trabalho descreve um protocolo para quantificar os níveis de etanol em um embrião de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça de métodos de exposição adequados ao processamento de embriões e análise de etanol.

Quantificação dos níveis de etanol em embriões de zebrafish usando cromatografia de gás espacial da cabeça

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Este protocolo descreve um procedimento de triagem de drogas em larvas de peixe-zebra 3-7 dias após a fertilização, seguido de avaliação morfológica.

Triagem de pequenas moléculas e testes de toxicidade em larvas de peixe-zebra em estágio inicial

RASopatias são síndromes genéticas multissistêmicas causadas pela hiperativação da via RAS-MAPK. Variantes potencialmente patogênicas que aguardam validação surgem continuamente, enquanto evidências pré-clínicas fracas limitam a terapia. Aqui, descrevemos nosso protocolo in vivo para testar e validar os níveis de ativação de ERK associados à RASopatia e sua modulação farmacológica durante a embriogênese por imagens FRET ao vivo em peixe-zebra Teen-reporter.

Um protocolo eficiente para avaliar a modulação da atividade de ERK em modelos iniciais da síndrome de Noonan do peixe-zebra por meio de microscopia FRET ao vivo e imunofluorescência

Este protocolo descreve um método de microscopia de luz de baixo custo para avaliar a morfologia e função cardíaca em embriões de peixe-zebra, permitindo a avaliação reprodutível da cardiotoxicidade do desenvolvimento sem a necessidade de sistemas avançados de imagem.

Imagem cardíaca funcional em embriões de peixe-zebra usando microscopia padrão e análise de vídeo: aplicações em pesquisa ambiental e biomédica

Aprenda a medir perfis metabólicos in vivo em embriões de zebrafish usando o analisador Seahorse XF 24. Este método permite comparar função mitocondrial em organismos inteiros geneticamente ou farmacologicamente modificados.

Análise do Perfil Metabólico de embriões Zebrafish

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