Dissecção e imunohistoquímica de larvas, pupa e adulto Drosophila Retinas

O objetivo geral deste procedimento é obter dissecções ideais das retinas de drosófilas e visualizar proteínas expressas na retina em desenvolvimento. Primeiro, as dissecções da retina são demonstradas em três estágios de desenvolvimento, o estágio larval, o estágio da pupila e o estágio adulto. Os próximos passos são a fixação e a imuno-histoquímica.

Na etapa final, as retinas são montadas em lâminas para visualização por meio de microscopia confocal. Em última análise, este protocolo mostra o desenvolvimento e a diferenciação das células da retina no nível de uma única célula. Historicamente, a retina da mosca tem sido um sistema ideal para abordar uma ampla gama de questões na biologia do desenvolvimento e estudar os mecanismos regulatórios genéticos subjacentes.

Aqui mostramos técnicas para visualizar o desenvolvimento de células da retina de um estágio pluripotente para um estado terminalmente diferenciado, mostrarei como dissecar lava ou retina. Demonstrarei dissecções nas retinas da pupila média, uma vez que os núcleos dos fotorreceptores estão quase no mesmo plano focal. Este estágio é ideal para comparação da expressão de proteínas nucleares localizadas, como fatores de transcrição.

Hoje vou mostrar como dissecar retinas de moscas adultas. Para facilitar o estadiamento reprodutível das fases de desenvolvimento, mantenha a drosófila a uma temperatura constante de 25 graus Celsius e sob um ciclo de luz escura de 1212 nessas condições. As larvas do terceiro ínstar estarão disponíveis cerca de 96 horas após a regulação, quando as larvas do terceiro ínstar tardio deixarem o alimento para comer.

Eles podem ser removidos com uma escova macia ou uma pinça. Depois de coletar as larvas, coloque-as em uma gota de PBS frio em uma placa de dissecação syl guard. Prepare-se para dissecar cerca de 10 a 15 retinas por grupo experimental.

Sob um microscópio de dissecação, localize a extremidade anterior da lava, que contém os ganchos da boca. Use uma pinça para pressionar suavemente a parte central da lava contra a base do prato de proteção de silicone. Use outra pinça para agarrar os ganchos da boca e puxe suave e lentamente para longe do corpo.

Descarte a parte principal do corpo e, em seguida, use as partes da boca para segurar a parte anterior. O objetivo aqui é remover tecidos estranhos do imaginário, dos discos e do cérebro. Agora pegue os ganchos da boca com a pinça e transfira o cérebro com os discos imaginários para um copo de três mundos, prato do mundo cheio de PBS.

Em seguida, substitua o PBS por um fixador recém-preparado e incube o tecido em um agitador por 15 minutos em temperatura ambiente. Após 15 minutos, remova o fixador com uma pipeta P 200. Enxágue o lenço duas vezes com PBS e transfira para um banho fresco de PBS.

Lave o lenço em uma coqueteleira em temperatura ambiente por 30 minutos. Agora, remova o PBS e enxágue os lenços duas vezes com PBST. Em seguida, adicione PBST fresco e prepare-se para dissecar ainda mais o tecido ao microscópio.

Remova as glândulas salivares e o tecido adiposo. Em seguida, separe o disco imaginário do olho do outro tecido. Agora está pronto para ser submetido ao processamento imuno-histoquímico.

Depois de processar os tecidos, transfira-os para o centro de uma lâmina de vidro limpa. Usando uma pipeta P 20, remova o excesso de solução e, em seguida, use uma pinça para alinhar as retinas ao centro da lâmina. Para imagens.

Agora aplique 10 microlitros de meio de montagem nas retinas. Cubra-os suavemente com uma lamínula e sele a lâmina com esmalte transparente. A 25 graus Celsius, 50% púbis será observável em cerca de 48 horas após a pupação.

Eles são melhor cronometrados circulando, apenas formando branco ou 0% de púbis no frasco ou simplesmente movendo-os para um novo frasco. Após 48 horas, a pupa média pode ser cuidadosamente removida usando uma pinça e transferida para PBS Sob o microscópio, segure a extremidade posterior da caixa da pupila com a pinça. Em seguida, agarre a superfície anterior da cutícula com outra pinça e remova suavemente o opérculo.

Retire qualquer cutícula residual para expor completamente a cabeça. Agora, use as pontas da pinça para perfurar o saco macio subjacente na região dorsal anterior. Isso fornece acesso à cabeça.

Separe suavemente a cabeça do tórax sugando lentamente a cabeça com uma pipeta P 20, expulse a cabeça da pipeta para PBS fresco. As retinas ligadas ao cérebro estarão flutuando livremente. Uma gota adicional de PBS pode ajudar a localizar as retinas transparentes.

Assim que os tecidos se assentarem, remova o excesso de tecido, incluindo a cutícula da cabeça e os probos. Transfira as retinas e o cérebro para PBS fresco com todas as retinas e cérebros isolados em PBS. Substitua a solução por um fixador recém-preparado.

Em seguida, incube o tecido em um agitador por 15 minutos em temperatura ambiente. Após 15 minutos, remova o fixador com uma pipeta e enxágue o tecido três vezes. Com PBST, permita que os tecidos permaneçam banhados em PBST e prepare-se para uma dissecção adicional.

Esta é a etapa mais desafiadora do protocolo. Remova a lâmina e o cérebro estudando primeiro o tecido. Perfure o lobo óptico usando uma agulha de dissecação muito afiada.

Em seguida, insira uma agulha de dissecação igualmente afiada entre a lâmina e a retina para separar a retina da lâmina e do lobo óptico. As retinas agora podem ser manchadas, no entanto, tome muito cuidado ao manuseá-las, pois são muito frágeis e pegajosas. Depois de corar o tecido, monte as retinas da pupila média usando uma pipeta P 20 para transferi-las para o centro de uma lâmina de vidro limpa e carregada positivamente.

Remova qualquer excesso de PBST e, em seguida, use as agulhas para alinhar as retinas para a imagem. Agora aplique 10 microlitros de meio de montagem nas retinas. Usando um pano e ação capilar, remova o PBST após aplicar suavemente uma lamínula.

A lâmina está pronta para a obtenção de imagens. Comece coletando as cabeças de moscas de dois a cinco dias em um prato selvagem de vidro contendo um XPBS frio. Transfira uma única cabeça para uma gota de PBS frio em um prato S.

Comece a dissecção agarrando a cápsula anterior da cabeça com uma pinça e, em seguida, remova as partes da boca. Em seguida, pegue a cutícula ventral posterior da cabeça com uma pinça e use a outra para separar um olho da cutícula, rasgando ao longo de sua borda. Prossiga removendo a cutícula na margem do olho para manipulações posteriores.

É conveniente deixar um pequeno pedaço de cutícula preso à retina. Agora transfira a retina para um prato selvagem de vidro contendo PBS frio usando uma pinça Quando todas as retinas forem dissecadas. Substitua o PBS por um fixador recém-preparado.

Certifique-se de que a parte interna da retina esteja em contato com o fixador. Mesmo que a retina esteja flutuando na superfície, incube o tecido em um agitador por 15 minutos em temperatura ambiente Após 15 minutos, remova o fixador com a pipeta P 200 e enxágue o tecido duas vezes com PBS. Em seguida, lave o lenço por 30 minutos ou mais em um shaker em temperatura ambiente.

Agora, remova o PBS, adicione PBST e prepare-se para remover as lâminas. Freqüentemente, a lâmina permanece presa à superfície interna da retina dissecada. Remova-o agarrando a retina em uma borda com a pinça e puxando suavemente a lâmina com a outra pinça.

Em seguida, remova qualquer cutícula restante para que ela não se dobre na retina. Durante a montagem, os tecidos da lâmina e da cutícula interfeririam na visualização dos fotorreceptores corados. As retinas agora podem ser coradas.

A dissecação de retinas adultas pode ser dominada com algumas semanas de prática. Jorrar e remover as lâminas é provavelmente a parte mais difícil. Meu conselho é ser paciente e dissecar muito mais do que você acha que vai precisar.

Também ajuda a praticar com moscas de olhos vermelhos antes de tentar com moscas de olhos brancos. Uma vez coradas, as retinas devem ser orientadas em uma lâmina de ponte para serem visualizadas. Uma vez presa com fita adesiva, a luz da ponte pode ser armazenada a quatro graus Celsius usando o procedimento descrito.

Amostras de retinas em três estágios de desenvolvimento são preparadas para microscopia. Um disco de imagem de olho larval foi corado com anticorpos que detectam dois fatores de transcrição que são expressos em diferentes tipos de fotorreceptores. A proteína sete up é mostrada em verde e a proteína nanica é mostrada em magenta.

Uma retina isolada da pupila média foi incubada com anticorpos que visualizam diferentes tipos de fotorreceptores. As manchas são contra o LLV em azul, que rotula todos os fotorreceptores e contra o prospero. Em ciano, que rotula R sete fotorreceptores.

Uma retina adulta foi corada com duas gotas vermelhas em anticorpos para visualizar dois subtipos de fotorreceptores. A expressão estocástica e mutuamente exclusiva de RH cinco em ciano e Rh seis em vermelho ocorre em dois subtipos de fotorreceptores R oito. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar as retinas larvais da pupila e da gripe adulta e como visualizar as células da retina usando imuno-histoquímica.

Combinado com as abordagens disponíveis de perda específica do olho e ganho de função. Este protocolo permitirá que você estude os mecanismos genéticos subjacentes ao desenvolvimento ocular. Obrigado por assistir e boa sorte com seus experimentos.