Geração rápida e eficiente de neurônios a partir de células-tronco pluripotentes humanas, em um formato de placa Multititre

O objetivo geral do experimento a seguir é diferenciar células-tronco pluripotentes humanas ou H PSCs em neurônios usando um formato de placa de título múltiplo. Isso é conseguido colhendo e plaqueando uma suspensão de célula única de H PSCs no fundo V 96. Placas de poço para formar corpos embrionários ou EBS durante a noite.

Em seguida, o EBS é transferido para placas de fixação ultrabaixa em forma de U contendo meio de diferenciação para induzir a formação de neuroectoderma. Posteriormente, o EBS é colocado em placas revestidas de matrigel para promover o crescimento dos neurônios. Podem ser obtidos resultados que mostram a presença de marcadores neuronais típicos por volta do oitavo dia por imunofluorescência.

Protocolos de coloração para diferenciar células-tronco humanas pré-potentes em neurônios são muitas vezes complicados e tediosos. Um tanto acidentalmente. Encontramos um procedimento muito simples para fazer neurônios a partir de células-tronco humanas pré-potentes.

Do ponto de vista técnico, a principal vantagem desta técnica dos métodos existentes é que ela é fácil de executar, rápida e econômica. Ao mesmo tempo, apresentando o procedimento estará o Dr. MI Z do laboratório. Prepare o meio de formação de EB e o meio de diferenciação conforme descrito no protocolo escrito.

Cultive h PSCs em condições livres de alimentador, como um meio condicionado com metanfetamina em placas revestidas com matrigel, ou usando sistemas de cultura quimicamente definidos em condições de crescimento ativo subconfluente. O uso de um microscópio estereoscópico com uma ponta de pipeta de plástico estéril remove mecanicamente as colônias espontaneamente diferenciadas. Lave as colônias indiferenciadas restantes com PBS e use Accutane contendo um inibidor de rocha para digerir em células únicas.

Pulverize as células individuais por centrifugação a 200 G por dois minutos e Resus suspenda em um pequeno volume de meio de formação de EB. Use um hemocitômetro para determinar o título celular. Adicione células adicionais ao meio de formação EB restante para chegar a um título entre 40.000 e 80.000 células por mililitro.

Usando uma pipeta multicanal, transfira 100 microlitros por poço para uma placa inferior de 96 V, resultando em 4.000 a 8.000 células por. Poço. Girar a placa numa centrífuga de placas giratórias a 400 G durante um minuto para recolher todas as células no fundo dos alvéolos. Transfira as células para uma incubadora e permita que o EBS se forme durante a noite no dia seguinte sob o microscópio estereoscópico.

Colete o EBS e transfira em um pequeno volume para um prato bacteriano de 3,5 centímetros contendo dois mililitros de diferenciação. Média. Lave as células girando suavemente o prato. Adicione 100 microlitros de meio de diferenciação a cada poço de um acessório ultra baixo que você.

Placa inferior de 96 poços sob um microscópio estéreo. Transfira o EBS em pequenos volumes do prato para os poços de 96 U. Incubar o EBS por quatro dias para permitir a formação de neuroectoderma no quarto dia.

Lave as células em meio de diferenciação e semeie-as uma a uma nos poços de uma placa de título múltiplo revestida com matrigel, como uma placa de 12 poços. As células devem ser distribuídas igualmente dentro dos poços para permitir o crescimento não perturbado dos neurônios. Deixe o EBS se prender frouxamente ao matrigel por aproximadamente 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, transfira cuidadosamente a placa para a incubadora. Os neurônios crescerão a partir do EBS revestido de maneira radial nos próximos quatro dias. Anteriormente, mostramos que, em linha com muitos outros, o EBS de H PSCs poderia ser gerado simplesmente por replaqueamento, agregados após a divisão de rotina de H HPCs em pratos de baixa fixação.

Isso geralmente resulta em uma ampla distribuição de tamanhos de células. Outro problema é que os EBS mantidos em suspensão tendem a se agregar uns aos outros, levando a uma heterogeneidade de tamanho ainda maior para contornar esse único H PSCs foram alegados em poços de baixa fixação, o que resultou em nenhuma formação de EB e morte celular. No entanto, a combinação da molécula de sobrevivência celular, Y 2 7 6 3 2 com álcool polivinílico, que demonstrou aumentar a formação de EB a partir de HSCs, permitiu que o EBS se formasse a partir de suspensões HESC de célula única durante a noite.

Convenientemente, os tamanhos de EB neste formato de placa de titulação múltipla podem ser rigidamente controlados acomodando diferentes números de células por poço. Em contraste com o uso de técnicas convencionais, após a transferência de EBS para placas U de fixação ultrabaixa 96, a formação de neuroectoderma foi induzida usando um coquetel de pequenas moléculas consistindo de inibidores de F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA dois e BP SMA um, o que permitiu que as células fossem semeadas em matrigel para dar origem aos neurônios. Iniciar a formação de EB a partir de cerca de 8.000 células produziu a melhor capacidade de diferenciação neuronal, que é caracterizada por protuberâncias neuronais pronunciadas do ebs revestido.

Centros EB necróticos reduzidos após o plaqueamento e alta expressão de marcadores sensoriais e pan-neuronais, como B rrn três A e beta três tubulina. As eficiências gerais de diferenciação neuronal parecem ser comparáveis ao procedimento original, que é aplicável a HSCs e HI PSCs até agora. Três linhagens HPSC independentes, HES e células HIPS, foram testadas com sucesso no procedimento de vários poços, enquanto a variabilidade dependente da linhagem celular e as eficiências de diferenciação geralmente não podem ser descartadas.

Esta figura mostra quatro células neuroectodérmicas dissociadas em um único dia que foram plaqueadas como células únicas e diferenciadas com sucesso em aproximadamente 60% de eficiência O manuseio do EBS na plataforma de vários títulos requer um pouco de treinamento no início, mas depois de algum tempo, você verá que é muito fácil.