Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto Em vivo

O objetivo geral deste procedimento é estudar as propriedades eletrofisiológicas e contráteis de uma única unidade motora de camundongo por meio de gravações intracelulares de neurônios motores in vivo. Isso é realizado primeiramente expondo a medula espinhal e o músculo de interesse. Em seguida, um transdutor de força é fixado ao tendão do músculo.

O próximo neurônio motor é estimulado com um eletrodo intracelular, provocando assim a contração da unidade motora registrada. Em última análise, as propriedades eletrofisiológicas do neurônio motor podem ser caracterizadas ao mesmo tempo que as propriedades contráteis da sua unidade motora. A demonstração visual desta técnica é fundamental porque os passos de microcirurgia são muito difíceis de aprender devido ao pequeno tamanho do animal.

Para iniciar o procedimento, anestesie um camundongo injetando pentobarbital de sódio ou uma mistura de cetamina e xilazina por via intraperitoneal. Certifique-se de que o camundongo não apresente reflexo de preensão do dedo. Em seguida, faça um corte sobre a traqueia usando uma tesoura romba e afaste a pele para os dois lados.

Em seguida, separe a glândula salivar com um par de pinças rombas. Para expor dois músculos finos que cobrem a traqueia, separe esses dois músculos para revelar a traqueia. Usando um par de pinças Dumont nº 7.

Deslize dois fios de sutura de seda aut de quatro sob a traqueia. Em seguida, faça um corte transversal na traqueia entre dois anéis cartilaginosos. Porém, tenha cuidado para não seccionar completamente a traqueia.

Agora, insira o tubo traqueal pela traqueia. Fixe ambos os lados da abertura de inserção amarrando os pontos sobre ela. Em seguida, conecte o tubo traqueal a um ventilador para camundongos e a um capnógrafo.

Em seguida, conecte o ventilador ao oxigênio puro por meio de um saco de complacência. Ajuste os parâmetros do ventilador de modo que o camundongo não ofereça resistência à ventilação artificial e a pressão parcial de dióxido de carbono ao final da expiração permaneça estável entre 4 e 5%. Neste passo, exponha a veia jugular em um dos lados do pescoço utilizando técnicas de dissecação romba.

A veia jugular se divide em dois troncos principais, as veias facial anterior e facial posterior. Separe cuidadosamente a veia de seu tecido conjuntivo circundante. Em seguida, deslize dois fios de seda 6-0 sob a veia, mantendo-os separados o máximo possível ao longo do comprimento da veia.

Em seguida, coloque um clipe de vaso pequeno no lado proximal da veia e amarre o lado distal da veia. Usando a tesoura fina de íris, faça uma pequena incisão transversal na veia. Tenha muito cuidado para não seccionar completamente a veia.

Em seguida, insira um cateter de número um francês pré-preenchido na abertura até o clipe vascular que mantém a veia e o cateter juntos. Remova cuidadosamente o clipe vascular. Então, empurre o cateter alguns milímetros a mais para dentro da veia. Fixe o cateter amarrando-o com pontos de sutura em ambos os lados da inserção.

Em seguida, conecte um dos cateteres a uma seringa ou bomba de infusão para injetar doses suplementares de anestésicos, como pentobarbital sódico ou xilazina e cetamina. Repita o procedimento em outra veia e conecte o outro cateter a uma bomba de seringa para uma infusão intravenosa lenta de uma solução de glicose a 4% contendo bicarbonato de sódio a 1% e plasmon a 14%. Ao final, feche a pele do pescoço com agulha e fio cirúrgico.

Em seguida, retorne o camundongo à posição prona. Agora, faça uma incisão desde o topo da coxa até o tendão de Aquiles. Separe a pele dos músculos subjacentes e tenha cuidado para não danificar os vasos sanguíneos.

Em seguida, identifique a borda anterior do bíceps femoral, que aparece como uma linha branca descendo pela coxa. Em seguida, abra cuidadosamente ao longo da linha, desde o joelho até o osso do quadril. Separe os músculos para expor o nervo isquiático sob o bíceps femoral.

Disseque cuidadosamente o bíceps femoral e remova-o. Para expor o nervo ciático e os músculos tríceps sural, identifique o nervo tibial entre os nervos peroneal comum e sural. Entre os diferentes ramos do nervo tibial, identifique os ramos que inervam o tríceps sural em comparação com aqueles que seguem mais profundamente.

Usando oito fios de seda OTT, amarre todos os ramos do nervo tibial juntos, mantendo intactos os ramos que inervam o tríceps sural. Corte o nervo tibial o mais distante possível do nó. Identifique as vértebras T13 e L1, sendo que T13 é a última vértebra à qual estão presas as costelas.

Em seguida, imobilize a coluna vertebral com as pinças vertebrais para medula espinhal de Cunningham em cada lado de T13 e L1. Tenha cuidado para não comprimir a medula espinhal, mas aplique uma leve tração ao longo do eixo longitudinal. Certifique-se de que a coluna vertebral esteja bem fixada pressionando-a suavemente para baixo com uma pinça.

Usando pinças finas, remova as apófises espinhosas e, em seguida, a lâmina sobre T13 e L1 para expor a medula espinhal. Em seguida, posicione um banho plástico personalizado ao redor da medula espinhal. Após isso, fixe o banho no lugar utilizando um fio de seda de número 4.

Por fim, certifique-se de que o banho seja à prova d'água, selando-o com selante de cura rápida. Após a secagem do selante de cura rápida, remova o algodão que cobre a medula espinhal e preencha o banho com óleo mineral. Utilize outro clamp vertebral para prender um processo espinhoso da região sacral.

Para sustentar a região dorsal do animal, utilize um terceiro grampo para imobilizar o membro hind direito e o tornozelo flexionado em um ângulo de 90 graus no joelho, com o membro dobrado em 90 graus no joelho e no tornozelo. Remova a gaze que cobre a área do membro hind. Disseque o tendão de Aquiles a partir do tecido circundante.

Corte o tríceps do tecido circundante o máximo possível usando uma agulha com fio. Passe um fio de seda 6-0 pelo tendão de Aquiles e faça um nó triplo ao redor do tendão. Em seguida, posicione o transdutor de força próximo ao nó.

Em seguida, prenda o tendão ao transdutor de força usando o fio de seda e corte a parte distal do tendão. Depois, insira dois fios de aço inoxidável sob a fáscia dos músculos tríceps sural. Esses fios estão conectados a um amplificador extracelular de corrente alternada.

Para a gravação de EMG, posicione o nervo sural do tríceps sobre o cátodo de um eletrodo em gancho, com o ânodo tocando um músculo próximo. Em seguida, estimule o nervo sural do tríceps usando um pulso quadrado de 50 microssegundos de intensidade crescente em baixa frequência até que a amplitude máxima do espasmo muscular seja observada. Em seguida, estimule o nervo sural do tríceps usando um pulso quadrado de 50 microssegundos de intensidade crescente em baixa frequência até que a amplitude máxima do espasmo muscular seja observada.

Essas figuras mostram como identificar um neurônio motor do grupo tríceps sural. Após a penetração com baixa intensidade de estimulação, apenas um PEPS monossináptico pode ser observado com intensidade mais elevada. O PEPS pode ser grande o suficiente para desencadear um potencial de ação ortodrômico com intensidade de estimulação ainda maior, de forma tudo-ou-nada.

O potencial de ação antidrômico aparece com uma latência mais curta do que o PEPS monossináptico. Se uma corrente suficiente for injetada através do microeletrodo para desencadear um potencial de ação, uma atividade EMG pode ser registrada no músculo após um breve atraso, seguida por uma contração muscular.

Após a identificação do neurônio motor, suas propriedades eletrofisiológicas podem ser caracterizadas. Por exemplo, esta figura ilustra como a resistência de entrada pode ser medida utilizando pulsos de corrente hiperpolarizantes e despolarizantes e traçando as variações do potencial da membrana em função da quantidade de corrente injetada. As propriedades contráteis da unidade motora também podem ser estudadas utilizando diversos protocolos de estimulação.

Por exemplo, a relação entre força e frequência pode ser obtida injetando pulsos curtos de corrente em várias frequências no neurônio motor. A força em estado estacionário pode então ser plotada em função da frequência dos pulsos de corrente para revelar uma curva sigmoidal de força versus frequência. Após dominar a cirurgia, parte desta técnica pode ser realizada em três horas, se executada perfeitamente.