Name: Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Aprenda a enumerar populações de leucócitos em sangue periférico fresco usando tubos TruCount e citometria de fluxo. Este método padronizado garante resultados consistentes em ensaios clínicos multicêntricos.

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Agradecemos Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain e Stephen Voght para a sua assistência no desenvolvimento deste método manuscrito, e vídeo. Este trabalho foi financiado pela Fundação Bill e Melinda Gates CAVD concessão 38.645 (MJM) e do Instituto Nacional de Saúde concede UM1 AI068618 e U01 AI069481 (MJM). EA-N. é suportado pelo NIH Grant T32 AI007140. Agradecemos a confiança James B. Pendleton Charitable por sua doação de equipamentos generoso.

Nota: Para proteger os anticorpos fluoróforo conjugados da luz, executar todas as etapas de um gabinete de segurança bio-com a luz. 1. Anticorpo Preparação Painel de coloração <ol><li> O painel de coloração de anticorpos podem ser encontrados na Tabela 1. Concentração de anticorpos deve ser definido por meio de titulação com sangue total e no uso do equipamento de citometria de fluxo e mesmo procedimentos que serão utilizados para adquirir as amostras coradas fenotípicos. </li><li> Uma vez que os títulos de coloração apropriados são determinados, combinar todos os anticorpos para uma mistura única de um tubo de bloqueio-cap. Adicionar tampão de fluxo de lavagem (PBS de Dulbecco, com 2% de calor de soro bovino fetal inactivado), para perfazer um volume total de 100 ul. Dimensionar a mistura para o número de amostras a serem corados. Esta mistura pode ser armazenada a 4 ° C durante até oito semanas. </li></ol> 2. Coloração <ol><li> Se o sangue recolhido é para ser usado para outros fins em addição para este ensaio, defina uma alíquota de lado enquanto os mais sensíveis ao tempo procedimentos são realizados no sangue restante. A alíquota pode ser armazenado à temperatura ambiente durante até 4 horas após a punção venosa sem perda significativa de células. </li><li> Verificar se existe um grânulo intacto pellet no fundo do tubo e Trucount rótulo do tubo para identificar a amostra que está sendo manchadas. Em ensaios clínicos da HVTN, o Laboratório de Sistema de Gerenciamento de Dados (Frontier Ciência e Tecnologia Research Foundation; Amherst, Nova Iorque) é usado para rotular e rastrear amostras coradas. </li><li> Anote os números de lote e datas de vencimento de todos os reagentes. Anote o número de contagem Trucount tubo talão fornecido pelo fabricante no saco de tubos, certifique-se que o número de lote no saco corresponde ao número de lote no tubo. </li><li> Usar a reversão de pipetagem de precisão pipetar 100 uL de sangue total para dentro do tubo Trucount, logo acima do retentor metálico. Evitar manchas de sangue para o lado do tubo. </li><li&gt; Usando técnica (para a frente) regular pipetagem, pipeta 100 uL do painel misto anticorpos (ver Tabela 1) para dentro do tubo Trucount. Tapar o tubo e vórtice a baixa velocidade durante cerca de 15 segundos para misturar. Inspeccionar visualmente o tubo para assegurar que o sedimento do grânulo é completamente dissolvida. </li><li> Incubar o tubo Trucount durante 15 minutos à temperatura ambiente (15-30 ° C), no escuro. </li><li> Se necessário, diluem-se uma alíquota de 10 × solução de lise FACS para 1X utilizando dih 2 O. Adicionar 900 ul de 1 × solução de lise FACS para o tubo. </li><li> Tapar o tubo e agitar no vortex cuidadosamente a baixa velocidade durante cerca de 15 segundos para misturar. Empurre a tampa para baixo firmemente em posição de bloqueio no tubo e vedação com filme de laboratório. </li><li> Armazenar o tubo a -65 ° C a -95 ° C até que a amostra está pronta para a transferência para o laboratório de análise central ou para análise em casa. As amostras são estáveis, nesta fase, durante pelo menos quatro semanas. Se o transporte ou ensaio imediatamente, este passo pode ser omitido. </li></ol> 3. Expedição Nota: As instruções a seguir utilizam um sistema de transporte isolado de Inc., Saf-T-Pak projetado especificamente para transporte de categoria B isentos substâncias biológicas de acordo com a International Air Transport Association e (IATA) regulamentos. Se analisar as amostras no mesmo local que a coloração ocorreu, vá para a seção 4. <ol><li> As amostras podem ser fornecidas imediatamente após a coloração ou depois de terem sido congeladas a -65 ° C a -95 ° C. Enrole cada tubo completamente em papel alumínio e coloque na caixa de espécime manchado. Coloque a caixa de espécime manchada dentro de um saco estanque-poli com material absorvente. </li><li> Colocar o saco à prova de fugas e de poli-conteúdo dentro de um saco Tyvek e vedação com o ar o menos possível no saco. </li><li> Coloque o pacote de amostra (amostra dentro de embalagem secundária) dentro da caixa interna marrom. </li><li> Coloque o interior marrom bboi dentro do peito de isopor, prendendo-o no recuo para evitar deslocamento. </li><li> Encha o peito de isopor com gelo seco (cerca de 8 kg) e coloque a tampa firmemente no peito. </li><li> Segurança fita da caixa de transporte e navio como substância biológica, Categoria B (UN3373) com o gelo seco adequada (UN1845) marcações; seguir IATA PI-650 instruções. </li><li> Após a recepção, as amostras são armazenadas a -65 ° C a -95 ° C até serem analisadas. </li></ol> 4. Descongelamento e Análise por Citometria de Fluxo <ol><li> Retirar a amostra corada do congelador a descongelar à temperatura ambiente, no escuro, antes de recolher no citómetro de fluxo. Se a recolha de dados sobre mais do que uma amostra, padronizar o processo para todos os tubos por escalonamento descongelamento para que os tubos não estão sentados à temperatura ambiente durante mais de 1 hora cada. </li><li> As amostras devem ser obtidas utilizando um citómetro de fluxo de quatro a laser equipado com filtros adequados, tais como o LSR BDII. Utilize calibração citómetro padrão e métodos de compensação de fluorescência para coleta de dados 4. </li></ol> Nota: Não defina limites de dispersão de dispersão para a frente ou de lado durante a coleta de 5. Contas Trucount podem cair abaixo a configuração do limite mais baixo possível para estes parâmetros, causando um subconjunto de contas não devem ser contabilizados durante a análise. Se exigido pelo instrumento, para definir um limite, defina o menor possível Am Ciano limiar de canal. Porque leucócitos CD45 + coradas com o painel será Am Ciano positivo, e os grânulos Trucount também fluorescem no Ciano Am canal, este deve permitir a todos os dados relevantes para ser adequadamente recolhidos. <ol start="3"><li> Vortex do tubo de amostra durante 5 segundos antes de o colocar no citómetro de fluxo. Contas Trucount fluorescência altamente em muitos canais. Portão as contas durante a coleta, encontrando a população que é altamente positivo para o duplo-PE Cy5 e APC (o colo doisrs que mais facilmente distinguir os grânulos das células pode variar, dependendo de instrumentação). Selecione a porta talão como seu portão parar, e registro de dados até pelo menos 20.000 contas são adquiridos. </li><li> Analisar os dados utilizando software apropriado, tal como FlowJo (Treestar; Ashland, OR). Figura 1 mostra o esquema de propagação utilizado para a análise de diferentes populações de leucócitos a partir de um desenho representativo de controlo do sangue. </li></ol> 5. Cálculos Trucount <ol><li> Cada tubo contém uma Trucount pellet liofilizado de partículas fluorescentes. Após a adição de líquido para o tubo e agitação em vórtex, as pérolas devem ser distribuídos igualmente ao longo da amostra. O número de pérolas na pelete varia ligeiramente, o número de lote e podem ser encontrados sobre o saco de armazenamento para os tubos. </li><li> Portão das pérolas Trucount e populações de células, como mostrado na Figura 1 para determinar as contagens de eventos para cada população. Comparando o número de eventos in o portão do talão, o número total de pérolas originalmente no tubo lhe permitirá determinar a proporção da amostra recolhida, a qual pode então ser usada para determinar a concentração absoluta (isto é, células / uL) para cada população. A equação que se segue pode ser utilizado para este fim: concentração celular (# de células / uL de sangue total) = [# eventos / população (eventos # / # grânulo grânulos totais em pellet)] / 100 uL. </li></ol> 6. Resultados representativos <img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> Figura esquema Gating 1. Utilizado para a análise de grandes populações de leucócitos que mostram dados representativos de um voluntário saudável. A) grânulos Trucount (i) são fechado e excluído a partir de células. Granulócitos (ii) são delineadas e lympohcytes e monócitos são divididos em 3 popluations: CD14linfócitos negativos (iii), todas as células CD14 negativas (iv), e não os linfócitos (V). B) CD14 linfócitos negativos são gated para distinguir células T CD4 + (VI), CD8 + T (vii), células B (VIII), CD56 brilhantes células NK (ix), células CD56 dim NK (x), e CD56 negativas células NK (xi). C) Todos células CD14 negativas são gated para distinguir mielóide (xii) e (xiii células plasmocitóide) dendríticas. D) Não são lympocytes fechado para distinguir não-clássicas (xiv), intermediários (xv) e clássica (xvi) monócitos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . Mais subconjuntos de células específicas, que não são mostradas na figura 1 (por exemplo, as células NKT ou neutrófilos) também pode ser distinguido através do painel são apresentadas, e o esquema de gating pode ser ampliado ou modificado para satisfazer as necessidades específicas de estudo. Gating passos certos mostrados são exclusivas para este método. Da nota particular, um portão de inclusão eportão exclusão são desenhados em torno das esferas de Trucount e colocado em cima da outra, de um a porta para as pérolas de contagem, e um para excluir os grânulos a partir da análise celular (Figura 1A). Além disso, como os linfócitos, monócitos, granulócitos e não são tão facilmente distinguidos no sangue total como o são em células mononucleares do sangue periférico por dispersão frontal e lateral de dispersão, gating estas células CD45 usando expressão dispersão lateral e é muitas vezes necessário (Figura 1A). Granulócitos contaminantes (círculos) que não podem ser separados a partir de linfócitos e monócitos CD45 e usando dispersão lateral são distinguíveis em algumas parcelas, pela sua expressão de alto CD16 (Figura 1C e Figura 1D). O número de granulócitos contaminantes é normalmente pequeno, e que não interfiram com a propagação de células de monócitos e células NK.

<ol><li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells%3A+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li>
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<li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li>
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<li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li>
<li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).</li>
<li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li>
<li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis%3A+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li>
<li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets%3A+the+dendritogram%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste relatório, apresentamos um método baseado em talão para enumerar populações de leucócitos no sangue total fresco por citometria de fluxo e cobrir os parâmetros necessários para a sua utilização em um ensaio clínico multicêntrico com a análise da amostra centralizado. Este método baseia-se e otimiza o BD protocolo Trucount e permite seu uso confiável em um ambiente de estudo clínico multicêntrico. O método de coloração é simples e leva cerca de 45 minutos para ser realizado, tornando viável para técnicos de laborat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Trucount absolutos Tubos Contando </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> FACS 10X de Lise Solução </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> Categoria B &amp; Sistema de envio Isento, Duplas </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45 anticorpo monoclonal AmCyan </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> CD3 anticorpo monoclonal FITC </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8 PerCP-Cy 5,5 de anticorpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa Fluor 700 Antibo monoclonaldy </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DR anticorpo monoclonal ECD </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14 anticorpo monoclonal V450 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19 anticorpo monoclonal PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 anticorpo monoclonal APC-H7 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56-PE Cy7 anticorpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC anticorpo monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123 anticorpo monoclonal PE-Cy5 </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

enumeração dos principais populações de leucócitos do sangue periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem sangue

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Criopreservação de leucócitos do sangue periférico é amplamente utilizado para preservação de células para a avaliação da resposta imune, em ensaios clínicos, e oferece muitas vantagens para facilidade e normalização das avaliações imunológicos, mas os efeitos prejudiciais deste processo têm sido observados em alguns subconjuntos de células, tais como granulócitos, células B , células dendríticas e 1-3. Ensaio leucócitos frescos dá uma visão mais precisa do estado in vivo das células, mas é muitas vezes difícil de realizar, no contexto de grandes estudos clínicos. Ensaios com células frescas são dependentes de compromissos voluntários e prazos e, se demorado, sua aplicação pode ser impraticável devido às horas de trabalho necessárias do pessoal de laboratório. Além disso, quando os ensaios são realizados em centros múltiplos, laboratórios com os recursos e treinamento necessários para realizar os ensaios não podem estar localizados em proximidade suficiente para locais clínicos. Para resolver estas questões, temos develvolvido um 11-cor do painel de coloração de anticorpo que pode ser utilizado com tubos de Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) para o fenótipo e enumerar as principais populações de leucócitos no sangue periférico, produzindo mais robusto informação específica do tipo de célula do que os ensaios, tais como um hemograma completo (CBC) ou ensaios com comercialmente disponíveis painéis projetados para tubos Trucount que mancham por apenas alguns poucos tipos de células. O processo de coloração é simples, requer apenas 100 l de sangue total fresco, e leva cerca de 45 minutos, tornando-se viável para o padrão de processamento de sangue laboratórios para executar. É adaptado do tubo Trucount BD ficha técnica ( <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">versão 8/2010</a> ). O cocktail de anticorpos de coloração pode ser preparada antecipadamente a granel em um laboratório de ensaio central e enviado para o laboratório de processamento no local. Tubos coradas podem ser fixadase congelada para a expedição para o laboratório central para análise multicolor análise de citometria de fluxo. Os dados gerados a partir deste painel de coloração pode ser usado para controlar as alterações nas concentrações de leucócitos ao longo do tempo em relação à intervenção e pode ser facilmente desenvolvidas para avaliar os estados de activação de tipos específicos de células de interesse. Neste relatório, nós demonstrar o procedimento usado pelos técnicos de processamento de sangue de laboratório para realização da coloração de sangue total fresco e os passos para analisar estas amostras coradas em um laboratório de ensaio central de apoio de um ensaio clínico multicêntrico. Os detalhes do procedimento de vídeo, uma vez que é realizada no contexto de um ensaio clínico draw sangue no HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

Neste relatório, demonstrar os passos coloração e análise de um ensaio de fenotipagem em sangue total fresco para enumerar grandes inata e adaptativa populações de leucócitos. Ressaltamos considerações para executar estes procedimentos, no contexto de um ensaio clínico multicêntrico.

Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue

A criopreservação de leucócitos de sangue periférico é amplamente utilizada para preservar células para avaliações da resposta imune em ensaios clínicos e oferece diversas...

Este vídeo descreve o procedimento desenvolvido pela Rede de Ensaios Clínicos de Vacinas contra o HIV no Centro de Pesquisa sobre Câncer Fred Hutchinson para coloração de sangue total fresco em ensaios clínicos multicêntricos a serem analisados por um laboratório centralizado. O procedimento utiliza tubos tru count fabricados pela Becton Dickenson biosciences, cada um contendo um pellet liofilizado que se dissolve durante o preparo da amostra, liberando um número conhecido de microesferas fluorescentes. Anticorpos fluorescentes são utilizados para coloração de marcadores de superfície específicos a diferentes populações celulares.O número de células nessas diferentes populações pode ser comparado ao número de microesferas fluorescentes durante a análise de citometria de fluxo, e as concentrações absolutas de diferentes populações de leucócitos no sangue total podem ser monitoradas ao longo do tempo em relação à intervenção. Olá, meu nome é Erica Anderson Nissan e sou cientista colaboradora na Rede de Ensaios Clínicos de Vacinas contra o HIV. O procedimento que você está prestes a assistir é um que desenvolvemos para uso em nossos ensaios clínicos multicêntricos.Nestes ensaios, técnicos de laboratório que processam sangue recebem espécimes de sangue total fresco, coram-nos com anticorpos marcados com fluoróforos e, em seguida, enviam os espécimes a um laboratório centralizado capaz de analisá-los por citometria de fluxo. O sangue total fresco geralmente não é analisado em contextos de ensaios clínicos devido a questões de custo e viabilidade, mas desenvolvemos um painel de coloração com um único anticorpo que pode identificar as principais populações de leucócitos no sangue periférico, e a coloração dessas populações leva menos de 45 minutos, tornando-o viável para uso em ensaios clínicos no HVTN. Estamos utilizando este painel para compreender os eventos iniciais que ocorrem após a vacinação com candidatos a vacinas contra o HIV, mas este painel PI pode ser ainda modificado para focar em tipos celulares de interesse para o pesquisador individual. Muito obrigado por assistir e esperamos que isso seja útil para você no futuro.A Tabela Um mostra um painel de coloração com 11 cores de anticorpos desenvolvido para fenotipar e enumerar as principais populações de leucócitos no sangue periférico. O coquetel de anticorpos é preparado pelo laboratório central de ensaio e enviado aos laboratórios de processamento para garantir a consistência entre os locais e permitir que os coquetéis sejam testados em uma amostra de sangue controle antes de serem usados para colorir as amostras do estudo. Cada anticorpo conjugado fluorescentemente é titulado separadamente e, em seguida, os anticorpos são combinados utilizando as titulações apropriadas em uma única mistura com tampão de lavagem para citometria de fluxo, contendo PBS delcos com 2% de soro fetal bovino aquecido e ativado.O coquetel de anticorpos é identificado com um número de lote e data de validade e enviado do laboratório central do ensaio para os laboratórios de processamento utilizando um sistema de embalagem que mantém a temperatura de quatro graus Celsius durante o transporte. Após recebido, o painel de marcação com anticorpos pode ser armazenado a quatro graus Celsius, ao abrigo da luz, por até oito semanas. A solução de lise BD é utilizada após a marcação para lisar as hemácias e fixar as marcações com anticorpos, ao mesmo tempo em que preserva os leucócitos.A solução é recebida do fabricante em uma concentração 10 x e é diluída na proporção de um para dez pelo laboratório central de ensaios com água desionizada. A solução diluída é então rotulada com um número de lote e data de validade e enviada à temperatura ambiente para os laboratórios de processamento após recebida. A solução Fax lacing é armazenada à temperatura ambiente entre 15 e 30 graus Celsius antes da coleta de sangue para coloração True Count.O laboratório de processamento deve garantir que todos os reagentes apropriados tenham sido obtidos do laboratório central de ensaio. Estes incluem tubos BD TRU count, o painel combinado de marcação com anticorpos e uma solução de licenciamento x fax. O HVTN utiliza um sistema de gerenciamento de dados laboratoriais para registrar todas as informações relevantes de cada amostra.Um código de identificação exclusivo é impresso em uma etiqueta que é colocada no tubo de contagem verdadeira. Para acompanhar a amostra durante todo o processo, rotule um tubo criogênico para identificar a amostra que está sendo corada. Isso geralmente incluirá um identificador do paciente ou voluntário, um identificador de visita e a data da coleta do sangue. Aliquote a quantidade necessária de sangue no tubo criogênico rotulado utilizando técnica asséptica.A quantidade de sangue utilizada para coloração depende do painel de coloração empregado, mas geralmente é de 50 ou 100 microlitros por painel. O tubo criogênico pode então ser reservado por até quatro horas à temperatura ambiente antes da coloração. Mais uma vez, procedimentos sensíveis ao tempo são realizados com o sangue restante.Verifique se há um pellet de esferas intacto no fundo do tubo e identifique o tubo tru count. Com as informações relevantes do espécime, registre os números de lote e as datas de validade de todos os reagentes. Fichas de trabalho são úteis para acompanhar essas informações ao longo de um ensaio clínico.O número de contagem de microesferas e o número do lote do tubo tru count podem ser encontrados na frente do saco de tubos tru count. Quando você estiver pronto para iniciar o processo de coloração tru count, certifique-se de ter todos os materiais e reagentes prontos para uso na cabine de segurança biológica. Estes incluem a alíquota de sangue rotulada como tubo tru count, tubo com painel de anticorpos combinados para coloração, uma solução x fax lacing, micropipetas de 200 microlitros e 1000 microlitros e ponteiras para pipeta, hipoclorito de sódio, filme laboratorial e um cronômetro após a coloração.Você também precisará de uma caixa com espécimes corados, mas ela não precisa estar na capela. A quantidade de sangue e de anticorpo a ser usada varia conforme os tipos de células identificados pelo painel e o número de células necessárias para uma análise adequada. Cada painel é testado em amostras controle para determinar a quantidade ideal de sangue para coloração, sendo a quantidade de anticorpo utilizada igual à quantidade de sangue usada para o painel mostrado neste vídeo.100 microlitros de sangue e 100 microlitros de anticorpo serão utilizados antes da pipetagem. Misture o sangue invertendo suavemente o tubo várias vezes e pipete suavemente para cima e para baixo várias vezes. Para garantir ainda mais que o sangue esteja bem misturado.Em seguida, utilize a pipetagem reversa para pipetar com precisão o sangue total do alíquota para dentro do tubo tru count, logo acima do suporte metálico. Evite espalhar o sangue pela parede do tubo. Substitua a ponteira da pipeta entre cada tubo tru count.Agora é a hora de corar o sangue com o painel de anticorpos antes da pipetagem. Misture o painel de coloração pipetando suavemente para cima e para baixo várias vezes. Adicione 100 microlitros da mistura de anticorpos ao sangue no tubo de contagem verdadeira.Não pipeteie em sentido reverso nesta etapa, pois isso desperdiçará reagente valioso. Tampe o tubo e vortexe em baixa velocidade por aproximadamente 15 segundos para homogeneizar. Certifique-se de que o pellet de esferas esteja completamente dissolvido.Cubra o tubo com papel alumínio e configure um cronômetro para corar o sangue por 15 minutos. A quantidade de solução de corte um x fax necessária é nove vezes a quantidade de sangue utilizada no ensaio; assim, neste exemplo, utiliza-se 900 microlitros de solução de corte um x fax. Após a incubação de 15 minutos, adicione 900 microlitros da solução de corte um x fax ao sangue corado para fixar a coloração e lisar os glóbulos vermelhos.A pipetagem reversa não é necessária nesta etapa. Tampe o tubo e vortexe em baixa velocidade por aproximadamente 15 segundos para homogeneizar. Empurre firmemente a tampa até a posição de travamento e feche bem.Com filme de laboratório. Armazene os tubos em uma caixa escura ou completamente envolvidos em papel alumínio a menos 65 a menos 95 graus Celsius até que sejam enviados ao laboratório central de ensaios. Até o momento, testes demonstraram que as amostras permanecem estáveis por até quatro semanas nesta temperatura; as amostras coradas devem ser enviadas como substâncias biológicas da categoria B, seguindo as normas da Associação Internacional de Transporte Aéreo ou IATA.As regulamentações do HVTN exigem que as amostras sejam enviadas semanalmente dos laboratórios de processamento para o laboratório central de ensaios, utilizando um sistema de transporte isolado da Safety Pack Ink, especificamente projetado para atender a esses requisitos. Ao utilizar este sistema, coloque a caixa marrom interna dentro do recipiente de isopor, fixando-a no rebaixo para evitar deslocamentos. Encha completamente o recipiente com gelo seco e aguarde de cinco a dez minutos para permitir que a caixa esfrie.Para preparar espécimes para envio, envolva completamente cada tubo e folha de alumínio e coloque-os na caixa de espécimes corados. Coloque material absorvente em um saco plástico impermeável junto com a caixa de espécimes corados. Remova o excesso de ar do saco e feche-o firmemente.Coloque o saco plástico impermeável dentro de um saco de Tyvek. Novamente, remova todo o ar do saco antes de fechá-lo. Coloque o pacote com a amostra dentro da caixa marrom interna e feche bem a tampa do recipiente de isopor.Feche firmemente a caixa de transporte com fita adesiva e envie como substância biológica categoria B, com as marcações adequadas de gelo seco. Siga as instruções IATA PI 650 em ensaios clínicos multicêntricos. É importante rastrear as amostras durante as etapas de armazenamento de curto prazo, transporte e armazenamento de longo prazo.O sistema de gerenciamento de dados utilizado pelo HVTN permite a criação de uma lista de remessa que pode ser importada para o banco de dados de espécimes no laboratório central de ensaios, onde as amostras serão armazenadas e analisadas. Isso cria um registro de quando as amostras foram enviadas e recebidas, onde foram armazenadas definitivamente e quando foram retiradas. Para análise, retire a amostra corada do congelador e deixe descongelar à temperatura ambiente em uma caixa escura.Não mais de uma hora antes da coleta no citômetro de fluxo. Se estiver coletando dados de mais de uma amostra, descongele-as em intervalos para que os tubos não fiquem à temperatura ambiente por mais de uma hora. Cada amostra deve ser adquirida usando um citômetro de fluxo de quatro lasers equipado com filtros apropriados, como o BD LSR II, utilizando métodos padrão de calibração do citômetro e compensação de fluorescência para a coleta de dados, se exigido pelo instrumento. Para definir um limiar, ajuste o limiar mais baixo possível no canal amarelo-ciano e vorte o tubo da amostra por cinco segundos antes de carregar no citômetro de fluxo.As microesferas tru count do citômetro fluorescem intensamente em diversos canais. Gater as microesferas durante a aquisição, identificando a população duplamente positiva intensa. Para PE SCI cinco e um PC, observe que as duas cores que mais facilmente distinguem as microesferas das células podem variar conforme o equipamento utilizado.Selecione o gate de microesferas tru count como seu gate de parada e registre os dados até que pelo menos 20.000 microesferas sejam adquiridas. Analise os dados utilizando um software apropriado, como o FlowJo. Agora, vamos percorrer o esquema de gates utilizado para análise das principais populações de leucócitos, utilizando dados de uma amostra representativa de coleta de sangue controle.Subconjuntos celulares mais específicos também podem ser distinguidos utilizando o painel, como células NKT ou neutrófilos, mas estes não serão mostrados neste exemplo. Primeiro, um gate de inclusão e um gate de exclusão são desenhados ao redor das microesferas de contagem tru e colocados um sobre o outro para obter as microesferas para contagem e outra para excluir as microesferas da análise celular. Em seguida, os dados celulares, excluindo as microesferas, são gatados para incluir apenas células únicas utilizando a altura do espalhamento para frente versus a área do espalhamento para frente.Esse gradil também exclui pequenos detritos. As células positivas para CD45 são então selecionadas, separando os granulócitos dos linfócitos e monócitos com base no espalhamento lateral. Os linfócitos e monócitos são então separados em três grupos distintos utilizando CD14 e espalhamento lateral.Estes incluem linfócitos CD14 negativos, todas as células CD14 negativas e não linfócitos; a partir das células do gate de linfócitos CD14 negativos, são inicialmente divididas em três grupos: CD3 positivo CD19 negativo, CD3 negativo CD19 positivo e CD3 negativo CD19 negativo. Os linfócitos T são selecionados a partir do gate CD3 positivo CD19 negativo. Após a exclusão de células CD56 positivas e CD16 positivas, podem ser distinguidos os linfócitos T CD4 positivos e CD8 positivos. As células B são selecionadas a partir do gate CD3 negativo CD19 positivo, após a exclusão de células CD56 positivas e CD16 positivas, e as células NK são selecionadas a partir do gate CD3 negativo CD19 negativo.Após excluir possíveis monócitos contaminantes utilizando CD11c e CD4, as células NK são divididas em populações CD56 brite, CD56 dim e CD56 negativas. Para distinguir a população de células dendríticas, todas as células CD14 negativas são selecionadas para excluir células positivas para CD3, positivas para CD19, positivas para CD56 e positivas para CD16. A partir daí, as células positivas para HLA-DR são selecionadas, e as células dendríticas mieloides e as células dendríticas plasmacitoides podem ser diferenciadas pela sua expressão de CD11c e CD123.Por último, a partir do padrão de não linfócitos, os subconjuntos de monócitos são selecionados após a exclusão de possíveis células contaminantes CD 56 positivas, CD três positivas e CD 19 positivas. Monócitos não clássicos, intermediários e clássicos são diferenciados com base na expressão de CD 16 e CD 14. Uma vez que as populações de interesse são selecionadas, as concentrações podem ser calculadas.Comparar o número de eventos no portão de microesferas com o número total de microesferas originalmente no tubo permitirá determinar a proporção de amostra coletada, que pode então ser usada para determinar a concentração absoluta. Nossas células por microlitro para cada população. A equação mostrada aqui pode ser usada para essa finalidade.Neste vídeo, demonstramos o procedimento utilizado por técnicos de laboratório de processamento de sangue para realizar a coloração em sangue total fresco e os passos para analisar essas amostras coradas em um laboratório central de ensaio. No contexto de um ensaio clínico multicêntrico, demonstramos que o ensaio é simples e de duração relativamente curta, tornando viável que técnicos de laboratório de processamento de sangue o realizem, além de congelar e transferir as amostras para o laboratório de ensaio essencial para análise. A chave para obter resultados precisos e consistentes é padronizar cuidadosamente as etapas críticas do protocolo e utilizar um sistema de documentação que acompanhe todas as etapas, de modo que quaisquer anomalias descobertas possam ser rastreadas até a fonte do problema.Os dados gerados a partir deste painel de coloração podem ser utilizados para acompanhar alterações nas concentrações de leucócitos ao longo do tempo e poderiam facilmente ser aprimorados para avaliar os estados de ativação de tipos celulares específicos de interesse.

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Um dispositivo automático microfluídicos foi desenvolvido para a circulação de enriquecimento de células nucleadas do sangue periférico, através de lise de eritrócitos que garante o isolamento de amostras de alta qualidade sem perda de células.

Protocolo de Lise automatizado microfluídicos de sangue para Enriquecimento de células nucleadas circulantes

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Este vídeo demonstra uma técnica baseada em citometria de fluxo usando dois fluorocromos para identificar células T CD4+ e CD8+, células T γδ, células B, células natural killer (NK) e monócitos em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs). Ao incubar as células com anticorpos conjugados com fluorocromo contra os marcadores de superfície, os subconjuntos de células são identificados usando uma estratégia ideal de controle citométrico de fluxo.

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Uma abordagem automatizada-Semi Preparando Antibody Cocktails para Análise imunofenotípica de Sangue Periférico Humano

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Aqui nós apresentamos um protocolo para caracterizar subconjuntos de monócitos por citometria de fluxo de sangue total. Isso inclui como portão os subconjuntos e avaliar sua expressão de marcadores de superfície de estrutura de tópicos e dando um exemplo da avaliação da expressão de marcadores M2 (anti-inflamatório) e M1 (inflamatória).

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Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue (Vídeo) | JoVE Journal

Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue

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