Name: Nanopartículas virais para Em vivo Imaging Tumor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Aprenda a usar nanopartículas virais de plantas para imagem de tumores em modelos de xenotransplante murino. Este método demonstra marcação fluorescente, biodistribuição e aplicações potenciais em terapias oncológicas direcionadas.

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Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIBIB bolsas R00 EB009105 (para NFS) e P30 EB011317 (para NFS), um NIH / NIBIB treinamento concessão T32 EB007509 (para AMW), um Case Western Reserve University Interdisciplinar Alliance Investment Grant (a NFS), E um caso Comprehensive Cancer Center concessão P30 CA043703 (para NFS). Agradecemos aos Steinmetz Lab pesquisadores estudantes de graduação para suas mãos no apoio: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D&#39;Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Assim, e Paulo Chariou .

1. VNP (CPMV, VMB, PVX, e TMV) Propagação <ol><li> Defina a câmara de plantas de interior controla a 15 horas do dia (100% de luz, 25 ° C, umidade 65%) e 9 horas da noite (luz 0%, 22 ° C, umidade 60%). </li><li> Inocular plantas de acordo com a linha do tempo na Tabela 1. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX, TMV e BMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> Dia 0: Fábrica 3 caupi sementes / vaso. </td><td> Dia 0: Planta ~ 30 sementes de N. benthamiana / vaso. Fertilizar uma vez por semana, com uma colher de sopa de adubo / 5 L de água. </td></tr><tr><td> Dia 14: Re-pote N. benthamiana em uma planta / vaso. </td></tr><tr><td> Dia 10: Infect deixa folhas primárias com CPMV (5 μg/50 ul / folha) por inoculação mecânica com um pouquinho de carborundum. </td><td> Dia 28: Infect três a five sai com PVX, TMV, ou BMV (5 μg/50 ul / folha) por inoculação mecânica com um pouquinho de carborundum. </td></tr><tr><td> Dia 20: Folhas de Colheita e armazenar a -80 ° C. </td><td> Dia 42: Folhas de Colheita e armazenar a -80 ° C. </td></tr></tbody></table> Timeline Tabela 1. Para crescer, infectando e corte de folhas. Nota: A propagação CPMV só é demonstrada como um exemplo. 2. Purificação VNP (CPMV, BMV, PVX e TMV) Nota: Todos os passos são realizados em gelo ou a 4 ° C. <ol><li> Homogeneizar 100 g de folhas congeladas em um misturador padrão com 2 volumes de tampão frio (ver Tabela 2). Filtrar através de 2-3 camadas de gaze. </li><li> Para PVX, ajustar o pH para 6,5 ​​utilizando HCl 1 M. Adicionar 0,2% (w / v) de ácido ascórbico e 0,2% (w / v) de sódio sulfite. </li><li> Centrifugar homogenato bruto planta a 5.500 xg durante 20 min. Recolher o sobrenadante. </li><li> Para BMV, camada de 25 ml de sobrenadante de mais de 5 ml de 10% (w / v) de uma solução de sacarose. Centrifugar a 9.000 xg durante 3 hr pelotas e ressuspender em 38,5% de solução de CsCl (w / v). Mix agitando durante 5 horas, em seguida, continuar com o passo 2.12. </li><li> Extrair o material vegetal por adição de 0,7 volumes de 1:1 (v / v) de clorofórmio :1-butanol. Agita-se mistura durante 30-60 min. </li><li> Centrifugar solução a 5500 xg durante 20 min. Recolher a fase aquosa superior. </li><li> Adicionar NaCl a 0,2 M e 8% (w / v) de PEG (PM 8000). Para TMV, também adicionar 1% (v / v) de Triton X-100. Agita-se durante pelo menos 1 h, em seguida, deixar sentar durante pelo menos 1 hr. </li><li> Centrifugar solução a 15.000 xg durante 15 min. Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão. Para PVX, adicionar 0,1% de β-mercaptoetanol e de ureia a 0,5 M. </li><li> Centrifugar a 8.000 xg durante 30 minutos e recolher o sobrenadante. </li><li> Ultracentrífuga sobrenadante a 160000 xg durante 3 hr. Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão overnight. </li><li> Preparar um gradiente de sacarose de 10-40% o uso de volumes iguais de 10%, 20%, 30% e 40% de sacarose em tampão (mais pesado primeiro). Permitir que o gradiente se equilibre durante a noite à temperatura ambiente. </li><li> Ultracentrífuga sedimento ressuspenso sobre gradiente de sacarose a 100.000 xg durante 2 horas (24 horas para BMV). </li><li> Colete banda de espalhamento de luz e dializar contra tampão. </li><li> Caracterizar os VNPs (abaixo) e armazenar a 4 ° C. Para armazenamento de longo prazo, armazenar a -80 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV e TMV </td><td> 0,1 M de tampão fosfato de potássio (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM de K 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0,5 M de tampão de borato (pH 7,8) 0,5 M de ácido bórico Ajustar o pH com NaOH </td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA tampão (pH 4,5) 250 mM de acetato de sódio 10 mM de MgCl2 2 mM β-mercaptoetanol (adicionar fresco) </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Buffers e suas receitas para cada VNP. Nota: A propagação CPMV só é demonstrada como um exemplo. 3. Caracterização VNP (CPMV, VMB, PVX, e TMV) <ol><li> Realizar a espectroscopia UV / visível para determinação da concentração de VNPs. <ol><li> Medir a absorvância de 2 ul de amostra, utilizando um espectrofotómetro NanoDrop. </li><li> Determinar a concentração de partículas e corantes utilizando a lei de Beer-Lambert (A εcl =, em que A é a absorvância, ε é o coeficiente de extinção, c é a concentração, e L é o comprimento do caminho). O comprimento do percurso é de 0,1 cm para o NanoDrop. Os coeficientes de extinção VNP-específicos são os seguintes: CPMV: 8.1 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm) PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm) TMV: 3.0 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm) BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm) </li></ol></li><li> Analisar partículas por exclusão de tamanho de cromatografia líquida rápida de proteína (FPLC). <ol><li> Usando uma coluna de Superose 6 de exclusão de tamanho e o Explorador Akta, ug de carga 50-100 VNPs em 200 ul de 0,1 M de tampão de fosfato de potássio (pH 7,0). </li><li> Definir detectores de 260 nm (ácido nucleico), 280 nm (proteína) e o comprimento de onda de excitação de quaisquer corantes ligados. </li><li> Correr a uma taxa de fluxo de 0,5 ml / min durante 72 min. </li><li> O perfil de eluição e A260: A280 nm indica se a preparação VNP é pura e se as partículas estão intactos e montados. O A260 seguinte: 280 rácios indicam uma preparação pura VNP: CPMV: 1,8 ± 0,1 PVX: 1,2 ± 0,1 TMV:1,1 ± 0,1 BMV: 1,7 ± ​​0,1 </li></ol></li><li> Executar desnaturação (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris de poliacrilamida de electroforese em gel de gradiente 4-12% para analisar a pureza da preparação e conjugação de proteínas de revestimento individuais. <ol><li> Adicionar 3 ml de tampão de amostra LDS 4x a 10 ug das partículas em 9 ul de tampão de fosfato de potássio. Adicionar um adicional de 1 ul de tampão de amostra LDS 4x e 3 ul de β-mercaptoetanol a BMV a reduzir o elevado número de ligações dissulfureto. </li><li> Incubar em bloco de aquecimento durante 5 minutos a 100 ° C. </li><li> Coloque as amostras num gel de SDS. </li><li> Executar amostras a 200 V durante 1 hora em MOPS 1x tampão de corrida. </li><li> Documentar o gel com luz UV para visualizar proteínas de revestimento fluorescente. </li><li> Para não fluorescente proteína, cora com azul de Coomassie (0,25% (w / v) de Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v / v) de metanol, 10% (v / v) de ácido acético) durante 1 h. </li><li> Destain com 30% de metanol, 10% de ácido acético durante a noite. Change a solução, se necessário. </li><li> Documentar o gel sob luz branca. </li></ol></li><li> Analisar a integridade das partículas por microscopia electrónica de transmissão (TEM). <ol><li> Diluir as amostras de 0,1-1 mg / ml em 20 ul de água desionizada. </li><li> Colocar 20 gotas uL das amostras de Parafilm. </li><li> Cobrir gotas com uma grelha TEM e deixe descansar por 2 min. Wick fora o excesso de solução da grelha com papel de filtro. </li><li> Lavar grade, colocando sobre uma gota de água desionizada seguida wicking seco. </li><li> Stain grade, colocando uma gota de 20 ul de 2% (w / v) de acetato de uranilo, durante 2 min. Wick fora o excesso de corante com papel de filtro. </li><li> Lavar grelha mais uma vez em água. </li><li> Observe grade sob um microscópio eletrônico de transmissão. </li></ol></li></ol> 4. Conjugação química de VNPs com PEG e fluoróforos, purificação e caracterização <ol><li> Para os cálculos para as reacções abaixo, a massa molar dos VNPs são: CPMV: 5,6x 10 6 g / mol PVX: 35 x 10 6 g / mol TMV: 41 x 10 6 g / mol BMV: 4,6 x 10 6 g / mol </li><li> Conjugado corantes e PEG a lisinas de superfície de CPMV PVX e utilizando um passo de N-hidroxi-succinimida da reacção de acoplamento: Adicionar 2,500 equivalentes molares (de todos os excessos molares referem-se a um excesso molar por VNP) de éster de succinimidilo Alexa Fluor 647 e 4.500 equivalentes de NHS- PEG (PM 5000), dissolvido em DMSO para CPMV em 0,1 M de tampão de fosfato de potássio. Quando se trabalha com PVX, adicionar um excesso molar de 10.000 NHS-corante e NHS-PEG. Ajustar os volumes de tampão e DMSO de tal forma que a concentração final de CPMV e PVX é de 2 mg / ml e de teor de DMSO é de 10% do volume total de reacção. Incubar a mistura de reacção durante a noite à temperatura ambiente, protegida da luz. CPMV e PVX tem 300 e 1.270 Usinas endereçáveis, respectivamente. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobremodificação química de CPMV e PVX: 13-15). </li><li> Corantes e conjugados de PEG a tirosinas de TMV por acoplamento de diazônio seguido de cobre (I) catalisados ​​cicloadição azida-alcino. <ol><li> Preparar o sal de diazónio (alcino) através da mistura de 400 ul de 0,3 M de ácido mono-hidratado p-toluenossulfónico, em 25 ul de 3,0 M de nitrito de sódio, e 75 ul de 0,68 M destilado 3-etinilanilina dissolvidos em acetonitrilo a 4 ° C durante 1 h. </li><li> Adicionar 3,3 ml de tampão de borato, pH 8,8, contendo 100 mM de NaCl e 1,25 ml de TMV (20 mg / ml de solução stock). </li><li> Reagir o TMV com 450 ul da solução de sal de diazónio (alcino) num banho de gelo durante 3 h para adicionar uma ligadura para tratar alcino TMV pelo acoplamento de diazónio. A solução vai se transformar em uma cor marrom claro. TMV tem 2140 tirosinas disponíveis para conjugação. </li><li> Purifica-se o produto final utilizando uma almofada de sacarose, tal como descrito no passo 4.4. </li><li> Anexar-funcional azida Alexa Fluor 647 e PEG-azida (MW 5.000) using de cobre (I) catalisados ​​cicloadição azida-alcino (CuAAC). Adicionar 2 equivalentes de corante e azida de PEG-proteína de revestimento por e incubar com 1 mM de CuSO 4, 2 mM de AMG, e 2 mM de ascorbato de sódio à temperatura ambiente durante 15 min. Ajustar o volume do tampão de tal modo que a concentração final da reacção de TMV é de 2 mg / ml. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobre a modificação química do TMV: 16,17). </li></ol></li><li> Conjugado corantes para lisinas e PEG para cisteínas de cisteína BMV mutante (cBMV): <ol><li> Adicionar 2,000 equivalentes molares de Oregon Verde 488 éster de succinimidilo dissolvidos em DMSO a 0,1 M em cBMV TNKM tampão (50 mM de base Tris, 50 mM NaCl, 10 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, pH 7,4). Ajustar os volumes de tampão e DMSO de tal forma que a concentração final de BMV é de 1 mg / ml e de teor de DMSO é de 10% do volume total de reacção. Incubar a mistura de reacção durante a noite a 4 ° C protegidos da luz. </li><li> Purificar partículas usando centrifugais filtros como descrito no passo 4.4. </li><li> Adicionar 2,000 excesso molar de PEG-maleimida (MW 2000), utilizando as mesmas condições de reacção como antes, e incubar a mistura reaccional durante 2 horas a 4 ° C. cBMV tem 180 Usinas reativos e cisteína. (O leitor é remetido para as seguintes referências para ler mais sobre a modificação química da BMV: 18). </li></ol></li><li> Purificação: Filtrar a solução através de uma almofada de sacarose a 40% (w / v) a 160.000 xg durante 2,5 horas. Re-dissolver o sedimento em tampão. Alternativamente, dializar contra tampão apropriado usando 10 kDa filtros de corte de rotação. </li><li> Caracterização: VNPs peguilado e marcado por fluorescência são analisadas utilizando os métodos acima descritos: UV / visível de espectroscopia, electroforese em gel SDS, FPLC, e TEM (não mostrado, no entanto, referem-se as Figuras 6 e 7). </li></ol> 5. Segmentação do tumor e imagem usando um modelo heteróloga Rato<ol><li> Cultura células HT-29 de cólon humano em meio RPMI suplementado com 5% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina, e 1% de L-glutamina, a 37 ° C em 5% de CO 2, utilizando 175 centímetros dois frascos de cultura de células. </li><li> Lave as células duas vezes com PBS estéril e colheita por incubação com 5 ml de tripsina-EDTA a 37 ° C durante 5 min. Inactivar a tripsina com 5 ml de meio RPMI. Recolher as células por centrifugação a 500 xg durante 5 min. a 4 ° C e ressuspender em meio RPMI fresco a 5x10 6 células/50 ul de meio (determinar contagem total de células utilizando azul de tripano e um hemocitómetro). Misturar-se com um volume igual de Matrigel antes da injecção (manter todas as soluções de reagentes e estéril). </li><li> Adquirir seis semanas de idade NCR nu / nu e mantê-los em uma dieta de alfafa livre para 2 semanas. [Nota:. Todos os procedimentos com animais deve ser aprovada IACUC] Induzir xenoenxertos de tumor por injecção subcutânea de 5x10 6 células/100 ul / tumor nos flancos (2 tumores / ratinho), utilizando um medidor de 18 1/2 estérilagulha. Monitorar os animais regularmente. Medir o tamanho do tumor usando compassos de calibre e permitir que os tumores a crescer a um volume médio de 20 mm 3 (dentro dos próximos 12 dias). Atribuir ratos a dois diferentes grupos aleatoriamente: PBS e VNP (n = 3 ponto animais / grupo / hora). Utilizando uma seringa de insulina de 1 ml de calibre 28, por administrar a injecção intravenosa da veia da cauda 100 ul de PBS estéril, ou 10 mg / kg de formulação VNP. </li></ol> Nota: experimentos de cultura de tecidos e estudos com animais vivos não será demonstrado. Demonstração prática será limitado ao processamento de tecido e aquisição de dados. Para uma referência no modelo de xenoenxerto de tumor HT-29, o leitor é remetido para ref 19. Três técnicas são usadas para avaliar tumor homing de VNPs: <ol start="4"><li> Imagens de fluorescência utilizando Maestro Imaging System: ratinhos sacrifício em pontos de tempo diferentes (2, 24, e 72 horas), utilizando CO 2gás. Dissecar os animais e impostos especiais de consumo todos os principais órgãos (cérebro, coração, pulmões, baço, rins e fígado), juntamente com os tumores nos flancos, coloque os tecidos em parafilme, e analisar com o instrumento usando imagens de fluorescência de excitação amarelo e filtros de emissão (800 ms exposição) para detectar a presença de sinais de fluorescência nos tecidos (derivado de A647 etiqueta conjugados aos VNPs). Salve as imagens e analisar intensidades fluorescentes usando ImageJ 1.44o software ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ). Comparar o padrão de absorção das VNPs em tumores com outros tecidos importantes, com o tempo. </li><li> Depois de imagem, corte cada tecido ao meio e incorporar um meia no composto outubro para análise crio-secção e confocal. Colete a outra metade em pré-pesados ​​crio-frascos e imediatamente congelá-los usando líquido N 2. Armazenar a -80 ° C até estar pronto para posterior processamento. </li><li> Quantificação de fluorescência: Retecidos da medula pesos. Descongelar os tecidos congelados à temperatura ambiente e colocá-los em diferentes tubos de 50 ml Falcon contendo 1 ml de PBS. Usando um homogeneizador de tecidos de mão, homogeneizar o tecido para 2-3 min em PBS, em seguida, transferir o homogenado a tubos de microcentrífuga. Centrifugar os homogeneizados durante 10 min a 13000 xg para remover o não-tecido homogeneizado. </li><li> Pipetar 100 uL do sobrenadante a partir de tecidos de cada grupo (PBS e VNP formulações / pontos de tempo) em uma placa de 384 poços UV preto. Avaliar a intensidade de fluorescência (Ex / Em comprimentos de onda 600/665), utilizando um leitor de placas. Normalizar os valores obtidos fluorescentes pelos pesos de tecido. </li><li> Imunohistoquímica: Prepare crio-micrótomo seções (10 m) e armazenar a -20 ° C. Stain secções de tecido para os núcleos das células (DAPI) e marcador de células endoteliais (marcado com FITC anti-ratinho CD31). Realizar análise de microscopia confocal para mapear a localização vascular e intra-tumoral de VNP fluorescente marcados. </li></ol> Nota: este procedimento não será demonstrada, os dados representativos são apresentados na Figura 8. Para uma referência em imuno-histoquímica e os métodos de coloração descrito, o leitor é remetido para ref 19.

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<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo proporciona uma abordagem para a modificação química da VNPs e suas aplicações para a imagiologia de tumores in vivo. As técnicas de imagem de animais de fluorescência, quantificação de fluorescência, e imunohistoquímica aqui apresentadas são úteis para o estudo de biodistribuição e avaliar tumor homing. Estas técnicas proporcionam informação valiosa sobre o acesso das nanopartículas para o tumor, através do efeito EPR. Ao combinar os resultados dos vários métodos de análise, obtemos uma...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Produção de VNP&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Câmara para plantas de interior</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; sementes (California black-eye no. 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; sementes</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;As sementes de N. benthamiana foram um presente do Salk Institute. As sementes são produzidas por meio da propagação da planta.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Carborundum</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Solo para envasar Pro-mix BX</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Fertilizante Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Equipamento&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>50.2 rotor Ti</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW 32 Ti</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>rotor SLA-3000</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>rotor SS-34</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Sorvall RC-6 Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de polipropileno</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>Para rotor SLA-3000</td></tr><tr><td>Frasco de policarbonato</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Para rotor SS-34</td></tr><tr><td>Tubo Ultra-Clear</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Para gradiente de sacarose e rotor SW 32 Ti</td></tr><tr><td>Garrafa de policarbonato</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>Para centrifugação e rotor 50.2 Ti</td></tr><tr><td>espectrofotômetro NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de géis pré-fabricados PowerEase 500</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de exclusão por tamanho Superose 6 10/300 GL (24 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;Cromatógrafo KTA Explorer 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>Centrífuga de bancada</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; sistema de imagem</td></tr><tr><td>Tissue-Tearor</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>Leitor de microplacas</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>microscópio confocal a varredura a laser FluoView</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Produtos químicos e reagentes&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-etinilanilina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>placa preta de 384 poços</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>Gel SDS-PAGE NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>tampão amostral LDS 4X</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>azida Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Ácido carboxílico Alexa Fluor 647, éster succinimidil</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Filtros Centrífugos Amicon Ultra-0,5 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>corte de 10 kDa</td></tr><tr><td>Aminoguanidina hidrocloreto</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Azul de Coomassie Brillante R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>Grau P5</td></tr><tr><td>FITC anti-rato CD31</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>sal de sódio do ácido L-ascórbico</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Lâmina de vidro de microscópio</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>tampão MOPS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-2k</td><td>PM 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>Nanocs</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>PM 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanocs</td><td>PG1-SC-5k</td><td>PM 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 éster succinimidila *isômero 6*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>ácido p-toluenossulfônico monoidratado</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato monobásico de potássio</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>acetato de sódio</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Nitrito de sódio</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>Sulfito de sódio</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>grade de MET</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Cultura de Tecidos&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>soro bovino fetal</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitômetro</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>células HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cultura de tecidos</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Azul de Tripano</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, 0,05% (1X) com EDTA 4Na, líquido</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;forte&gt;Estudos com Animais&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Dieta para Roedores com 18% de Proteína</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>Dieta livre de alfafa</td></tr><tr><td>Seringa de insulina</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>28 gauge</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de membrana basal Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>camundongos NCR nu/nu</td><td></td><td></td><td>Escola CWRU&lt;br/&gt; da Medicina, Instalação Central de Animais Atímicos e Xenografias</td></tr><tr><td>Seringa estéril</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18 1/2 gauge</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

nanopartículas virais para<em&gt; em vivo</em&gt; imaging tumor

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

O uso de nanomateriais tem o potencial de revolucionar a ciência de materiais e medicamentos. Actualmente, um número de diferentes nanopartículas estão a ser investigados para aplicações em imagiologia e terapia. Nanopartículas virais (VNPs) derivados de plantas pode ser considerada de auto-montagem bionanomaterials com tamanhos e formas definidas. Vírus de plantas em estudo em laboratório Steinmetz incluem partículas formadas por icosaédrica Cowpea mosaic virus (CPMV) e vírus do mosaico Brome (BMV), ambos os quais são de 30 nm de diâmetro. Também estamos a desenvolver estruturas em forma de bastonete e filamentosas derivados de vírus de plantas os seguintes: vírus do mosaico do tabaco (TMV), o qual forma hastes rígidas com as dimensões de 300 nm por 18 nm, e os vírus da batata X (PVX), que formam as partículas filamentosas 515 nm de comprimento e 13 nm de largura (o leitor é remetido para refs. 1 e 2 para mais informações sobre VNPs). <p class="jove_content"&gt; Do ponto de um cientista de materiais da vista, VNPs são blocos de construção atractivos por diversas razões: as partículas são monodispersas, podem ser produzidos com facilidade em larga escala in planta, são excepcionalmente estáveis ​​e biocompatíveis. Além disso, VNPs são &quot;unidades programáveis&quot;, que podem ser especificamente modificados usando a modificação genética ou métodos químicos bioconjugação 3. A estrutura de VNPs é conhecida a resolução atómica, e modificações podem ser efectuadas com uma precisão espacial ao nível atómico 4, um nível de controle que não pode ser conseguido usando os nanomateriais sintéticos com correntes estado-da-arte. Neste artigo, descreve a propagação de CPMV, PVX, TMV e BMV em Vigna ungiuculata e plantas Nicotiana benthamiana. Extracção e purificação de protocolos para cada VNP são dadas. Métodos para caracterização da purificada e VNPs quimicamente marcados encontram-se descritos. Neste estudo, nos concentramos em chrotulagem emical de VNPs com fluoróforos (por exemplo, Alexa Fluor 647) e polietileno glicol (PEG). Os corantes de rastreamento e facilitar a detecção dos VNPs 5-10, e PEG reduz a imunogenicidade das nanopartículas proteicas enquanto melhora sua farmacocinética 8,11. Demonstramos tumor homing de VNPs peguilado utilizando um rato modelo de xenoenxerto de tumor. Uma combinação de imagens de fluorescência de tecidos ex vivo utilizando Maestro Imaging System, a quantificação da fluorescência em tecidos homogeneizados, e microscopia confocal é utilizada para estudar a biodistribuição. VNPs são limpas por meio do sistema reticuloendotelial (RES); tumor homing de forma passiva, através da maior permeabilidade e efeito de retenção (EPR) 12. A nanotecnologia VNP é um poderoso plug-and-play tecnologia para imagem e tratar locais de doença in vivo. Estamos aprofundar VNPs para transportar cargas de drogas e porções de imagem clinicamente relevantes, bem como tecido-específicos para ligandosalvo receptores moleculares overexpressed em câncer e doenças cardiovasculares.

<img alt="Análise comparativa do crescimento de plantas; configuração experimental, estudo da variação da cor das folhas, método de clorose." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 Figura 1. Plantas infectadas por vírus de plantas. Plantas de Vigna unguiculata infectadas com CPMV (A). Plantas de Nicotiana benthamiana infectadas com PVX (B), TMV (C) e BMV (D). As imagens foram obtidas cer...

Nanopartículas de plantas virais (VNPs) são promissoras plataformas para aplicações em biomedicina. Aqui, descrevemos os procedimentos para a propagação de plantas VNP, purificação, caracterização e bioconjugação. Por fim, mostramos a aplicação de VNPs para homing tumor e de imagem usando um modelo de xenoenxerto mouse e imagens de fluorescência.

Nanopartículas virais para<em&gt; Em vivo</em&gt; Imaging Tumor

O uso de nanomateriais tem o potencial de revolucionar a ciência dos materiais e a medicina. Atualmente, diversas nanopartículas diferentes estão sendo ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar, in vivo, o direcionamento tumoral e a biodistribuição de nanopartículas virais marcadas com fluoróforos. Em modelos de tumor murino, primeiramente propague e purifique o vírus, em seguida conjugue os corantes e o PEG às partículas. Após caracterizar as partículas funcionalizadas, prossiga com a injeção delas em camundongos portadores de xenoenxertos tumorais.Os resultados da imagem de maestro, da intensidade de fluorescência, das medições de homogeneidade tecidual e da imunofluorescência mostram a localização das nanopartículas virais no tumor e em vários órgãos ao longo do corpo. Plataforma. Nanopartículas ou BMPs são plataformas promissoras para aplicações na biomedicina. Aqui descrevemos os procedimentos para VMP de PLA, propagação, purificação, caracterização e conjugação intestinal.Por fim, mostramos a aplicação de V mps no direcionamento tumoral e na imagem, utilizando um modelo de enxerto melanoma e imagem por fluorescência. Atualmente, diversas nanopartículas diferentes estão sendo investigadas para aplicações em imagem e terapia. As principais vantagens do uso de nanopartículas biológicas em comparação com materiais sintéticos

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós apresentamos uma nova abordagem para quantificar a localização das nanopartículas na vasculatura de tumores humanos xenografted utilizando dinâmicas, imagens em tempo real intravital em um modelo embrião aviária.

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Fonte: Kim, B. D., et al. Entrega de nanopartículas de uma carga útil de oligonucleotídeos em um modelo animal de glioblastoma multiforme. J. Vis. Exp. (2024)Este vídeo demonstra a injeção intravenosa de nanopartículas terapêuticas em um camundongo portador de glioblastoma. O método permite a entrega direcionada através da barreira hematoencefálica e oferece suporte a imagens não invasivas para avaliar a biodistribuição de nanopartículas e a eficácia terapêutica em tumores cerebrais.

Administração Intravenosa de Nanopartículas Terapêuticas em Modelo de Glioblastoma Murino

O vídeo demonstra um método de imagem de fluorescência para localização de anticorpos in vivo em um modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo. Envolve a injeção de células tumorais em um camundongo para gerar xenoenxertos sólidos sob a pele. A injeção subsequente de anticorpos fluorescentes confirma a localização específica por meio de sinais de fluorescência aprimorados dentro do xenoenxerto tumoral.

Imagem de fluorescência in vivo para localizar anticorpos em um modelo de xenoenxerto de tumor de camundongo

Este vídeo demonstra uma técnica envolvendo um radioimunoconjugado para a imagem in vivo de um tumor em um modelo de camundongo. Após a injeção do radioimunoconjugado, os anticorpos do conjugado se ligam a um antígeno de membrana específico nas células cancerígenas. O radiotraçador do conjugado emite pósitrons que interagem com elétrons vizinhos para produzir energia, que é detectada por um scanner de tomografia por emissão de pósitrons (PET) para criar uma imagem do tumor.

Uma técnica de imagem PET in vivo para detectar tumores em um modelo murino usando anticorpos radiomarcados

Este artigo detalha os procedimentos para a análise das nanopartículas tumor-alvo, Herdox imageamento óptico. Em particular, o uso detalhado do aparelho de imagem para detecção do tumor multimodo alvo e avaliar a penetração do tumor é descrito aqui.

Análise de Proteína Viral alvejado Nanopartículas entregue para tumores HER2 +

Este protocolo descreve as etapas necessárias para realizar a validação ex vivo de experimentos de imagem de xenoenxerto de fluorescência de infravermelho próximo in vivo em camundongos usando nanocorpos marcados com fluoróforo e anticorpos convencionais.

Validação de nanocorpo e Antibody Based<em&gt; In Vivo</em&gt; Experimentos Tumor Xenoenxerto NIRF-imagem em ratos usando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometria de fluxo e microscopia

A má compreensão do desempenho in vivo dos nanomedicamentos impede sua tradução clínica. Procedimentos para avaliar o comportamento in vivo de nanomedicamentos contra o câncer em níveis sistêmicos, teciduais, unicelulares e subcelulares em camundongos imunocompetentes portadores de tumor são descritos aqui. Essa abordagem pode ajudar os pesquisadores a identificar nanomedicamentos promissores contra o câncer para tradução clínica.

Um método completo para avaliar o<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance of Cancer Nanomedicinas

Descreveremos um protocolo para pré-clínicos em vivo rastreamento de metástases. É baseado em um repórter de radionuclídeos-fluorescência combinando o symporter de iodeto de sódio, detectado pelo não-invasiva [18F] tetrafluoroborate-animal de estimação e uma proteína fluorescente para confirmação simplificada ex vivo . O método é aplicável para pré-clínicos na vivo celular rastreamento além da biologia do tumor.

Radionuclídeo-fluorescência Gene do repórter de imagem para controlar a progressão do Tumor em modelos de roedores Tumor

Aqui, apresentamos métodos detalhados para a preparação e avaliação da vacina tumoral em nanoemulsão auto-montada nasal in vitro e in vivo.

Preparação, características, toxicidade e avaliação da eficácia da vacina contra tumores em nanoemulsão automontada nasal in vitro e in vivo

Apresentamos uma nova abordagem para microscopia de dois fótons da liberação tumoral de nanopartículas de óxido de ferro marcadas fluorescente para glioblastoma em um modelo de camundongo.

Microscopia Intravital de Dois Fótons de Glioblastoma em Modelo Murino

A barreira hematoencefálica é um obstáculo significativo na entrega de terapias para o glioblastoma, uma doença para a qual não há cura. Aqui, relatamos uma nano plataforma terapêutica de óxido de ferro guiada por imagem in vivo que pode contornar essa barreira fisiológica em virtude do tamanho e se acumular no tumor.

Entrega de nanopartículas de uma carga útil de oligonucleotídeo em um modelo animal de glioblastoma multiforme

Aprenda a usar nanopartículas virais de plantas para imagem de tumores em modelos de xenotransplante murino. Este método demonstra marcação fluorescente, biodistribuição e aplicações potenciais em terapias oncológicas direcionadas.

Nanopartículas virais para

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