Síntese de mudança de fase Nanoemulsões com distribuição de tamanho estreita para vaporização Droplet Acústico e Bubble avançada ablação por ultrassom mediada

O objetivo geral do seguinte experimento é observar o efeito das bolhas geradas pela vaporização acústica de nanoemulsões recobertas por lipídios na ablação mediada por ultrassom. Isso é alcançado primeiramente dispersando nanoemulsões recobertas por lipídios em hidrogéis de poli-acrilamida carregados com albumina. Em um segundo passo, um transdutor focalizado transmite pulsos curtos de alta amplitude para o hidrogel, vaporizando localmente as nanoemulsões no ponto focal. Em seguida, as bolhas resultantes são continuamente excitadas por ultrassom, e a energia acústica irradiada por essas bolhas é rapidamente absorvida pelo hidrogel, o que acelera a taxa de aquecimento mediado por ultrassom.

Os resultados mostram que a presença de bolhas reduz drasticamente o tempo e a energia necessários para aquecer o hidrogel acima da temperatura limite para desnaturação proteica, resultando em uma ablação mediada por ultrassom mais rápida e eficiente. O tamanho da nanoemulsão de mudança de fase é um fator determinante crítico no limiar de pressão. Para a vaporização acústica, desenvolvemos um protocolo para produzir nanoemulsões de mudança de fase estáveis com distribuições estreitas de tamanho e limiares de vaporização bem definidos, bem como um sistema in vitro para avaliar o impacto na ablação mediada por ultrassom.

Embora seja descrito um sistema in vitro, a proposta das nanoemulsões é direcionar-se a tecidos extravasculares e tumores sólidos com partículas que podem ser vaporizadas acusticamente. As bolhas formadas então podem ser utilizadas em aplicações diagnósticas ou terapêuticas no tratamento do câncer. Para iniciar o procedimento de preparação de uma nanoemulsão com mudança de fase, ou PSNE, primeiramente misture os lipídios juntos dissolvendo 11 miligramas de DPPC e 1,7 miligramas de DSPE.

Pese 2000 em clorofórmio em um balão de fundo redondo de vidro. Coloque o balão de fundo redondo em um banho-maria a 50 graus Celsius na capela de exaustão química e utilize um fluxo de gás argônio para evaporar o solvente orgânico. Para formar uma película lipídica seca, coloque o balão em um dessecador e deixe sob vácuo durante a noite para desidratar a película lipídica até a manhã seguinte.

Reidrate o filme lipídico com 5,5 mililitros de PBS. Aqueça a solução em banho-maria a 45 graus Celsius até que o filme lipídico se dissolva, para fins de ensaio. Transfira periodicamente a solução lipídica para um frasco de sete mililitros e, em seguida, sonique com um sonicator de prova por dois minutos a 20% de amplitude.

Divida a solução em dois frascos de 2,5 mililitros cada. Os 0,5 mililitros restantes devem ser descartados. Adicione 2,5 mililitros de PBS a cada frasco e, em seguida, coloque ambos os frascos em um banho de água com gelo a zero grau Celsius.

Adicione 50 microlitros de doca fluoro pentano, ou DDFP, a cada tubo. Filho da mistura lipídica DDFP. Em um banho de gelo com água está a parte mais crítica deste procedimento.

O banho de gelo é usado para evitar a evaporação do líquido por fluorocarbono. Durante este processo, sonique cada frasco no banho de gelo usando as seguintes configurações: modo pulsado com 25% de amplitude e tempo total de 60 segundos. Após a sonicação, transfira a solução de PSNE para frascos cintiladores de 20 mililitros, adicionando cinco mililitros de PBS a cada frasco, resultando em um volume final de 10 mililitros por frasco.

Monte o extrusor seguindo as instruções do fabricante para escorvar o extrusor. Pipete 10 mililitros de água desionizada no orifício superior de amostra. Tampe a abertura e aperte a válvula de ventilação.

Abra lentamente a linha de gás nitrogênio para aumentar a pressão, forçando a amostra a passar pelas membranas. Colete a amostra do tubo de saída e extruda o PSNE 16 vezes através de um filtro de 100 nanômetros ou 200 nanômetros para obter uma distribuição estreita de tamanhos. Inicie este procedimento preparando um hidrogel de poliacrilamida contendo PSNE.

Primeiro, prepare uma solução de albumina sérica bovina a 24% ou BSA, dissolvendo 2,4 gramas de pó de BSA em 10 mililitros de água desionizada. Em seguida, prepare uma solução de persulfato de amônio a 10% ou aPS, diluindo um grama de pó de aPS em 10 mililitros de água desionizada. Misture esses reagentes em uma forma de plástico, na seguinte ordem: 2,1 mililitros de solução de acrilamida, 1,2 mililitros de tampão tris, 0,1 mililitros de aPS a 10%, 4,5 mililitros de solução de BSA a 24% e 3,6 mililitros de água desionizada. Aqueça a solução a 40 graus Celsius em banho-maria e, em seguida, coloque sob vácuo por uma hora para desgaseificar o líquido.

Isso é necessário para evitar a formação indesejada de bolhas dentro do hidrogel após uma hora. Remova do vácuo, adicione 480 microlitros de suspensão de PSNE e misture bem girando suavemente a câmara de plástico. Em uma capela de exaustão química, adicione 12 microlitros de tetraetileno diamina ou T-E-M-E-D para polimerizar a acrilamida e coloque a câmara em um banho-maria a 12 graus Celsius por duas horas.

A polimerização é exotérmica, portanto, é necessário um banho frio para evitar a vaporização do PSE durante a polimerização. Uma vez que a acrilamida tenha polimerizado, posicione um transdutor de potência e uma sonda de imagem em um tanque acrílico cheio com água desionizada DGAs, de modo que o plano de imagem coincida com o volume focal do transdutor. Em seguida, posicione o hidrogel de poliacrilamida carregado com PSNE no foco do transdutor de potência, vaporize o PSNE dentro do hidrogel com pulsos acústicos curtos e, em seguida, exponha por 15 segundos em onda contínua para ablação potencializada por bolhas.

À medida que a BSA é desnaturada, o hidrogel torna-se opaco devido à absorção de ultrassom e à geração de calor com a monitorização da vaporização e formação de bolhas usando um scanner de ultrassom diagnóstico. Nesta imagem de exemplo, a seta indica a região focal onde uma nuvem de bolhas foi formada pela vaporização do PSNE. Repita a exposição acústica em uma nova localização no hidrogel sem elevar o PSNE e compare o tempo e o volume de ablação.

Este protocolo resulta em gotículas de perfluorocarbono revestidas com lipídios e com uma distribuição estreita de tamanhos. A distribuição de tamanho medida por espalhamento dinâmico de luz é mostrada aqui para PSNE extrudadas utilizando filtros de 100 e 200 nanômetros. As unidades dos eixos ordenados são baseadas na intensidade da luz espalhada por partículas de um determinado tamanho em relação à intensidade total da luz espalhada pela amostra.

Quando o diâmetro médio e o desvio padrão dos PSNE em um e sete dias após a extrusão com filtros de 100 e 200 nanômetros são medidos usando espalhamento dinâmico de luz, os resultados demonstram que os PSNE são estáveis por pelo menos uma semana. Esta figura mostra imagens no modo B dos PSNE antes e depois da vaporização. Em um hidrogel de poliacrilamida, a seta indica a região focal onde uma nuvem de bolhas foi formada pela vaporização dos PSNE.

Estas são imagens de um hidrogel de poliacrilamida contendo albumina e PSNE antes e depois da vaporização e sonicação com ultrassom focalizado de alta intensidade ou Hy Fu. Uma lesão é formada por 15 segundos de aquecimento mediado por Hy Fu. A forma assimétrica da lesão é resultado do aquecimento pré-focal que ocorre devido à presença da nuvem de bolhas no trajeto do ultrassom. O aquecimento pré-focal e a formação de lesão devido à dispersão pelas bolhas podem ser minimizados pela redução da potência acústica transmitida após seu desenvolvimento.

Este método para produzir nanoemulsões com mudança de fase estável abrirá caminho para pesquisadores na área de terapia mediada por ultrassom explorarem a ablação por HIFU potencializada por bolhas em tumores sólidos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir nanoemulsões com mudança de fase estável e distribuições estreitas de tamanho, além de estudar a nucleação de bolhas e a ablação mediada por ultrassom potencializada.