Name: Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando formato de placa Multititre. Este método simplificado permite geração rápida e eficiente com controle da diferenciação celular.

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Este trabalho foi financiado pela Sociedade Max Planck.

1. Preparação de Matrigel revestidos Pratos e Mídia <ol><li> Preparação de Matrigel revestido Matrigel placas foi encontrado para ser um substrato preferido para a ligação de diferenciação EBs e também promove o crescimento eficiente dos neurónios a partir destes 10. <ol><li> Ml degelo 10 de Matrigel durante a noite em gelo. </li><li> No dia seguinte, diluir a Matrigel gelatinosa com dois volumes de gelado DMEM/F-12 e preparar alíquotas de 1 ml em 15 ml previamente arrefecido de tubos cónicos que podem ser armazenados congelados a -20 ° C. </li><li> Decidir sobre um formato de placa para a diferenciação neuronal. Por exemplo, como ponto de partida, recomendamos realizar uma rodada inicial de diferenciação em um formato de 12 poços. Pré-cool quatro placas de 12 poços a 4 ° C. Dissolver uma alíquota de Matrigel congelada através da adição de 9 ml de pré-resfriada DMEM/F-12 seguido por pipetagem para cima e para baixo até que todo o pré-diluído Matrigel foi descongelado e dissolvido. </li><li> Depois, Transferir o conteúdo para um tubo de 50 ml novo, contendo 15 ml de DMEM/F-12 em gelo (Matrigel diluição final: 1:75). Em seguida, adicionar 0,5 mL de Matrigel diluído a cada poço das pré-arrefecidos placas de 12 poços. Enrole placas com Parafilm e deixe descansar em temperatura ambiente durante a noite. </li><li> No dia seguinte, placas de transferir a 4 ° C. Placas revestidas podem ser armazenadas durante várias semanas antes de usar. </li></ol></li><li> Mídia </li></ol> EB meio de formação (~ 15 ml necessário para realizar a diferenciação de uma placa de 96 cavidades - ver Quadro 1 e esquema da Figura 2): DMEM/F-12 com 0,4% (PVA) 1x N2 1x B27 0,05% de BSA 20 ng / ml FGF2 10 uM Y-27632 1x PenStrepGln Meio de diferenciação (~ 30 ml necessário para realizar a diferenciação de uma placa de 96 poços, seguindo-se a formação de um neurónio Matrigel revestido placa de 12 poços, ver Quadro 1): DMEM/F-12 1x N2 <br/&gt; 1x B27 0,05% de BSA 0,5 uM PD0325901 15 SB431542 fiM 0,5 mM Dorsomorphin 1x PenStrepGln 2. Formação EB forçado <ol><li> HPSCs crescer sob seus preferidos alimentador sem condições. Usamos MEF meio condicionado em Matrigel revestidas placas de 6 poços 15. No entanto, sistemas de cultura, tais como caseiros ou comerciais de mídia definidos também deve funcionar. No momento de iniciar a experiência, diferenciação hPSCs deve ser sub-confluente e em crescimento activo. </li><li> Remover mecanicamente espontaneamente colônias diferenciadas com uma ponta de pipeta estéril de plástico sob um microscópio estéreo. </li><li> Lavar restantes colónias indiferenciadas utilizando PBS, e as células individuais de digest utilizando Accutase contendo 1X Y-27632. Células individuais pelotas por centrifugação a 200 xg durante 2 min, ressuspender em um pequeno volume de meio de formação de EB e determinar titre célula usando um hematocytometer. </li><li> Adicionar uma parte alíquota de células parao meio de formação restantes EB para resultar em um título entre 40.000 e 80.000 células por ml. </li><li> Utilizando uma pipeta de canais múltiplos, transferir 100 ul por poço de uma placa de fundo 96V, resultando em 4.000 a 8.000 células por poço. Placa de 96 poços de centrifugação numa centrífuga de placa swing-out a 400 xg durante 1 min para recolher as células no fundo dos poços, e transferir para a cultura de células de incubadora. EBs irá formar durante a noite, como mostrado na Figura 1. </li></ol> 3. Indução neuroectoderma <ol><li> No dia seguinte (dia 0), a partir de chapa de recolher EBs 96V sob um microscópio estéreo e transferência para um pequeno volume numa placa de 3,5 centímetros bacteriana contendo 2 ml de meio de diferenciação. Agite suavemente o prato por vários segundos para lavar a EBS. </li><li> Adicionam-se 100 ul de meio por poço a diferenciação de um ultra-low-fixação fundo em U de 96 poços da placa. Sob estereomicroscópio, transferência EBs em pequenos volumes a partir da lavagem do prato para o 96U-poços (um EB por nósll). Colocar a placa de cultura de células em 96U incubadora durante 4 dias, para permitir a formação de neuroectoderme. </li></ol> 4. Formação neurônio <ol><li> No dia 4, preparar um prato de lavagem como descrito no passo 3.1 e, adicionalmente, substitua DMEM/F-12 num pré-aquecido Matrigel revestido placa de 12 poços por meio de diferenciação (1 ml por poço). </li><li> Chapeamento de EBs <ol><li> Recolha de EBs placa 96U, lavar estas sementes como acima, e cuidadosamente uma por uma nos poços do Matrigel revestido placa de 12 poços (cerca de 8 EBs por poço): EBs deve ser igualmente distribuído dentro dos poços para permitir outgrowth imperturbada do neurônios ao longo dos próximos dias (ver &quot;dia 5&quot; imagem na Figura 2). </li><li> Antes da transferência da parte de trás da placa de 12 poços na incubadora, permitir EBs para anexar livremente por cerca de 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, transferir cuidadosamente placa de 12 poços para cultura de células de incubadora. Neurónios vai crescer para fora da EBs chapeado de um modo radial dentro dos 4 dias seguintes, tal como shown na Figura 2 (&quot;dia 8&quot; imagem à direita). </li></ol></li></ol> 5. Neurônio Formação como monocamadas <ol><li> Como uma alternativa para os passos do ponto 4), no dia 4 do procedimento, recolher EBs em um prato de 3,5 centímetros bacteriana contendo 2 ml de meio de diferenciação, em seguida, transferir EBs em um pequeno volume para um prato de PBS contendo, em seguida, em outro prato contendo Accutase. </li><li> Deixe digerir a células individuais, centrifugar a 200 xg durante 2 minutos, ressuspender em um pequeno volume de meio de diferenciação e determinar titre célula usando um hematocytometer. Ajustar a título de 1-2x10 6 células por ml em meio de cultura de diferenciação (sem Y-27632). </li><li> Células da placa para fora na pré-aquecido Matrigel revestido placa de 12 poços (1 mL por cavidade), e transferência para a incubadora de cultura de células. Formação Neuron como monocamadas foram observadas entre os dias 7-8 (Figura 3C). Deve notar-se, contudo, que esta variante de monocamadao processo não está completamente optimizada no que se refere à sobrevivência das células e substrato mais adequado. </li></ol>

<ol><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brustle, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rosette-type%2C+self-renewing+human+ES+cell-derived+neural+stem+cell+with+potential+for+in+vitro+instruction+and+synaptic+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+directed+differentiation+of+neural+crest+stem+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).</li>
<li>Pera, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+embryonic+stem+cell+differentiation+by+BMP-2+and+its+antagonist+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of human embryonic stem cell differentiation by BMP-2 and its antagonist noggin.</a> J. Cell Sci. 117, 1269-1280 (2004).</li>
<li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Activin%2FNodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Dev. Biol. 313, 107-117 (2008).</li>
<li>Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+early+fate+decisions+in+human+ES+cells+by+distinct+states+of+TGFbeta+pathway+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Control of early fate decisions in human ES cells by distinct states of TGFbeta pathway activity.</a> Stem Cells Dev. 17, 1065-1077 (2008).</li>
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<li>Anderson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Familial+dysautonomia+is+caused+by+mutations+of+the+IKAP+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Familial dysautonomia is caused by mutations of the IKAP gene.</a> Am. J. Hum. Genet. 68, 753-758 (2001).</li>
<li>Lee, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+pathogenesis+and+treatment+of+familial+dysautonomia+using+patient-specific+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs.</a> Nature. 461, 402-406 (2009).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+human+embryonic+stem+cell+embryoid+body+homogeneity+and+cardiomyocyte+differentiation+from+a+novel+V-96+plate+aggregation+system+highlights+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability.</a> Stem Cells. 25, 929-938 (2007).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6, e18293(2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A maioria dos protocolos de diferenciação que envolvem a formação de EB hPSCs, incluindo o nosso procedimento publicado anteriormente 10, baseiam-se manual ou enzima-assisted colheita de hESCs como agregados, o que conduz inevitavelmente a heterogeneidade nos tamanhos de EB. Este fato leva à variabilidade na eficiência de diferenciação com algumas linhas de células, tornando análises sistemáticas difícil, em particular, em uma escala rendimento médio. Além disso, o esvaziamento manual é de trabalho intensivo ...

hPSCs, compreendendo embrião derivado de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e as células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSCs), são pluripotentes sentido de que eles podem dar origem a linhagens de células diferentes in vitro 1-2. Vários tipos de células diferenciadas foram derivados de hESCs até à data, apoiar a noção de que essas células apresentam ferramentas valiosas para a pesquisa científica e as abordagens baseadas em células de triagem, e uma promessa para a célula-base terapêutica. Protocolos para a diferenciação neuronal hESCs são geralmente complexo e demorado uma vez que são muitas vezes baseados na primeira indução destino global neural, seguido por isolamento manual das células progenitoras neurais, e subsequente diferenciação terminal em um tipo de dado de interesse neurónio 3-6. Em alguns respeito, essa complexidade não é surpreendente e inevitável, dado que tal estado-da-arte protocolos de diferenciação direcionadas tendem a imitar gradual desenvolvimento humano precoce, which é em si extremamente complexo. Por outro lado, pode, em parte, também reflectem a falta de compreensão dos processos moleculares subjacentes, o que resulta em protocolos de diferenciação que ainda estão longe de ser totalmente otimizado. No que se refere à conversão de hPSCs indiferenciadas em neuroectoderme, Pera et al. descobriu que a supressão de BMP / SMAD1/5/8 sinalização aumenta a indução neural de hESCs 7. Além disso, a inactivação de Smad2 / 3 de sinalização tem sido mostrado para promover a formação de neuroectoderme 8. Por conseguinte, a inactivação combinado destas duas vias tende a levar a mais eficiente de indução neural hPSCs 4,9. Mais recentemente, têm demonstrado que a via de sinalização do terceiro, FGF / ERK, serve como um repressor forte dos primeiros passos de compromisso neuroectodérmica em hESCs. Inversamente, a repressão simultânea de todos estes três vias levam a quase homogénea conversão de hESCs em neuroectoderme comem apenas quatro dias 10. Posteriormente, a diferenciação terminal altamente eficiente em neurônios funcionais foi observado no prazo de oito dias. Os neurônios obtidos eram susceptíveis de ser neurónios sensoriais do sistema nervoso periférico, o que pode, em parte, explicar a sua derivação rápida 10. Defeitos na manutenção neurônio sensorial é considerada uma causa de certas doenças humanas, tais como disautonomia familiar 11. Para a modelagem de tais doenças baseadas em tecnologia hiPSC 12, para a caracterização funcional adicional, bem como para fins de aplicação não exigem qualquer tipo específico de neurónios, este processo de diferenciação podem apresentar uma base útil. No entanto, a estratégia de diferenciação que originalmente empregado envolvido formação de corpos embrionárias (EBS) de touceiras de colônias CTEh 10, e isso resultou em um bom grau de heterogeneidade em relação a tamanhos EB, e também apareceu para comprometer neurônio eficiência de formação em algumas celinhas ll. Por outro lado, devido à heterogeneidade nos tamanhos EB, a capacidade para testar sistematicamente os efeitos de factores de crescimento adicionais ou pequenas moléculas, durante e depois da formação de neurónios parecia ser um pouco confusa. Neste relatório, nós adaptamos o nosso procedimento anterior para um meio de rendimento compatível, forçado técnica de agregação baseado gerar EBs de uma forma altamente tamanho controlado, como também mostrado em outros contextos 13. Subsequentemente, o EBs gerada em forma de V poços de placas de 96 poços foram transferidas para fixação em forma de U de ultra-baixo de 96 poços, para iniciar a formação de neuroectoderme em suspensão. Quatro dias mais tarde, o EBs pode ser plaqueada para fora dando origem a neurónios terminalmente diferenciadas em alto rendimento e homogeneidade. Alternativamente, 4 dias de EBs foram dissociadas em células isoladas e plaqueadas como tal, o que resultou em baixa densidade monocamadas de neurônios humanos. Os resultados foram coerentes até agora obtida com os dois independentemente deRIVED linhas CTEh, HuES6 e NCl3. Como pré-requisito, a formação de EB sucesso era estritamente dependente da utilização de um polímero sintético, álcool polivinílico (PVA), em conjunto com o inibidor ROCHA Y-27632 conhecido para promover a sobrevivência hESC 13-14. Como resultado, a homogeneidade da EBs formado em 96-V-placas foi substancialmente melhorada em comparação com a formação de EBs como culturas em massa com base em técnicas de separação aleatórios. Este sistema proporciona assim uma plataforma significativamente melhorada para a formação de neuroectoderme em cultura em suspensão, seguindo-se a formação de neurónios em condições altamente controlado aderentes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Matrigel HC </td><td> Becton Dickinson </td><td> 354263 </td><td> Ver texto para detalhes sobre o tratamento </td></tr><tr><td> DMEM/F-12 </td><td> Life Technologies </td><td> 21331-020 </td><td></td></tr><tr><td> Poli (álcool vinílico) </td><td> Sigma </td><td> 363170 </td><td> Dissolver em 0,4% em DMEM/F-12 usando um banho de água de ultra-sons / evitar sobreaquecimento / pode ser mantida a 4 ° C durante várias semanas </td></tr><tr><td> Suplemento N2 </td><td> Life Technologies </td><td> 17502-048 </td><td> 100X, armazenar como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Life Technologies </td><td> 12587-010 </td><td> Loja, 50X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> Albumina de Soro Bovino </td><td> Sigma </td><td> A1595 </td><td> 10% = 500X, loja como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> L-Glutamina com Penicilina / Estreptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-013 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> FGF2 </td><td> Peprotech </td><td> 100-18B </td><td> Dissolver a 10 ug / ml em 0,1% BSA / PBS = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> ROCHA inibidor Y-27632 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-129 </td><td> Dissolver em 10 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> PBS </td><td> PAA </td><td> H15-002 </td><td> Ou equivalente </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> PAA </td><td> L11-007 </td><td></td></tr><tr><td> De 96 poços de fundo em V placas </td><td> Nunc </td><td> 277143 </td><td></td></tr><tr><td> PD0325901 </td><td> Axon medchem </td><td> Axon 1408 </td><td> Dissolver a 0,5 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> SB431542 </td><td> abcamBiochemicals </td><td> Asc-163 </td><td> dissolver em 15 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> Dorsomorphin </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-200689 </td><td> dissolver a 0,5 mM em DMSO = loja, 1000X como alíquotas congeladas </td></tr><tr><td> De 96 poços com fundo em U de ultra baixa placas de fixação </td><td> Corning </td><td> 7007 </td><td></td></tr><tr><td> beta-tubulina III anticorpo (mouse) </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td> usar em 1:1000 </td></tr><tr><td> beta-tubulina III anticorpo (coelho) </td><td> Covance </td><td> PRB-435P </td><td> usar em 1:2000 </td></tr><tr><td> BRN3A anticorpo (POU4F1) </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8429 </td><td> usar de 1:500 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela 1. &lt;/ Strong&gt; reagentes e equipamentos específicos. </td></tr></tbody></table>

geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa multititre

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Os protocolos existentes para a produção de neurónios de células pluripotentes humanas estaminais (hPSCs) são muitas vezes entediantes em que se trate de processos com vários passos, envolvendo o isolamento e expansão de células precursoras neurais, antes da diferenciação terminal. Em comparação com estas abordagens demorados, que têm encontrado recentemente que a inibição combinada de três vias de sinalização, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1 e FGF / ERK, promove a rápida indução de neuroectoderme de hPSCs, seguido de imediato de diferenciação em neurónios funcionais. Aqui, nós adaptamos o nosso procedimento para um formato de romance placa multititre, para aumentar ainda mais a sua reprodutibilidade e para torná-lo compatível com o meio-throughput de aplicativos. Ele compreende quatro dias de formação neuroectoderme em esferas flutuantes (corpos embrióides), seguido por mais quatro dias de diferenciação em neurónios em condições de aderência. A maioria das células obtidas com este protocolo parecem ser os neurônios sensoriais bipolares. Além disso,o processo é altamente eficiente, não requer conhecimentos especializados particulares, e baseia-se em um meio simples quimicamente definido, com boa relação custo-eficiência moléculas pequenas. Devido a estas características, o procedimento pode servir como uma plataforma útil para investigação funcional adicional, bem como para a célula baseada em triagem aproxima exigindo humanos neurónios sensoriais ou neurónios de qualquer tipo.

Em nosso relatório anterior, em linha com muitos outros, a partir de EBs hPSCs poderiam ser gerados pela simples repique agregados, com a divisão de rotina de hPSCs em fixação de baixa pratos 10. Isso geralmente resulta em uma ampla distribuição de tamanhos EB resultantes (Figura 1C, superior). Outro problema resultante da presente é a de que EBs mantidas em suspensão tendem a agregar uma com a outra, conduzindo a uma ainda maior heterogeneidade de tamanhos de EB. Para contornar esses problem...

Os protocolos para a diferenciação neuronal de células pluripotentes estaminais humanas (hPSCs) são muitas vezes demorado e requer habilidades substanciais cultura de células. Aqui, nós adaptamos um procedimento de diferenciação pequena molécula baseada em um formato de placa de multititre, permitindo a geração de simples, rápido e eficiente de neurônios humanos de uma maneira controlada.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

Os protocolos existentes para a geração de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são frequentemente tediosos, pois consistem em procedimentos de múltiplas etapas...

O objetivo geral do seguinte experimento é diferenciar células-tronco pluripotentes humanas ou H PSCs em neurônios utilizando um formato de placa de múltiplos poços. Isso é alcançado colhendo e semeando uma suspensão celular única de H PSCs em placas de fundo V de 96 poços para formar corpos embrioides ou EBS durante a noite.Em seguida, os EBS são transferidos para placas ultra-baixas em formato de U contendo meio de diferenciação para induzir a formação do neuroectoderma. Posteriormente, os EBS são semeados em placas revestidas com matrigel para promover a proliferação de neurônios. Os resultados podem ser obtidos por imunofluorescência, mostrando a presença de marcadores neurais típicos por volta do oitavo dia.Protocolos de coloração para diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em neurônios são frequentemente complicados e tediosos. De forma algo acidental, descobrimos um procedimento muito simples para produzir neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas.Do ponto de vista técnico, a principal vantagem dessa técnica em relação aos métodos existentes é que ela é fácil de realizar, rápida e economicamente eficiente. Ao mesmo tempo, o procedimento será aprese

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Biologia

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Aqui, mostramos um protocolo simples e eficaz para a geração de iPSCs humanos a partir de 3-4 ml de sangue periférico utilizando um vector lentiviral única reprogramação. Reprogramação de células do sangue prontamente disponíveis promete acelerar a utilização da tecnologia iPSC tornando-o acessível a uma comunidade mais ampla de pesquisa.

Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

O vídeo mostra um método para separar e replantar neurônios humanos pluripotentes derivados de células-tronco usando uma enzima proteolítica leve. Após filtração e centrifugação, os neurônios são recolocados em uma placa revestida de vários poços para incubação, promovendo a fixação e a maturação.

Replating de neurônios diferenciados derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Este vídeo demonstra o processo de diferenciação de corpos embrióides (EBs) em agregados neuroepiteliais e sua subsequente divisão em células neuronais e gliais. Este método permite a geração eficiente de células neuronais e gliais in vitro, que servem como sistemas de teste para testes de toxicidade, bem como avaliação de diferentes vias envolvidas na neurotoxicidade.

Geração de neurônios e células gliais a partir de corpos embrióides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Este vídeo descreve um método para preparar lamínulas de vidro revestidas com poliornitina e laminina para aumentar a adesão e o crescimento de células-tronco neurais. A técnica envolve incubações e lavagens sequenciais, facilitando a formação de uma matriz de suporte que promove o crescimento e a diferenciação das células neuronais, mimetizando estruturas encontradas nos neurônios.

Gerando neurônios piramidais corticais a partir de células-tronco neurais humanas

Aqui, apresentamos o nosso método estabelecido para reprogramar células somáticas humanas em iPSCs humanos sem transgene com o vírus Sendai, que mostra resultado consistente e maior eficiência.

Eficiente Geração induzida pelo homem células-tronco pluripotentes a partir de células somáticas humanas com Sendai-vírus

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Nós modificar e implementar um protocolo publicado anteriormente descrevendo a diferenciação rápida, reprodutível e eficiente dos humanos pluripotentes induzidas (células-tronco hiPSCs) em neurônios corticais excitatórios 12. Especificamente, nossa modificação permite o controle da densidade de células neuronais e uso em matrizes de micro-eléctrodos para medir as propriedades eletrofisiológicas no nível da rede.

Rápido Neuronal diferenciação de células estaminais pluripotentes induzidas para medir a atividade de rede na Arrays Micro-eletrodo

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para ressusciar e cultivar os neurônios derivados humanos da pilha de haste que foram diferenciados previamente dos progenitores neural in vitro por semanas múltiplas. O procedimento facilita os ensaios com base em imagens de neuritos, sinapses e marcadores neuronais de expressão tardia em um formato compatível com microscopia de luz e triagem de alto conteúdo.

Resposta pós-diferenciação de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas para triagem de alto conteúdo de Neuritogênese e maturação de sinapse

Mostramos a automação das culturas de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hiPSC) e diferenciações neuronais compatíveis com imagens e análises automatizadas.

Produção automatizada de neurônios cortical e dopaminérgico derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos com monitoramento integrado de células vivas

Aprenda a diferenciar células-tronco pluripotentes humanas em neurônios usando formato de placa Multititre. Este método simplificado permite geração rápida e eficiente com controle da diferenciação celular.

Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

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