Medição quantitativa da resposta imune e do sono em Drosophila

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar o sono e a função imunológica em drosófilas. Isso é alcançado primeiro registrando a atividade locomotora de moscas infectadas para medir o sono e a sobrevivência como uma segunda etapa após as moscas infectadas serem homogeneizadas, diluídas e espalhadas em placas de ágar LB. O número de unidades formadoras de colônias que crescem indica a capacidade das moscas de eliminar a infecção.

Em seguida, moscas infectadas que expressam um transgene contendo o repórter de luciferase NF kappa b são adicionadas a uma placa de 96 poços contendo luciferiano, o substrato da luciferase. A medição em tempo real da luciferase kappa b indica a ativação de uma via de sinalização NF kappa B durante a infecção e o resultado da sobrevida do sono. A depuração bacteriana e a atividade do repórter NF KB são medições que fornecem informações mecanicistas sobre a ligação molecular entre a função imunológica e o comportamento.

Geralmente, os indivíduos novos neste método ou lutam porque leva tempo e prática para aprender a infectar moscas manualmente com consistência. A principal vantagem da técnica relatada por Lúcifer sobre os métodos existentes, como o QPCR, é que a atividade do NF Kappa B pode ser medida continuamente em tempo real na vida. Moscas Comece incubando culturas de drosófilas em estágio tardio por três a quatro dias, para que os adultos se adaptem às condições ambientais.

Aqui, as moscas são colocadas sob luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano na resposta imunológica e no comportamento. Em seguida, carregue moscas de um a quatro dias de idade para a atividade. Os monitores registram sua atividade por um mínimo de três dias antes da infecção, um dia antes da infecção programada.

Escolha uma única colônia SIA com uma ponta de pipeta estéril e mergulhe a ponta em um tubo de cultura contendo cinco mililitros de meio LB para verificar a técnica estéril. Não se esqueça de fazer uma cultura simulada de controle sem bactérias. Cultive bactérias durante a noite até atingir a fase de crescimento exponencial no dia seguinte.

Meça a absorbância da cultura em 600 nanômetros. Inclua um segundo veterinário Q como um espaço em branco. Está pronto quando a concentração está entre 0,5 a uma subcultura de unidades de absorbância ou estende o tempo de cultura conforme necessário.

Agora prepare a solução bacteriana para infectar as moscas. Dilua as bactérias com PBS até uma absorbância esperada de 0,1 a 600 nanômetros. Em seguida, adicione corante alimentar para o controle de injeção.

Substitua as bactérias por meio LB. Armazene as duas soluções no gelo. Em seguida, usando um micro extrator de pipeta, faça agulhas de injeção com uma ponta fina sob um microscópio de dissecação.

Use uma pinça fina para quebrar a ponta de cada agulha de modo que a abertura seja grande o suficiente para encher com fluido de injeção usando sucção, mas também pequena o suficiente para minimizar os danos à mosca. Conecte uma agulha de vidro a uma seringa de plástico de três cc com um comprimento de tubo usando a seringa. O fluxo do meio de injeção é controlado manualmente.

Evite contaminar o tubo de borracha com fluido de injeção, pois o aparelho de seringa é usado para injeção infecciosa e de controle. Verifique o fluxo do meio de injeção com o uso de um lenço de papel Kim. Dois detalhes críticos para injeções bem-sucedidas são o uso do tamanho ideal da agulha e a vedação segura entre a agulha e a seringa.

Uma vez que o sistema de injeção esteja totalmente preparado, anestesiar as moscas usando um fluxo mínimo de dióxido de carbono, proceder rapidamente para que nenhuma mosca seja anestesiada por mais de cinco minutos. Agora injete moscas enfiando a agulha de vidro na região acima do telo inclinado do tórax dorsal. A passagem do meio de injeção para a mosca é verificada pelo corante alimentar, que pode ser visto à medida que a solução injetada se espalha.

Antes de começar, certifique-se de que todos os materiais utilizados para este procedimento também foram autoclavados com pelo menos um dia de antecedência. Prepare placas de Petri de 10 centímetros com meio de ágar LV. No dia do experimento, anestesiar e colocar as moscas em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro.

Preparar um mínimo de dois grupos de 10 moscas cada por condição experimental. Prepare também um grupo de controle de moscas sem infecção, especialmente ao usar uma cepa bacteriana sem resistência a antibióticos. Armazene todos os tubos carregados no gelo.

Em seguida, adicione 400 microlitros de meio LB a cada tubo carregado com mosca. Homogeneizar as moscas usando um pequeno repique e fazer isso perto de uma chama para evitar contaminação. Agora, usando as pontas da pipeta cortadas, diluir em série o homogeneizado por fatores de 10 em volumes de 200 microlitros.

Se o homogeneizado for feito imediatamente após a infecção com sia, diluir até um a 1000, mas por 24 horas, homogeneizado pós-infecção, perfazer até um a 100.000. Em seguida, as duas maiores diluem em placas de 10 centímetros usando bolas de vidro para garantir uma distribuição uniforme, incubar as placas durante a noite. No dia seguinte, conte o número de colônias na placa por observação direta ou via software de contagem de colônias.

Em seguida, calcule o número de unidades formadoras de colônias por mosca. Este ensaio usa moscas transgênicas carregando o repórter de luciferase kappa b no momento apropriado. O ensaio também requer bactérias cultivadas, como SCIA, preparadas para injeção, conforme descrito na seção anterior.

Ajuste as moscas às condições experimentais de iluminação. Neste exemplo, as moscas kappa b luciferase de um a quatro dias são alojadas em frascos contendo 5% de sacarose, 2% de meio alimentar de ágar e colocadas em luz constante por dois dias. Agora prepare uma microplaca de 96 poços para as moscas.

Encha cada poço com duas camadas de comida. Meio primeiro, adicione 300 microlitros de solução de sacarose a 5% e ágar a cada um. Cubra bem o prato com um pano de malha fina e deixe o prato secar completamente por até uma hora.

Em seguida, adicione uma camada superior de 50 microlitros a cada poço contendo 5% de sacarose, 1% de ágar e dois milimolares de Lúcifer. Como Lúcifer é sensível à luz, deixe a placa secar no escuro e avançando. Minimize a exposição à luz da placa.

Assim que o ágar esfriar, cubra a placa com filme adesivo transparente. Em seguida, usando uma agulha fina, perfure o filme duas vezes em cada poço. Esses orifícios permitem a troca de ar e a anestesia gasosa.

Em seguida, para facilitar o carregamento da mosca, use uma lâmina afiada e uma borda reta para introduzir um corte entre cada coluna. Anestesiar as moscas com dióxido de carbono e carregá-las uma a uma em cada poço, coluna por coluna. Se uma mosca ficar presa ao filme, dê-lhe a oportunidade de se libertar antes de intervir.

Retorne a placa de micropoço para a incubadora sob luz constante por oito a 24 horas. Para anestesiar as moscas bem amarradas, use uma ponta de micropipeta presa a uma linha de dióxido de carbono de baixa pressão. Certifique-se de que o gás esteja a uma pressão inofensivamente baixa e coloque a ponta da micropipeta diretamente acima dos orifícios de ventilação para anestesiar uma mosca em grupos de oito individualmente.

Transfira cada mosca para uma almofada de CO2 e infecte-as com bactérias como anteriormente. Em seguida, retorne cada mosca ao seu poço original e feche novamente a microplaca. Meça a luminescência em cada mosca usando um luminômetro alojado em uma sala com temperatura controlada sob um cronograma de iluminação definido.

Coloque as placas no de empilhamento, certificando-se de empilhar as placas contendo as moscas entre as placas em branco transparentes. Programe o luminômetro de acordo com as especificações do fabricante e colete leituras a cada hora por um período mínimo de 24 horas. Neste exemplo, os detectores são programados para ler cada poço por 10 segundos.

Depois de concluído, exporte os arquivos de dados para uma planilha e execute uma análise padrão representando graficamente os resultados. Os dados de exemplo podem ser analisados. Os descontos por segundo tiveram uma média de três leituras por poço.

O tipo selvagem do Cantão S voa e saboreia. Moscas mutantes E 20 sem o gene NF kappa B foram carregadas em dois monitores de atividade em luz constante e infectadas com sia. Neste exemplo, a infecção promoveu o sono.

Ficou claro que os mutantes E 20 experimentaram menos sono do que os de Cantão. Moscas de controle após a infecção. Consistente com descobertas anteriores, os mutantes E 20 também sucumbiram rapidamente à infecção em comparação com as moscas do tipo selvagem.

A maioria das moscas sobreviveu à injeção de controle asséptico, indicando que as moscas sucumbiram à infecção e não à lesão devido à injeção. Como os mutantes de prazer morreram tão rapidamente, apenas as moscas de Canton foram usadas para demonstrar a carga bacteriana após a infecção. A Sia continuou a proliferar na mosca 24 horas após a infecção.

A atividade repórter de Lúcifer mostrou grande variação entre moscas individuais e entre o sucesso dos pontos de dados. Embora o sinal seja derivado de todos os tecidos dentro da mosca, não se espera que todos os tecidos emitam a mesma quantidade de sinal e a visibilidade do tecido para o detector varie à medida que a mosca se move. Neste exemplo, as moscas foram infectadas e comparadas com um grupo de controle manipulado.

As moscas que morreram foram excluídas da análise em um grupo de moscas. A atividade do repórter da luciferase Kappa b aumenta constantemente após a infecção. A atividade do repórter Kappa b Luciferase também aumentou constantemente após lesão asséptica.

O pico de atividade foi de cerca de 12 horas tanto para a pós-lesão quanto para a pós-infecção. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a função imunológica e dormir em SSO após a infecção. Podemos medir o sono, a sobrevivência, o tempo, a depuração bacteriana e a atividade em tempo real de um repórter de transcrição não copiado.