Name: Transmissão de vírus de plantas Usando Whiteflies (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-08T08:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: Aprenda métodos para criar colônias de Bemisia tabaci em ambiente controlado e transmitir vírus de plantas com eficiência próxima a 100%. Este protocolo é essencial para pesquisas em virologia vegetal.

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1. Mosca branca manutenção da colônia <ol><li> Condições ambientais: colônias de mosca branca deve ser mantido em sala de crescimento controlado. Controlo de humidade relativa, a temperatura, fotoperíodo, e a intensidade da luz são essenciais para o crescimento óptimo de colónias (Figura 1). A temperatura de 28 ° C, 30-50% de umidade relativa e fotoperíodo de 14 h trará uma colônia que se desenvolve desde o ovo até a emergência dos adultos em 18 dias (este tempo varia de acordo com a planta hospedeira). Humidade relativa deve ser mantida abaixo de 70% para evitar o crescimento de insectos e fungos patogénicos de plantas. Doses de fertilizantes e rega deve ser reduzida para desencorajar fungos e acúmulo de sal. A intensidade da luz para a colónia deve ser bastante elevada. VHO lâmpadas fluorescentes usadas em número suficiente para gerar cerca de 800-1.000 velas pé na altura do dossel são adequados para a maioria das plantas (ou seja, de algodão., Feijão comum, feijão-fava, tomate). A limpeza é essencialuma colônia da mosca-branca para manter as condições ideais de criação. </li><li> Gaiolas Colony: Whiteflies deve ser mantida em plantas em gaiolas, em vez de grátis na sala de crescimento. As gaiolas podem ser construídas com diversos materiais, mas deve permitir: a ventilação, a facilidade de acesso, a capacidade para impedir a fuga ou mosca branca da infiltração, e de tamanho suficiente para manter as plantas suficientes para gerar a população de mosca branca for necessário. Bons resultados têm sido obtidos com organza mais rastreio de alumínio (para a força), bem como à prova de rastreio mosca branca (ver tabela de equipamento e material específico). </li><li> Colônia Planta Preparação: As espécies de plantas selecionadas é uma consideração importante quando se inicia uma colônia mosca branca. A planta deve ser capaz de suportar uma população de alto inseto sem entrar em colapso. A fábrica escolhida para uma colónia nonviruliferous deve ser um não hospedeiras do vírus ou vírus que se destinam a ser transmitidas para evitar a contaminação da colónia e se manter um virulicolónia ferous, deve ser hospedeiro do vírus. As plantas devem crescer rapidamente para apoiar a emergência de novos adultos dentro de 18 dias após terem sido introduzidos na colônia, mas não tão rapidamente como para superar as gaiolas dentro de quatro semanas. Anão, arbusto, ou do tipo pátio cultivares vegetais são recomendados, pois muitas vezes produzir uma área foliar semelhante a cultivares mais altos, mas sem o alongamento do colmo. </li><li> É muito importante para as plantas traseiras para a colônia em estufas em gaiolas que excluem mosca branca e outros insetos. Uso de plantas que estão infestados com moscas brancas, tripes e ácaros antes de entrar na colônia pode causar a colônia em colapso. Plantas infestadas também têm o potencial de ser infectado com vírus por insetos que irá interferir com os estudos de transmissão de vírus. </li></ol> 2. Mosca branca Estabelecimento Colony <ol><li> Iniciar uma colônia pela primeira vez usando whiteflies limpas - mais livre de vírus de plantas, outros insetos e patógenos de insetos. Estes podem ser obtidosde colaboradores ou no campo. Se o campo coletados, whiteflies devem ser criados durante pelo menos 8 semanas em plantas não hospedeiras do vírus da planta, e verificar se há ausência de sintomas de plantas para ter certeza de que eles estão livres de vírus de plantas. </li><li> Semana 1: Introduzir a mosca branca limpa para o primeiro compartimento de plantas. Moscas brancas pode ser introduzido por aspiração de números conhecidos ou agitando a mosca branca de outra planta fonte, dependendo das exigências para a colónia. Durante uma semana, moscas-brancas, que são ovos no lado inferior da superfície das folhas da planta. Um tamanho aproximado da população pode ser previsto para cada emergência com base no número de adultos utilizados para colocar ovos eo número médio de ovos postos pela mosca fêmea na planta hospedeira em questão. </li><li> Semana 2: Comece outra gaiola, introduzindo whiteflies a novas plantas hospedeiras para botar ovos. As plantas na gaiola iniciados na semana 1 terá ovos, imaturos e alguns whiteflies cobrindo a parte inferior das folhas (Figura 2). Algunswhiteflies adultos introduzidos durante uma semana ainda estarão vivos. </li><li> Semana 3: Comece uma terceira gaiola, introduzindo whiteflies às novas instalações para botar ovos. As plantas na gaiola iniciado na semana 1 terá imaturos, bem como muitas novas moscas brancas adultas emergentes e deve haver um aumento bastante perceptível na população adulta mosca branca. As plantas na gaiola iniciados na semana 2 terá muitos ovos e moscas brancas imaturas que cobrem a parte inferior das folhas. </li><li> Semana 4: Comece quarto gaiola, introduzindo whiteflies às novas instalações para botar ovos. As plantas na gaiola iniciados na semana 1 terá muitas moscas brancas adultas, que são aproximadamente, uma semana pós-emergência. As plantas na gaiola iniciados na semana 2 terá muitas novas moscas brancas adultas emergentes e deve haver um aumento bastante perceptível na população de mosca-branca. As plantas na gaiola iniciados durante a semana de 3 terá muitos ovos e moscas brancas imaturas que cobrem a parte inferior das folhas. </li><li> Weekly após o primeiro 4 weeKS: A cada semana, começar uma nova gaiola, introduzindo os whiteflies adultos a partir do quarto gaiola mais antiga (a gaiola começou na 1 ª semana) para novas usinas em uma nova gaiola, limpo. A velha gaiola deve ser removida e suas plantas descartadas. Estas moscas brancas são de cerca de 1 semana de pós-emergência. No caso da colónia viróticas, estas moscas brancas vai transmitir o vírus para as plantas novas, assim como põem ovos para a próxima geração de moscas-brancas. </li><li> Experimentos de transmissão planeja usar o whiteflies que surgirão na gaiola da terceira semana. Se forem necessários mais moscas-brancas, números de plantas pode ser aumentada e mais moscas brancas podem ser adicionadas para a gaiola 1 semana para aumentar a população de mosca branca. </li></ol> 3. Método para inoculação de plantas de teste <ol><li> Para garantir altas taxas de transmissão: 1) Whiteflies devem ser tratados o mais suavemente possível, para evitar danos ao inseto que irá reduzir as taxas de transmissão, 2) Deve haver área foliar adequada disponível para whiteflies a EITela sonda ou feed. Um aumento no tempo de aquisição ou um aumento do número de plantas hospedeiras de aquisição pode aumentar taxas baixas de infecciosidade em plantas de ensaio, devido à aglomeração quer na aquisição ou o período de acesso à inoculação. </li><li> Coleção de Whiteflies. Segue-se um procedimento para a coleta e movimentação de números precisos de whiteflies necessários para fins experimentais. Para movimentar um grande número de moscas-brancas, como é necessário para o rastreio de resistência, por exemplo, só é necessário agitar suavemente as plantas infestadas de mosca branca sobre as plantas de ensaio ou os hospedeiros de aquisição infectadas por vírus (e mais tarde as plantas em ensaio). Certifique-se de agitar as plantas ao longo de muitos locais para minimizar os efeitos de agregação. </li><li> Recentemente surgiu whiteflies adultos (1-3 dias após a emergência) são altamente ativo e alimentar muitas vezes por isso tendem a dar as mais altas taxas de transmissão de 4. Whiteflies mais velhos continuam a transmitir, mas com uma frequência menor. Vários whiteflies por planta teste (15-40 por plant) deve ser usado para elevadas taxas de transmissão, desde uma relação de uma infestação por planta muitas vezes resulta em baixas taxas de transmissão de 3,4 inaceitavelmente. O número necessário dependerá do vírus e as espécies de aquisição e plantas de teste. </li><li> Montar dispositivos de aspiração e frascos de coleta. (Figura 3) </li><li> Com uma mão, segure um cartão amarelo de plástico dentro da gaiola de colônia que contém os whiteflies a ser coletado. Bata levemente as plantas para incentivar os whiteflies adultos a voar. Whiteflies serão atraídos para o cartão amarelo e vai voar a partir da planta para o cartão onde podem ser coletados por meio de um aspirador e um sopro muito suave. Nunca aspirar whiteflies que se alimentam de plantas. Os estiletes estão embutidos na planta, enquanto a alimentação para puxá-los fora das plantas vai quebrar seus estiletes e tornando-os incapazes, quer adquirir ou transmitir o vírus (Figura 4). </li><li> Coletar cerca de 20 whiteflies adultos em um único colleç ã o frasco para minimizar os danos físicos aos insectos a partir de aspirações repetidas (Figura 5). </li><li> Para alterar o frasco de coleta, bata suavemente o frasco sobre uma superfície dura e tampa com Parafilm enquanto as moscas brancas estão desorientados com a batida. </li><li> Coloque uma nova coleta em frasco aspirador e repetir até que o número de moscas brancas necessários são coletados. Moscas brancas podem permanecer nos frascos de recolha, à temperatura ambiente durante várias horas. </li><li> Aquisição. Whiteflies são colocados sobre uma planta infectada de vírus e permitida a alimentação nas plantas infectadas durante 48-72 horas. Períodos de aquisição de mais de 72 horas, geralmente, não aumentar as taxas de transmissão. Para os vírus transmitidos de uma forma não persistente ou semipersistent, 1 hora e várias horas, respectivamente, são suficientes períodos de acesso de aquisição (Tabela 1). Os melhores resultados são obtidos quando whiteflies têm acesso livre às plantas em gaiolas que confinam os insetos para uma única planta ouvárias plantas. No entanto, algumas experiências requerem aquisição de folhas específicos em que as gaiolas grampo caso podem ser utilizados. Quando usando gaiolas grampo é importante para acomodar as preferências de alimentação mosca branca para a parte inferior das folhas. Além disso, a aglomeração de moscas brancas em gaiolas clipe pode reduzir as taxas de transmissão - as taxas aceitáveis ​​de transmissão foram obtidos por meio de 10 whiteflies femininos por clip gaiola de 2,5 cm de diâmetro. </li><li> Inoculação. Prepara-se uma gaiola apropriada para o tamanho da inoculação e colocar as plantas de teste no interior. Se apenas uma planta deve ser inoculado considerar uma única gaiola planta. Se mais de uma planta deve ser inoculado considerar um pequeno quadro / organza saco gaiola PVC ou uma gaiola de alumínio (Figura 6). O tamanho da gaiola utilizada para inoculação deve ser ligeiramente maior do tamanho da planta (s) a ser inoculado. Maiores taxas de transmissão são obtidos quando whiteflies são mantidos perto da copa da planta e não ter dado um monte de espaço livre. </li><li> Recolha de moscas-brancas a partir de hospedeiros de aquisição depende as necessidades da experiência. Se forem necessárias pequenas quantidades, aspirar a mosca branca, como descrito acima. Colocar os frascos de recolha de moscas-brancas no interior da gaiola próxima das plantas e remover a tampa (Figura 7). Abra o frasco e liberar as moscas brancas ou inverter e bater levemente o frasco para libertar as moscas brancas. Se for necessário um grande número simplesmente mover as plantas de aquisição de mosca branca nas gaiolas onde as plantas de teste estão localizados e agitar suavemente as moscas brancas fora da planta hospedeira aquisição. Para ambos os tipos de apresentação, certifique-se de distribuir os whiteflies através das plantas para minimizar a agregação e garantir uma inoculação uniforme. </li><li> Permitir que as moscas-brancas para sondar ou alimentar para a quantidade de tempo adequado, novamente dependente do vírus e, em certa medida, a planta hospedeira (Tabela 1). </li><li> Verifique as whiteflies pelo menos uma vez durante o período de acesso à inoculação para assegurar que são moscas brancassondagem ou alimentação através da abertura da gaiola e virar algumas folhas em cada planta. </li><li> Para os períodos de acesso à inoculação mais, perturbar as plantas delicadamente (usando uma vara de bambu ou equivalente) para escovar os topos das plantas e incentivar os whiteflies redistribuir nas plantas. Redistribuição de whiteflies ajuda a garantir uma taxa de transmissão mais elevada por contrariar a tendência natural da mosca branca para agregar. </li><li> Rescisão. O período de acesso à inoculação terminou por matar as moscas brancas com produtos químicos aprovados. Aplicar duas inseticidas um após o outro: um inseticida de contato para encerrar rapidamente whiteflies de adultos e um inseticida sistêmico de rescindir quaisquer whiteflies que se desenvolvem nas semanas seguintes e os perdeu pelo inseticida de contato (Figura 8). Um inseticida de contato como sabão inseticida e inseticidas sistêmicos, como imidacloprid ou pimetrozine têm sido utilizados, com sucesso. </li></ol>

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Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos aqui descritos foram desenvolvidos ao longo de um período de duas décadas e são baseadas na informação básica é fornecida por diversos estudos de transmissão de mosca branca, o comportamento ea biologia. Uma vez que existem muitas publicações, este manuscrito refere-se principalmente a revisões e algumas publicações específicas selecionadas para ilustrar o tipo de dados usados ​​para desenvolver esta técnica. É muito importante neste processo que as moscas-brancas são manuseados com cuidado uma vez que quebra das pernas e antenas pode levar a comportamentos anormais e menores taxas de transmissão. Arrecadação com aspiradores e outros dispositivos de sucção mecânica nunca produziu bons resultados. Outra consideração para o sucesso é que o número de moscas-brancas utilizadas para a obtenção de 100% de transmissão para as plantas de teste, tem de ser determinado para cada combinação de hospedeiro e vírus de plantas. Esta proporção ideal só precisa ser estabelecida uma vez. Os melhores resultados foram obtidos utilizando a mosca branca adultos jovens (1-3 dias após a emergência), uma vez que ótive as maiores taxas de transmissão. Os adultos mais velhos podem ser usados, mas um maior número de moscas brancas serão necessários para compensar as suas taxas reduzidas de transmissão. As fêmeas são conhecidos por transmitir a taxas mais elevadas do que os homens, já que eles se alimentam mais vezes do que os machos. No entanto, geralmente não vale a pena o tempo para separar os sexos para a transmissão. Este procedimento pode ser modificada de diversas maneiras de acordo com os recursos e as necessidades do pesquisador. Quando se trabalha com vários vírus, é melhor manter uma única colônia de whiteflies criados em plantas não hospedeiras do vírus. Estas moscas brancas podem ser recolhidos colocados em plantas infectadas por virus para a aquisição e, em seguida, após a aquisição das moscas brancas pode ser movido de novo para as plantas de teste. As plantas para a colónia devem ser cultivados em estufas em jaulas para impedir a introdução de moscas-brancas, que podem infectar os com um outro vírus. Infestação destas plantas com ácaros, tripes e outras pragas de plantas pode comprometer a haúde da colônia e fazer com que ele entre em colapso. Finalmente rega das plantas colônia tem que ser feito com cuidado. Estas plantas estão sujeitas a stress extremo pela alimentação de tantas moscas brancas e as mais baixas do que as condições normais de luz. Raiz podre fungos que são introduzidos na turfa nas misturas sem solo pode se tornar um problema se as plantas são overwatered sequer uma vez. O pré-tratamento das plantas com um fungicida encharcar pode eliminar alguns dos problemas. Enquanto a transmissão mosca branca de vírus de plantas pode ser demorado e requerer recursos valiosos (tais como salas de crescimento) é essencial para a transmissão de alguns vírus para o qual não temos outro meio de transmissão. É também um meio valioso para plantas de rastreio de resistência a vírus, uma vez que utiliza o mesmo tipo de transmissão do que as plantas no campo será esperado para resistir. A utilização de meios mais artificiais de transmissão nem sempre produzir os melhores resultados nas avaliações de germoplasma para virus-resistência.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nome do Item&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Empresa&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Número do Catálogo&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comentários (opcional)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Tela de proteção contra mosca-branca</td><td>Klayman Meteor Ltd. Petah Tikva 49130, Israel</td><td>---</td><td>Tela BioNet 50, tela antivírus contra insetos</td></tr><tr><td>Tela de proteção contra mosca-branca</td><td>Hummert International (www.hummert.com)</td><td>27-4050-1 - 27-4062-1</td><td>Tela BioNet 50, tela antivírus contra insetos</td></tr><tr><td>Dispositivos de coleta de mosca-branca</td><td>BioQuip</td><td>1135A</td><td>Também podem ser fabricados usando conta-gotas, tubos plásticos flexíveis, adaptadores plásticos para vácuo e pano de musselina</td></tr><tr><td>Frasco de coleta</td><td>BioQuip</td><td>8909</td><td>Os frascos utilizados dependem do aspirador empregado.</td></tr><tr><td>Cartões plásticos amarelos</td><td>qualquer empresa</td><td>---</td><td>Qualquer cartão plástico amarelo brilhante funcionará, podendo ser adquirido em diversos locais.</td></tr><tr><td>Gaiolas para mosca-branca</td><td>---</td><td>---</td><td>Estes não estão disponíveis comercialmente e devem ser construídos. Gaiolas de 60 cm x 60 cm x 60 cm funcionam bem para nós. Preferimos as construídas com tela de alumínio para janelas, organdi de náilon, plástico vinílico, com estrutura feita com molduras de alumínio para janelas. As portas são fixadas com dobradiças de piano e vedadas com selante para proteção contra intempéries; os topos das gaiolas são de plástico vinílico. As gaiolas também podem ser feitas de 1) acrílico colado nas bordas, com ventilação fornecida por aberturas teladas cortadas nas laterais; 2) sacos grandes de organdi de náilon, organza ou tela de 50 malhas para mosca-branca, com suportes internos providos por tubos e conexões de PVC cortados nos comprimentos desejados e montados dentro dos sacos; 3) estruturas de madeira com organdi de náilon, organza ou tela de 50 malhas para mosca-branca.</td></tr></tbody></table>

transmissão de vírus de plantas usando whiteflies

Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies

Whiteflies, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, um complexo de espécies morfologicamente indistinquishable 5, são vetores de muitos vírus de plantas. Vários gêneros destes vírus de plantas mosca-transmissíveis (Begomovirus, Carlavirus, Crinivirus, Ipomovirus, Torradovirus) incluem várias centenas de espécies de patógenos emergentes e economicamente significativas de importantes culturas alimentares e de fibra (revisado por 9,10,16). Estes vírus não se replicam no seu vector, mas, no entanto, são facilmente movido de planta para planta por mosca adulta por diversos meios (revisto por 2,6,7,9,10,11,17). Para a maioria desses vírus alimentação mosca branca é necessária para a aquisição e inoculação, enquanto que para outros é necessário apenas sondagem. Muitos desses vírus são incapazes ou não pode ser facilmente transmitida por outros meios. Portanto, a manutenção de culturas de vírus biológicos e caracterização molecular (identificação de gama de hospedeiros e sintomas) 3,13, Ecologia 2,12, exigem que os vírus ser transmitidos para hospedeiros experimentais utilizando o vector mosca branca. Além disso, o desenvolvimento de novas abordagens para a gestão, tais como a avaliação de novos produtos químicos ou compostos 14 15, novas abordagens culturais 1,4,19, ou a selecção e o desenvolvimento de cultivares resistentes 7,8,18, requer o uso de moscas-brancas para transmissão do vírus. O uso de transmissão de vírus de plantas mosca branca para a seleção e desenvolvimento de cultivares resistentes em programas de melhoramento é particularmente difícil 7. Selecção e rastreio eficaz para a resistência emprega um grande número de plantas e há uma necessidade de 100% das plantas a serem inoculadas, a fim de encontrar os genótipos que alguns possuem genes de resistência. Estes estudos utilizam um grande número de moscas brancas virulíferos, muitas vezes, várias vezes por ano. Manutenção mosca branca descrita aqui pode gerar centenas ou milharesadultos de mosca branca em plantas de cada semana, durante todo o ano, sem a contaminação de outros vírus de plantas. Plantas livres de ambas as moscas brancas e vírus devem ser produzidos para introduzir na colônia mosca branca a cada semana. Mosca branca culturas devem ser mantidas livres de patógenos mosca-branca, parasitas e parasitóides que podem reduzir as populações de mosca-branca e / ou reduzir a eficiência de transmissão do vírus. As colónias produzidas do modo descrito pode ser dimensionada para rapidamente aumentar ou diminuir o número da população, conforme necessário, e pode ser ajustado para acomodar as preferências alimentares da mosca branca com base na planta hospedeira do vírus. Existem dois tipos básicos de colônias de mosca branca que podem ser mantidas: uma nonviruliferous e uma colônia mosca virulíferos. A colónia nonviruliferous é composto de moscas-brancas mantidas em plantas sem vírus e permite a disponibilidade semanal de moscas-brancas, que podem ser usados ​​para transmitir os vírus a partir de culturas diferentes. A colônia mosca virulíferos,composto de moscas-brancas mantidas em plantas infectadas por vírus, permite a disponibilidade semanal de moscas-brancas que tenham adquirido o vírus omitindo, assim, um passo no processo de transmissão de vírus.

Estes métodos para a criação de mosca-branca das colónias e manutenção, bem como manipulação para transmitir vírus de plantas têm sido utilizados com sucesso em vários estudos 4,11,12,14, bem como muitas outras que não citados. Usando estes métodos com os vírus persistentemente transmitidos, temos obtidos rotineiramente as taxas desejadas de transmissão de 100% para a selecção para a resistência, o rastreio insecticidas à sua capacidade para interferir com a transmissão (e avaliação de compostos indutores de resistência) 13,14,17,18 ( Figura 9). Os procedimentos descritos aqui podem e têm sido ser adaptado a muitos locais em instalações públicas e privadas de pesquisa. <table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de Transmissão </td><td> Aquisição Período de Acesso (hora) </td><td> Inoculação Período de Acesso (hora) </td><td> Ref. </td></tr><tr><td> Nonpersistent </td><td> 1 </td&gt; <td> 2-24 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Semipersistent </td><td> 6-24 </td><td> 8-24 </td><td> 10, 16 </td></tr><tr><td> Persistente </td><td> 48-72 </td><td> 48-72 </td><td> 3, 6, 8, 9 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Vezes estimados que podem ser usados ​​para produzir elevadas taxas de transmissão de vírus, com diferentes tipos de relações com as suas espécies vector Bemisia tabaci complexos. Vezes estimados baseiam publicados tempos mínimos necessários para a transmissão de 80-100% e, em alguns casos modificado para explicar os períodos latentes e as diferenças entre as populações de mosca-branca, vírus e plantas hospedeiras. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig1.jpg" /> Figura 1. Um exemplo de uma colônia mosca virulíferos. Esta sala de crescimento contém gaiolas de plantas infectadas com a begomovírus e inferioridadested com virulíferos whiteflies. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig2.jpg" /> Figura 2. Esquerda: estágios imaturos da mosca branca, Bemisia tabaci MEAM clade sensu De Barro 6 de aproximadamente 1 semana pós-emergência e Direito: um adulto da mosca-branca, um vetor eficaz de muitos vírus de plantas. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig3.jpg" /> Figura 3. Os tipos de dispositivos de recolha, que pode ser usado para recolher a mosca branca para a transmissão de vírus de plantas. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig4.jpg" /> Figura 4. Esquerda: cartão de plástico amarelo usado para coletar adultos de mosca-branca mostrando whiteflies pronto para a coleta<html> . Direita: Coleta whiteflies de um cartão de plástico amarelo. Moscas brancas pode ser visto no cartão, como pequenos pontos brancos / cinza. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig5.jpg" /> Figura 5. Whiteflies colhidas através de punção (20 em um frasco) da colônia pronto para qualquer aquisição ou inoculação. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig6.jpg" /> Figura 6. Superior Esquerdo:. Gaiolas única usina utilizados tanto para aquisição ou inoculação superior direito: gaiolas maiores feitos de tubos de pvc e organza. Inferior: alumínio / tela e organdi gaiolas em uma estufa com plantas destinadas à colônia mosca branca. 32fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Whiteflies ser transferido para uma única usina para a inoculação (ou aquisição). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig8.jpg" /> Figura 8. A adição de um inseticida sistêmico encharcar de encerrar o período de acesso à inoculação da mosca-branca. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4332/4332fig9.jpg" /> Figura 9. Plantas de campo sob avaliação para resistência ao Tomato yellow leaf curl virus. Todas as plantas foram inoculadas em 5 semanas de idade mudas e depois transplantadas para o campo para avaliação. Plantas em primeiro plano são uma linha de germoplasma resistente, plantas no fundo são a linha de germoplasma suscetíveis.

Melhorar a nossa compreensão e nossa capacidade de gerir muitos dos vírus de plantas a insetos transmitidas requer o uso do vetor. Insecto de transmissão de vírus de plantas é uma interacção tritrófica, e como tal requer a manipulação de insetos, vírus e vegetais. Vectores deve ser criado em grandes números e manipulado de tal forma que para assegurar altas taxas de transmissão para as plantas de teste. As noções básicas de criação e manipulação de mosca-branca,<em&gt; Bemisa tabaci</em&gt; (<em&gt; Hemiptera: Aleyrodidae</em&gt;), Um vector de vírus de plantas pertencentes a diversos géneros emergente vírus de plantas, o que representa um grande número de vírus economicamente importantes é apresentado.

Transmissão de vírus de plantas Usando Whiteflies

Moscas-brancas, Hemiptera: Aleyrodidae, Bemisia tabaci, um complexo de espécies morfologicamente indistinguíveis5, são vetores de muitos vírus de plantas. Diversos...

O objetivo geral do experimento a seguir é transmitir vírus de plantas utilizando moscas-brancas. Isso é conseguido estabelecendo e mantendo uma colônia de moscas-brancas que fornece semanalmente moscas-brancas adultas recém-emergidas, não contaminadas com outros vetores ou patógenos potenciais. As colônias são mantidas adicionando-se regularmente moscas-brancas a plantas jovens livres de insetos, a partir das quais novos adultos são produzidos.Após 17 a 20 dias, a cada semana, os adultos recém-emergidos podem ser transferidos para plantas-teste para adquirir ou transmitir o vírus. Eficiências de quase 100% são tipicamente obtidas, e as taxas de transmissão geralmente começarão baixas e aumentarão com a otimização sistemática. O aspecto mais desafiador do uso de moscas-brancas para inoculação de vírus é a criação das moscas-brancas de maneira a excluir patógenos e insetos indesejados.Patógenos, especialmente fungos causadores de apodrecimento radicular e manchas foliares, reduzirão a qualidade das plantas hospedeiras do vírus. Insetos indesejados, como tripes, podem suprimir a reprodução de mosca-branca, além de comprometer a qualidade da planta hospedeira do vírus. As demonstrações dos procedimentos serão realizadas por Heather Capa Bianco, técnica do meu laboratório.As colônias de mosca-branca devem ser mantidas em um ambiente de crescimento limpo e controlado. O controle da umidade relativa, temperatura, período fotoperiódico e intensidade luminosa são essenciais para uma colônia que se desenvolve do ovo ao adulto em 18 dias; utilize as seguintes configurações. A temperatura deve ser ajustada entre 26 e 30 graus Celsius, e a umidade relativa deve idealmente situar-se entre 30 e 50%. Se a umidade relativa ultrapassar 70%, é provável que patógenos fúngicos de insetos e plantas se tornem um problema.O fotoperíodo ideal é de 14 horas. A intensidade luminosa deve ser bastante alta, e lâmpadas fluorescentes VHO podem produzir de 800 a 1000 foot candles na copa da planta. As taxas de fertilizante e a irrigação também devem ser reduzidas para inibir patógenos fúngicos, bem como o acúmulo de sais. As gaiolas para mosca-branca devem permitir ventilação, fácil acesso e espaço suficiente para uma população crescente de mosca-branca.Obtiveram-se bons resultados com organza orgânica mais tela de alumínio, bem como tela branca. A identificação da espécie da planta é uma consideração importante. Em primeiro lugar, ela deve ter crescimento rápido, mas sem exceder o crescimento na câmara. Em segundo lugar, a planta deve ser suficientemente resistente para suportar uma alta população de insetos sem desabar.Por essas razões, cultivares anãs ou arbustivas são boas opções de plantas. Em terceiro lugar, a planta deve ser capaz, ou não, de hospedar o vírus utilizado, dependendo do tipo de colônia que está sendo criada. Como a colônia pode colapsar devido a ácaros, THPs, moscas-brancas silvestres ou outros insetos invasores, os cultivares escolhidos devem ser cultivados em um ambiente protegido para excluir outros insetos.As primeiras moscas-brancas de uma nova colônia devem estar livres de vírus de plantas, outros insetos e patógenos de insetos. Se as moscas-brancas forem coletadas no campo, criá-las por pelo menos oito semanas em plantas que não sejam hospedeiras do vírus durante esse período, verificando a ausência de sintomas nas plantas. Uma vez obtidas moscas-brancas livres de contaminação, introduza entre 20 e 100 indivíduos em uma gaiola com plantas por aspiração ou sacudindo-as suavemente de outra planta-fonte.Semanalmente, é necessário montar uma nova gaiola. Nas primeiras três semanas, utilize moscas-brancas provenientes de plantas não-ST para montar a nova gaiola. A partir da quarta semana, utilize moscas-brancas adultas jovens da gaiola com três semanas de idade para montar a próxima gaiola.Durante a primeira semana em uma gaiola, os mosquitos-brancos depositarão ovos na face inferior das superfícies foliares das plantas. Na segunda semana, as formas imaturas dos mosquitos-brancos se tornarão aparentes e alguns dos adultos ainda estarão vivos. Na terceira semana, muitos novos mosquitos-brancos adultos terão emergido, e deverá haver um aumento muito evidente na população de mosquitos-brancos adultos.Essas moscas-brancas podem ser utilizadas em experimentos de transmissão. Na quarta semana, os adultos com uma semana de idade devem ser transferidos para uma nova gaiola. A gaiola antiga deve ser removida e suas plantas descartadas. Preciso.A transferência suave de moscas-brancas é realizada com um dispositivo de aspiração e frascos de coleta, nunca por aspiração direta. As moscas-brancas que estão se alimentando de plantas têm seus estiletes inseridos na planta e esses se romperão se forem puxadas para longe da planta, tornando a mosca-branca inutilizável. Para coletar moscas-brancas, segure um frasco de coleta com uma das mãos e, com a outra mão, posicione um protetor plástico amarelo dentro da gaiola da colônia.Toque suavemente nas plantas para estimular as moscas-brancas adultas a voar. As moscas-brancas serão atraídas para o cartão amarelo, onde podem ser coletadas. Usando o aspirador e uma sucção muito suave, adicione não mais de 20 moscas-brancas a cada frasco de coleta.Em seguida, toque levemente no frasco para desorientar as moscas e tampe-o com parafina. Para garantir uma transmissão viral bem-sucedida, utilize de 15 a 40 adultos jovens provenientes de plantas infectadas pelo vírus e transfira-os para plantas saudáveis, dependendo do vírus e da planta hospedeira. Outros protocolos, como o de triagem de resistência, exigem populações iniciais maiores.Neste caso, agite as plantas infectadas com o vírus, que estão infestadas com moscas-brancas, sobre as plantas que precisam ser inoculadas. Uma vez que as moscas-brancas são colocadas em uma planta infectada pelo vírus, permita que se alimentem por 48 a 72 horas para adquirir vírus transmitidos de forma persistente. Um tempo maior geralmente não aumenta a taxa de transmissão para vírus transmitidos de maneira não persistente ou persistentemente semiperfeita.Um período de acesso de aquisição mais curto, de uma hora a um dia, é suficiente para experimentos que exigem aquisição de folhas específicas. Pode-se usar gaiolas de prendedor; monte a gaiola de modo que a face inferior da folha fique acessível, e não utilize mais de 10 fêmeas de mosca-branca por gaiola de 2,5 centímetros de diâmetro, pois a taxa de transmissão diminuirá devido ao excesso de indivíduos. Para a inoculação das plantas, selecione a gaiola apropriada considerando o número de plantas.Uma planta, por exemplo, precisa apenas de uma pequena gaiola, levemente maior que ela própria; para múltiplas plantas, escolha entre uma gaiola menor com tubos de PVC, uma gaiola com estrutura de quadro ou uma gaiola maior com estrutura de alumínio. Quanto menor o espaço ao redor da copa da planta, melhor. Assim que as moscas-brancas forem adicionadas à nova planta, o tempo necessário para a inoculação depende do vírus e da planta hospedeira.Assim como na aquisição, o tempo necessário para a transmissão depende do modo de transmissão. A transmissão não persistente exige um tempo de acesso muito menor do que a transmissão semipersistente ou persistente. Verifique se as moscas-brancas estão sondando ou se alimentando durante o período de acesso à inoculação.Abra a gaiola e examine a superfície inferior de algumas folhas em cada planta. Para os períodos mais longos de inoculação, perturbe periodicamente as plantas suavemente para estimular a redistribuição dos organismos nas plantas.Isso aumentará a taxa de transmissão ao contrariar a tendência natural de as moscas-brancas se agregarem ao final do período de inoculação. Elimine as moscas-brancas com dois inseticidas aplicados um após o outro. Primeiro, aplique um inseticida de contato para eliminar rapidamente as moscas-brancas adultas, como sabão inseticida.Em segundo lugar, aplique um inseticida sistêmico para eliminar quaisquer moscas-brancas que se desenvolvam nas semanas seguintes. Qualquer adulto remanescente, árido ou piretrina, são opções eficazes. Utilizando esses procedimentos, é possível obter rotineiramente taxas de transmissão viral de 100%. Taxas tão elevadas de transmissão são essenciais ao testar plantas quanto à resistência ao vírus e são desejáveis ao avaliar a eficácia de compostos químicos quanto à sua capacidade de interferir na transmissão viral.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como criar moscas-brancas e utilizá-las para transmitir vírus de plantas. Esses procedimentos podem ser usados para fins de pesquisa ou para o desenvolvimento comercial de plantas resistentes a vírus, ou ainda para testar compostos quanto à sua capacidade de interferir na transmissão do vírus.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pulgões são transmissores eficazes de vírus de plantas. Microinjeção pulgão do vírus, o procedimento que irá mostrar-lhe hoje, é uma técnica permitindo que os pesquisadores injetam vírus diretamente no hemocele do pulgão, contornando o intestino, uma das duas principais barreiras para a transmissão do vírus de uma maneira circulativo. A mesma técnica também é usada para injetar dsRNA para RNAi.

Testando a barreiras fisiológicas para a transmissão viral em Aphids Usando microinjeção

Descrevemos aqui um simples fluorescência de hibridação in situ (FISH), o método para a localização de vírus e bactérias, em tecidos de plantas e de insectos. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de mRNA em toda montagem e cortes microscópicos.

Fluorescência<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizações (FISH) para a localização de vírus e bactérias Endosymbiotic em Plant e Insect Tecidos

Aqui apresentamos um protocolo para propagar células Homalodisca vitripennis e HoCV-1 in vitro. Médio foi removido do HoCV-1 culturas positivas e RNA extraído a cada 24 horas para 168 horas. A capacidade de sobrevivência das células foi quantificada por coloração com azul de tripano. Partículas de vírus inteiros foram extraídos após a infecção. RNA extraído foi quantificada por qRT-PCR.

Propagação de<em&gt; 01-vírus Homalodisca coagulata</em&gt; Via<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; Cultura de Células

Aqui, apresentamos um protocolo para investigar a distribuição de tecido hospedeiro, o modo de transmissão, eo efeito sobre a aptidão anfitrião de um densovírus dentro de uma espécie de lepidópteros, a lagarta do algodão. Este protocolo pode também ser utilizado para estudar a interacção entre outros vírus oralmente transmitidos e os seus hospedeiros de insecto.

Protocolos para investigar a distribuição Host-tecido, de modo Transmissão e Efeito sobre a aptidão do host de um densovírus na lagarta do algodão

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar os endossimbionetas da mosca branca Bemisia tabaci através da dissecção e filtração. Após a amplificação, as amostras de DNA são adequadas para posterior seqüenciamento e estudo do mutualismo entre endosimbiontes e mosca branca.

Métodos para a extração de endossimbiontes da mosca branca<em&gt; Bemisia tabaci</em

Este trabalho relata o protocolo para um ensaio de identificação rápida por Bemisia tabaci baseado na tecnologia de amplificação isotérmica mediada por laço (lâmpada). O protocolo exige formação mínima do laboratório e pode, portanto, ser implementado no local nos pontos de entrada para as importações de vegetais como os portos e aeroportos.

Um ensaio de amplificação isotérmica (lâmpada) mediada por Loop para identificação rápida de Bemisia tabaci

Descrevemos um método de imunofluorescência e PCR quantitativo para localização e quantificação de begomovírus em tecidos de insetos. O protocolo de imunofluorescência pode ser usado para colocalizar proteínas virais e vetores. O protocolo quantitativo PCR pode ser estendido para quantificar vírus em corpos inteiros de moscas brancas e plantas infectadas por vírus.

Localização e Quantificação de Begomovírus em Tecidos Whitefly por Imunofluorescência e PCR Quantitativo

Um protocolo de injeção à base de agrobacterium (agroinjeção) é apresentado para a inoculação do vírus do mosaico de rabo-de-raposa e do vírus do mosaico de cana-de-açúcar em mudas de milho. A inoculação dessa forma leva à infecção viral, silenciamento genético induzido por vírus de genes marcadores e superexpressão viral de GFP.

Agroinoculação direta de Mudas de Milho por Injeção com Vírus mosaico de rabo-de-cavalo recombinante e clones infecciosos do vírus do mosaico de cana-de-açúcar

Este protocolo para marcação imunofluorescente de proteínas de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de insetos excisados pode ser usado para estudar interações entre vírus e insetos vetores, funções de proteínas de insetos e mecanismos moleculares subjacentes à transmissão de vírus.

Marcação por imunofluorescência de vírus de plantas e proteínas de insetos vetores em intestinos de Hemiptera

Este protocolo demonstra como utilizar o hospedeiro vegetal para detectar proteínas salivares de cigarrinhas e proteínas virais de plantas liberadas por vetores cigarrinhas.

Detecção de vírus e proteínas salivares de um vetor cigarrinha no hospedeiro vegetal

Descrevemos um método para coletar hemolinfa quantificável eficientemente de pequenos artrópodes para posterior análise.

Um Método Preciso e Quantificável para Coleta de Hemolinfa de Pequenos Artrópodes

Aprenda métodos para criar colônias de Bemisia tabaci em ambiente controlado e transmitir vírus de plantas com eficiência próxima a 100%. Este protocolo é essencial para pesquisas em virologia vegetal.

Transmissão de vírus de plantas Usando Whiteflies

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