Transplante ortotópico de aorta em camundongos para o Estudo da Doença Vascular

O objetivo deste procedimento é transplantar a aorta abdominal de um camundongo doador para um camundongo receptor alogênico. Isso é realizado primeiramente obtendo a aorta doadora. Em seguida, o local do enxerto é preparado no animal receptor.

A aorta nativa do animal receptor é então dissecada e dividida. O passo final consiste em utilizar duas anastomoses vasculares extremidade com extremidade para implantar a aorta do doador. Em última análise, este procedimento pode ser utilizado para estudar o desenvolvimento de doenças vasculares pós-transplante em combinações de linhagens alogênicas.

A vantagem deste método em relação, por exemplo, ao transplante cardíaco heterotópico, é que é mais fácil realizar a análise morfométrica, pois os vasos possuem tamanho uniforme. Além disso, o vaso não é cercado por tecido parenquimatoso, que pode estar rodeado por infiltrados celulares e outras estruturas que podem complicar a análise dos dados gerados. O uso desta técnica pode ser particularmente útil para ilustrar os mecanismos envolvidos na doença vascular pós-transplante, um problema intratável no transplante clínico humano.

Para minimizar os efeitos do estresse e maximizar suas reservas de energia, mantenha os animais no biotério por pelo menos 72 horas antes da cirurgia. No dia da cirurgia, coloque uma placa cirúrgica de metal sobre um tapete aquecido regulado entre 35 e 38 graus Celsius. Em seguida, após a anestesia, remova os pelos do abdômen ventral do animal.

Use fita laboratorial para fixar o animal em posição de braços abertos sobre a mesa cirúrgica e, em seguida, sanitize a área depilada do animal três vezes com um desinfetante, seguido de etanol, utilizando tesoura estéril. A seguir, faça uma incisão na parede abdominal para expor as vísceras abdominais. Depois, use um cotonete estéril para afastar as vísceras para o lado e colocá-las sobre uma gaze estéril umedecida com solução salina morna, expondo os grandes vasos do abdômen.

Agora, dissecar cuidadosamente com ponta romba a aorta abdominal do tecido circundante, incluindo a veia cava inferior, e então levantar e cauterizar cuidadosamente a artéria lombar. O segmento da aorta para dissecção deve estar abaixo dos vasos renais e acima da bifurcação da aorta nas artérias femorais. Após identificar a região, colocar um ponto de sutura logo abaixo das artérias renais e outro logo acima da bifurcação.

Em seguida, use uma tesoura para dividir a aorta e, então, segure com muito cuidado uma das extremidades do vaso e goteje solução salina heparinizada para que ela escoe pelo vaso por ação da gravidade. Em seguida, manuseie as extremidades do vaso o mínimo possível. Remova o enxerto e coloque-o imediatamente em um recipiente com solução salina gelada.

Após administrar anestesia e analgesia ao animal receptor, realize a tricotomia do abdome ventral conforme acabou de ser demonstrado. Aplique pomada oftálmica de gentamicina nos olhos para evitar que sequem, e em seguida sanitize o abdome como acabou de ser demonstrado, garantindo uma desinfecção adequada. Agora, faça uma incisão mediana através da pele e da parede corporal em estágios.

Em seguida, insira um afastador para manter a incisão abdominal aberta, orientando o conjunto de parafuso para a extremidade posterior do animal, a fim de manter a maior parte do grampo fora do caminho. A seguir, coloque uma gaze estéril umedecida com solução salina sobre os intestinos. Depois, segure suavemente a gaze no lugar com um dedo.

Insira um cotonete estéril sob os intestinos e reflita-os suavemente para que os intestinos fiquem apoiados sobre a gaze. Coloque outro pedaço de gaze estéril sobre os intestinos e umedeça-o com solução salina. Após remover cuidadosamente qualquer tecido adiposo que recubra a ATA e a veia cava inferior, use pinça para dissecar cuidadosamente a aorta infrarrenal da veia cava inferior.

Agora, limpe uma área suficientemente grande para acomodar duas pinças e com vasos em quantidade suficiente para, quando divididos, haver vasos com comprimento adequado para a sutura do enxerto. Observe que o fio preto pode ser usado para sentir o seu peso ao longo do vaso. Ao dissecar, procure por ramificações dos vasos, cauterizando-as com um cauterizador de baixa temperatura conforme necessário.

A seguir, insira um clamp vascular logo abaixo da artéria renal e outro clamp vascular logo acima da bifurcação. Em seguida, corte a aorta. Neste caso, o corte é feito mais próximo da bifurcação porque um vaso colateral foi cauterizado próximo ao meio entre os dois clamps, criando assim um local de passagem para a anastomose; as extremidades da aorta geralmente se retrairão, deixando um espaço de cerca de cinco milímetros.

Verifique a hemostasia. Se os grampos estiverem funcionando corretamente, apenas uma pequena quantidade de sangue deve escapar após o corte. Em seguida, lave as extremidades cortadas da aorta com solução salina heparinizada e depois remova o excesso da solução com um cotonete.

Agora fixe o enxerto no lugar usando três suturas descontínuas em cada extremidade. Em seguida, suture um lado da anastomose em cada extremidade e complete o restante com sete a oito suturas descontínuas. Se for preferida uma sutura contínua, tenha cuidado para que as paredes do vaso permaneçam relaxadas e para que não ocorra estenose na anastomose.

Agora, remova cuidadosamente o clamp na extremidade cranial da aorta e verifique vazamentos nas linhas de sutura. Em seguida, pressione suavemente a aorta acima do local da anastomose com um aplicador de algodão umedecido e remova o segundo clamp. Pressione e solte levemente a aorta algumas vezes para verificar se o vaso está pérvio. O enxerto será perfundido imediatamente e um pulso deve ser visível.

Agora, remova a gaze que cobre os intestinos e reposicione-os em sua posição normal, mantendo sua orientação anatômica habitual e evitando torções. Utilize uma sutura Vicryl 5-0 para fechar a camada muscular e, em seguida, feche a pele com uma sutura de prolina 5-0 ou 6-0. Trate o camundongo por via subcutânea com carprofeno para potencializar a analgesia antes de interromper a anestesia, e em seguida administre ao camundongo de 0,5 a 0,8 mililitros de soro fisiológico pela mesma via.

Por fim, coloque o camundongo em uma gaiola aquecida para recuperação e monitore cuidadosamente o animal. Após 12 e 24 horas da operação, administre respectivamente buprenorfina e carprofeno por via subcutânea ao animal. Esta primeira figura mostra um enxerto aórtico.

Observe as linhas de sutura indicadas pelas setas brancas aqui. É apresentado um experimento típico no qual a sobrevida dos receptores foi acompanhada por um período de 56 dias. O grupo controle consistiu de camundongos receptores do tipo selvagem C57BL/6 por FVB transplantados com aortas intestinais.

O grupo experimental consistiu de receptores C57BL/6xFVB deficientes na expressão da heme oxigenase um. Esse knockout resulta em trombose dos enxertos dentro de 24 horas. Notavelmente, isso resultou na morte de todos os receptores.

Esta última figura mostra as medidas de eco da veia cava inferior e da aorta abdominal em um animal normal e em um receptor de transplante. Observe que o enxerto está pérvio e tem aparência semelhante à da aorta sem transplante. Como você pôde ver, os tecidos são muito delicados e pequenos, portanto, é importante ter em mente que este procedimento é certamente uma habilidade adquirida e, por isso, será necessário praticar bastante antes que possa ser realizado com sucesso e rotineiramente. Uma vez dominado.

Essa técnica pode ser realizada em até uma hora se for executada corretamente.