Name: Medição quantitativa da resposta imune e do sono em Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprenda a medir resposta imune e sono em Drosophila usando atividade locomotora, sobrevivência e repórter luciferase NF-κB. Este método permite analisar a relação entre função imunológica e comportamento em tempo real.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, Grant # IOS-1025627 e pelo Instituto Nacional de Saúde sob concessão # 1R21NS078582-01 a JAW

Este protocolo utiliza duas configurações (Figura 1) para adquirir quatro leituras diferentes recolhidos de moscas submetidos a uma infecção bacteriana. Estas saídas incluem 1) sono / vigília comportamento, 2) O resultado da sobrevivência, 3) a carga bacteriana em tempo real, e 4) em tempo real a medição de actividade de NFkB repórter in vivo. Em combinação com as ferramentas genéticas que estão disponíveis em Drosophila, estas medições fornecem uma visão mecanicista para a ligação molecular entre a função imunológica e no comportamento. 1. Atividade medida Locomotor e do sono nas moscas <ol><li> A configuração utilizada para medir a atividade locomotora e dormir em moscas, que inclui o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila (DAM2, Trikinetics), incubadoras, quarto escuro, ea preparação de animais experimentais e tubos de atividade, tem sido descrito anteriormente 6. A mesma abordagem é usada aqui, com algumas pequenas modificações. <ol class="lalpha"><li&gt; A iluminação da incubadora é controlada pela incubadora si. Portanto, é importante para sincronizar o ajuste de tempo entre computador e incubadoras. </li><li> Tubos de actividade são limpos para reutilização por ebulição numa placa quente, em água desionizada. Uma pequena quantidade de detergente é adicionado para a primeira fervura, os tubos são bem enxaguados e fervido duas vezes mais. Se fio é utilizado para ligar o tubo, os tubos da actividade utilizados (contendo comida, cera de mosca, e os fios) pode ser limpo sem remoção prévia dos fios. </li></ol></li><li> Antes de se iniciar um ensaio, as culturas contendo lugar de pupa tardia encenado moscas em incubadoras de três a quatro dias para se adaptar a iluminação experimental e outras condições ambientais. Light: condições escuras ou constante têm sido comumente usado para medir o comportamento do sono. Neste exemplo, as moscas são aclimatadas à luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano sobre a resposta imune e comportamento 2,7,8. Tal como descrito na Figura 1A </strong&gt;, a carga moscas 1-4 dias de idade para a actividade DAM2 Trikinetics monitores como descrito 6, e registo durante um mínimo de três dias antes da infecção. </li></ol> 2. Moscas infectar com uma cepa patogênica de bactérias <ol><li> O protocolo aqui descrito é específico para o S. marcescens, que são fáceis de cultivar e manter. Protocolos para a armazenagem a longo prazo e as condições de cultura para outras espécies de bactérias podem variar. S. marcescens são armazenados em glicerol a 15-50% à temperatura de -80 ° C. Para preparar para a armazenagem a longo prazo, misturar 2 volumes de cultura bacteriana durante a noite (DO600 = 0,5 - 1,0) para 1 volume de glicerol a 50% autoclavada em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Isto irá resultar numa concentração final de glicerol de 17%. Armazenar os tubos a -80 ° C. Para preparar um curto prazo na utilização de fonte de bactérias, raspar o material congelado com uma ponta de pipeta estéril de 200 ul e realizar uma sequência de três vias numa placa de agar LB. Incubar a placa durante a noite a 37 &amp; dpor exemplo, C para obter colónias isoladas. Armazenar a placa a 4 ° C. Um dia antes da infecção programada, escolher uma única colónia da placa de agar LB com um ponta de pipeta estéril de 200 uL e submergir a ponta para um tubo de cultura que contém 5 ml de meio LB. Bactérias crescem durante a noite, ou até 16 horas dentro de um agitador de incubador a 37 ° C e 250 rpm até que ele atinja a fase de crescimento exponencial. Medir a concentração com um espectrofotômetro a OD 600. A concentração desta fase varia de 0,5 a 1. Se a concentração for demasiado elevada, a subcultura das bactérias e crescem durante mais várias horas, para obter uma concentração óptima. Execute o procedimento perto de uma fonte de chama. Algumas estirpes bacterianas foram concebidas para a resistência aos antibióticos e são cultivadas e seleccionadas para antibiótico apropriado adicionado ao meio. S. marcescens (ATCC # 8100) não são resistentes a antibióticos e por isso são cultivadas em meio estéril, sem antibiótico. Para verificar técnica estéril, fazer um simulado culture sem bactérias, como controlo. A solução para infectar moscas contém bactérias (diluído para 0,1 OD = 600) e coloração de alimentos a 1% (Brilliant Blue FCF) em PBS. Prepara-se uma solução de controlo de injecção por adição de quantidade equivalente de meio LB utilizado em solução infecção e corante alimentar azul a 1% em PBS. Armazenar as soluções em gelo. </li><li> Prepare agulhas de vidro para injetar as moscas. Puxe capilares de vidro (od = 1 mm, id = milímetros 0,58, WPI) para uma ponta fina usando um extrator micropipeta (Narishige). Sob um microscópio de dissecação, utilizar uma pinça fina para quebrar a ponta da agulha de modo que a abertura é grande o suficiente para encher com o líquido de injecção através da aplicação de sucção com uma seringa, mas suficientemente pequena para minimizar os danos para a mosca durante o processo de injecção. Depois de romper a ponta, o tamanho da ponta deve ser cerca de 40-50 ^ m. A agulha de vidro é ligada a uma seringa de plástico de 3 cc, com uma extensão de tubagem. O fluxo de meio de injecção é controlado manualmente a aplicação de pressão positiva ou sução com a seringa. Evitar a contaminação do tubo de borracha com o fluido de injecção, como o aparelho de seringa é utilizado tanto para a infecção e as injecções de controlo. </li><li> Anestesiar moscas, colocando-os em um bloco de CO 2. CO 2 é passado através de um recipiente selado de água para humedecer a almofada e para reduzir a electricidade estática, o que pode complicar a manipulação de moscas sobre a almofada. Injectar moscas picando a agulha de vidro na região acima do escutelo do tórax dorsal. A passagem do meio de injeção na mosca é verificada pela coloração de alimento - as moscas ficam azuis como os spreads corante alimentar através do sistema. A dose de bactérias que as moscas recebem podem ser quantificados como descrito na Seção 3, abaixo. Alguns projetos experimentais incluir um grupo controle que recebe lesão asséptica injetando moscas com coloração PBS e comida, mas sem bactérias. </li></ol> 3. Determinar a carga bacteriana Uma abordagem para evaluating a resposta imune contra a infecção bacteriana é determinar a infecção bacteriana pós carga. D. melanogaster é um excelente modelo para determinar este parâmetro, porque a mosca inteira pode ser homogeneizado para estimar o número total de bactérias dentro de um indivíduo. A lógica por trás deste protocolo é de que, quando cultivadas em meio sólido tal como caldo de Luria (LB) agar em placas de Petri (placa LB), uma única bactéria forma uma colónia visível distinguíveis. Portanto, por homogeneização moscas infectadas em meio líquido LB, gerando uma série de diluições do homogeneizado, e espalhando o homogeneizado diluído em placas de LB, o número de células bacterianas que infectam uma mosca pode ser determinada. Um grupo de controlo de moscas injectadas com PBS e corante alimentar, mas sem bactérias deve ser usada para verificar se a infecção não foi contaminada com outras espécies bacterianas. Não deve haver colónias na placa de agar LB nesta condição. <ol><li> Autoclavar todos os materiais que irão ser utilizados para estaprocedimento antes de realizar o passo de homogeneização real. Isso inclui 200 dicas Pipetar cortadas com tesoura, mídia LB, e pilões utilizados para a homogeneização. Preparar as placas vertendo meio LB / agar autoclavada em 10 centímetros placas de Petri estéreis, pelo menos, 1 dia antes da homogeneização moscas. </li><li> Anestesiar moscas e recolher em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e tubos armazenar em gelo. </li><li> Realizar a homogeneização perto de uma chama para evitar a contaminação. A homogeneização de controlo contendo moscas sem infecção é recomendada em especial quando se utiliza uma estirpe bacteriana tal como S. marcescens, que não são resistentes a antibióticos. Homogeneizar um mínimo de 2 grupos de 10 moscas cada condição experimental por. O número de moscas utilizadas por homogenato é determinado pelo experimentador. Alguns grupos utilizaram uma mosca por homogenato, o qual é útil para avaliar a variação na carga bacteriana entre moscas individuais 8, ao passo que outros autores utilizaram 3-10 moscas por homogenatoa comparação entre o genótipo ou condição experimental 9-12. <ol class="lalpha"><li> Adicionar 400 ul de meio LB a cada tubo de microcentrífuga contendo moscas e homogeneizar utilizando um pequeno motor e um pilão (Kontes). </li><li> Usando pontas de pipetas estéreis cortadas, serial diluir a 1:10 homogenado por adição de 20 ul de homogeneizado meio LB / bacteriano a 1,5 ul de tubo de microcentrifugadora contendo 180 ul de meio LB. Cortar as pontas da pipeta impede o bloqueio de detritos mosca e assegura que um volume adequado está a ser transferido. </li><li> Factor de diluição é determinado empiricamente e dependerá do genótipo da mosca, a estirpe bacteriana utilizada, e da condição experimental. Para o tipo selvagem moscas infectadas com S. marcescens, utilizar as diluições de 1:10 ou 1:10 2 3 para moscas homogeneizadas imediatamente após a infecção e, em diluições de 1:10 ou 1:10 4 5 para moscas homogeneizado 24 horas pós-infecção. </li><li> Adicionar 100 ul de LB / média bacteriana a partir do microfonetubos contendo rocentrifuge diluição final e espalhar o meio sobre uma placa de LB usando esferas de vidro (VWR) para assegurar uma distribuição uniforme. </li><li> Descartar as bolas de vidro em 100% de solução de EtOH. Colocar as placas de LB numa incubadora a 37 ° C durante a noite. </li><li> Como etapa opcional, utilizar um sistema de imagem de luz visual para obter uma imagem das placas de LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contar o número de colónias ou no prato em si ou a partir da imagem da chapa usando a ferramenta de contar com o software Photoshop (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Calcula-se o número de unidades formadoras de colónias por mosca utilizando a fórmula: [n / (N * D * v)] * V, onde n = número de colónias que cresceram na placa de LB, N = o número de moscas agrupados num tubo de microcentrífuga, D = factor de diluição, e v = volume da solução espalhada sobre cada placa; V = volume inicial do homogeneizado. </li></ol></li></ol> 4. Avaliar sono e Duração sobrevivência após infecção <ol><li> Paramoscas que não são colhidas para medir a carga bacteriana, continue monitorando o comportamento por mais 7-10 dias. Duração sobrevivência é influenciada pelo genótipo da mosca, condições ambientais e espécies de bactérias utilizadas para a infecção. </li><li> Depois de ~ 10 dias, terminar o experimento, baixar e processar dados comportamentais como descrito anteriormente 6. Insomniac2 software personalizado, que é baseado em Matlab, é usado para analisar parâmetros do sono. É importante eliminar moscas mortas da análise comportamental. Normalmente, isto restringe a análises para dentro do primeiro dia após a infecção, dependendo do tipo de infecção e do genótipo da mosca. Morte no ensaio é indicado pelo tempo de todas as contagens de actividade atingiu zero. Para facilitar a análise de sobrevivência, Drosonex, software personalizado escrito em Microsoft Visual C + + 6.0, é usada para processar arquivos de dados brutos do sistema DAM Trikinetics. Os relatórios do software como arquivos de Excel, duração sobrevivência de cada mosca (em horas), compila atividade data partir de todos os monitores em uma única planilha, e relata a sobrevivente voa por cento ao longo do tempo, conforme definido pelo usuário. Os arquivos do Excel são projetados para integrar em outros pacotes de software estatísticos para análise posterior. </li></ol> 5. Medir actividade de NFkB durante a infecção usando um ensaio de repórter de luciferase Transgenic kB-luc moscas utilizadas neste ensaio foram gerados como descrito anteriormente em Kuo et al., 2010 2. Resumidamente, o repórter kB-luc contém oito repetições de uma sequência de ligação de NFkB, que foram inseridos em um promotor a montante de um quadro de leitura aberta de luciferase. <ol><li> Ajuste moscas às condições de iluminação experimentais, como descrito na seção 1.2. Neste exemplo, 1-4 dias de idade kB-luc moscas são alojados em frascos contendo 5% de sacarose, 2% de meio de alimento agar e colocadas em luz constante (LL), durante 2 dias, para atingir a mesma idade de outras moscas durante a infecção. </li><li> Prepara-se uma microplaca de 96 poços para as moscas. Cada poço contém 2 camadas de meio de alimento (Figura 2), a camada de topo contém a luciferina, o substrato da luciferase. Adicionar 300 ul de sacarose a 5%, solução de agar a 2% a cada poço e deixa-se solidificar. Em seguida, adicionar uma camada de 50 ul de topo de cada uma das cavidades contendo sacarose a 5%, ágar a 1%, e 2 mM de luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentrações de luciferina utilizadas para a actividade repórter de medição em Drosophila têm variado na literatura, e têm sido tão baixas quanto 100 uM 13. A concentração necessária pode ser determinada empiricamente. Entre as camadas de distribuição de alimentos, cobrir a placa com um tecido de malha fina para facilitar a secagem, mantendo a esterilidade. A placa deve ser deixado secar completamente, até uma hora, a fim de evitar que as moscas de ficar presa em forma de gotas de condensação. Porque luciferina é sensível à luz, evite expor as placas à luz mais do que o necessário. </li><li> Aplique uma película adesiva (Superior-Seal-A; Perkin Elmer) a uma placa de micropoços de 96 poços e perfurada com uma agulha fina com uma quantidade de 2 orifícios por poço. Estes buracos não só permitir a troca de ar a cada poço, mas também irá fornecer uma forma de anestesiar moscas em uma base individual. Usando uma lâmina afiada e borda em linha reta, introduzir um corte entre cada coluna. Isto irá proporcionar uma forma fácil de carregar / descarregar as moscas em grupos de 8 de cada vez. Para carregar as moscas para a microplaca, retire os frascos da incubadora e moscas anestesiar sobre uma almofada de CO 2. Carga voa um por um para cada poço, coluna por coluna. Se um voar inadvertidamente ficar preso ao selo adesivo, deixar a voar sozinho como eles são capazes de libertar-se sem intervenção. Voltar a microplaca para a incubadora no LL de 8-24 horas para se ajustar ao novo ambiente e para consumir o substrato luciferina. </li><li> Cultura de bactérias, S. marcescens, e preparar uma solução para a infecção, tal como descrito acima. </li><li> Anestesiar tvoa usando uma ponta de micropipeta ligada a uma baixa pressão de linha de CO 2. Colocar a ponta da micropipeta directamente por cima dos orifícios de ventilação feitas para cada poço. Tomar cuidado para assegurar que a pressão de CO 2 é suficientemente elevada para anestesiar a mosca, mas baixa o suficiente para evitar danos à mosca. Em grupos de oito, cada mosca transferir individualmente para uma almofada de CO 2, e infectar como descrito acima. Após a infecção, o retorno de cada mosca ao seu original e feche bem a microplaca. </li><li> Luminescência medida (TopCount NXT-luminescência e Contador de Cintilação; Perkin-Elmer). O contador de luminescência TopCount contém uma cassete de empilhamento de chapas, o que permite leituras programadas e automatizadas continuamente em incrementos desejadas para qualquer período de tempo (geralmente superior a cinco dias). Este recurso não está disponível em todos os instrumentos, e coleta de dados para experimentos realizados com outros instrumentos podem, portanto, ser menos frequentes. O contador de luminescência é abrigado em um room com uma temperatura controlada e horário de iluminação. Ao carregar as placas para a cassete de empilhamento, empilhar as placas contendo as moscas claras entre placas em branco para garantir que as moscas recebem luz. Luminómetro programa de acordo com as especificações do fabricante para recolher as leituras de hora em hora durante um mínimo de 24 hr. Neste exemplo, os detectores são programados para ler cada poço por 10 seg e expressar o resultado como contagens (em unidades arbitrárias) por segundo. Este valor é a média entre 3 leituras por poço. Exportar os arquivos de dados para uma planilha e realizar uma análise padrão, gráficos os resultados de luminescência. </li></ol>

<ol><li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li>
<li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+resistance+and+the+adaptive+significance+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parasite resistance and the adaptive significance of sleep.</a> BMC Evol Biol. 9, 7(2009).</li>
<li>Imeri, L., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+%28and+why%29+the+immune+system+makes+us+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How (and why) the immune system makes us sleep.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Signaling+Protease+Required+for+Melanization+in+Drosophila+Affects+Resistance+and+Tolerance+of+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections.</a> PLoS Biol. 6, e305(2008).</li>
<li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Locomotor+Activity+to+Study+Circadian+Rhythms+and+Sleep+Parameters+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (43), e2157(2010).</li>
<li>Lee, J. E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Regulation+in+the+Ability+of+Drosophila+to+Combat+Pathogenic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections.</a> Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).</li>
<li>Stone, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 8, e1002445(2012).</li>
<li>Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+variation+in+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 183, 1477-1491 (2009).</li>
<li>Short, S. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+and+male+genetic+contributions+to+post-mating+immune+defence+in+female+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).</li>
<li>Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+sleep+and+the+immune+response+in+Drosophila%3A+a+role+for+the+NFkappaB+relish%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish.</a> Sleep. 30, 389-400 (2007).</li>
<li>Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Drosophila+immune+response+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Drosophila immune response during aging.</a> Aging Cell. 7, 225-236 (2008).</li>
<li>Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras%2FMAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li>
<li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relish%2C+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li>
<li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).</li>
<li>Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Immunity%3A+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159, 189-199 (2001).</li>
<li>Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+is+a+genetically+tractable+model+host+for+Mycobacterium+marinum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum.</a> Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).</li>
<li>Romeo, Y., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+immunity%3A+methods+for+monitoring+the+activity+of+Toll+and+Imd+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways.</a> Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).</li>
<li>Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+arm+of+the+Drosophila+innate+immune+response+requires+an+I%7Bkappa%7DB+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase.</a> Genes Dev. 15, 104-110 (2001).</li>
<li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep%3Awake+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).</li>
<li>Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep%2C+aging%2C+and+lifespan+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep, aging, and lifespan in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Allee, W. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllee%2C+WC+%22The+social+life+of+animals%22">The social life of animals</a>. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).</li>
<li>Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+circadian-regulated+elements+contribute+to+cycling+period+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila.</a> Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).</li>
<li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1(2002).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150(2009).</li>
<li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li>
<li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li>
<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Este protocolo descreve uma abordagem para investigar como o comportamento, particularmente dormir, está ligada a parâmetros de resposta do sistema imunológico. Estes parâmetros incluem a carga bacteriana, resultado da sobrevivência e actividade de NFkB, como medido por um repórter de luciferase in vivo. Juntos, esses parâmetros fornecem informações sobre o quão bem uma mosca pode lutar contra uma infecção. A carga bacteriana e os resultados de sobrevivência são parâmetros da resposta imune que envolvem uma med...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome de material </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Incubadoras </td><td> Percival Scientific, Inc. </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Qualquer incubadora capaz de executar luz programada / horários de temperatura é adequada. </td></tr><tr><td> Drosophila ATIVIDADE Monitores </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Conforme já descrito 6, este sistema requer uma interface de computador, software e outros acessórios. </td></tr><tr><td> Pirex de vidro Tubos </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> De cintilação de microplacas e contador de luminescência </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 detector </td><td> Qualquer leitor de microplacas capaz de detecção de luminescência pode ser utilizado para este tipo de ensaio de repórter. TopCount contém múltiplos detectores e um empilhador automático, que é capaz de ser programado para ler continuamente a partir de múltiplas placas. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imagem de culturas bacterianas é opcional; qualquer sistema de imagem digital com capacidade de luz visual é suficiente. </td></tr><tr><td> Micropipeta Puller </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Abastecimento </td></tr><tr><td> Borosilicato capilares de vidro </td><td> Precision Instrument Inc. mundo </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Seringa 3 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Agulhas de seringa </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - corte da ponta da agulha, para evitar danos na tubagem. </td></tr><tr><td> Tubulação do silicone, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Espessura da parede (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Utilizado para a fixação de agulhas capilares de vidro para uma seringa </td></tr><tr><td> Torneira de 3 vias </td><td> Empresa americana Pharmaseal </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pilão Motor Cordless </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pilão </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Bolas de vidro 3 milímetros </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select placas de 96 poços que são apropriados para luminescência - devem ser opacas. </td></tr><tr><td> Topseal-A Microplacas :96-bem </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplaca Press-On Film vedação adesiva </td></tr><tr><td> D-luciferina, sal de potássio </td><td> BioTechnology Gold, Inc. </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Disponíveis mediante solicitação aos autores </td><td> personalizado, escrito por Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Matlab baseado em software que tem sido utilizada rotineiramente para a análise de sono 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Disponíveis mediante solicitação aos autores </td><td> personalizado, escrito por Thomas Coradetti (Software Calçada) </td><td> Um PC MSVC6 programa utilizado para a análise de sobrevivência a partir de arquivos de dados brutos coletados com oTrikinetics sistema </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Útil para a obtenção do número de ufc / placa a partir de imagens digitais (opcional) </td></tr></tbody></table>

medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; drosophila</em

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A interacção complexa entre a resposta imune e comportamento hospedeiro tem sido descrito em uma grande variedade de espécies. Excesso de sono, em particular, é conhecida a ocorrência de uma resposta à infecção em mamíferos 1 e recentemente também tem sido descrita em Drosophila melanogaster 2. É geralmente aceite que o sono é benéfico para o hospedeiro durante a infecção, e que é importante para a manutenção de um sistema imunológico robusto 3,4. No entanto, a evidência experimental que suporta esta hipótese é limitada 4, e a função do sono em excesso durante uma resposta imune permanece obscura. Nós usamos uma abordagem multidisciplinar para resolver este problema complexo, e realizaram estudos no sistema modelo simples genética, a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Usamos um ensaio padrão para medir o comportamento locomotor e do sono em moscas, e demonstrar como este ensaio é utilizado para medir o comportamento de moscas infected com uma estirpe patogénica de bactérias. Este teste é também útil para monitorizar a duração de sobrevivência em moscas individuais durante uma infecção. Medidas adicionais de função imunitária incluem a capacidade de moscas para limpar uma infecção e à activação de NFkB, um factor de transcrição essencial, que é essencial para a resposta imune inata em Drosophila. Tanto resultado da sobrevivência e depuração bacteriana durante a infecção em conjunto são indicadores de resistência e de tolerância à infecção. Resistência se refere à capacidade de moscas para limpar uma infecção, enquanto que a tolerância é definida como a capacidade do hospedeiro para limitar os danos de uma infecção e, assim, sobrevivem apesar dos níveis elevados de agentes patogénicos no interior do sistema 5. Monitoramento em tempo real da atividade NFkB durante a infecção fornece insights sobre um mecanismo molecular de sobrevivência durante a infecção. O uso de Drosophila nestes ensaios simples facilita as análises genéticas e moleculares do sonoe a resposta imune e como estes dois sistemas complexos são reciprocamente influenciadas.

<ol><li> Infecção promove o sono. Neste exemplo, Canton-S (CS) moscas do tipo selvagem e moscas mutantes desprovidos de um gene NFkB, Relish (Rel E20) 14, foram carregados em dois DAM2 monitores de actividade (n = 32 para cada genótipo) e infectadas, como descrito acima. As moscas foram mantidas em luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano no comportamento e infecção 2,7,8. Os mutantes foram isogenized E20 Rel de CS, tal como descrito previamente 11. Amb...

Para entender uma ligação entre a resposta imune e comportamento, nós descrevemos um método para medir o comportamento locomotor em<em&gt; Drosophila</em&gt; Durante a infecção bacteriana, bem como a capacidade das moscas de montar uma resposta imune pela sobrevivência de monitorização, a carga bacteriana e, em tempo real, a actividade de um regulador chave da imunidade inata, NFkB.

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

Uma interação complexa entre a resposta imune e o comportamento do hospedeiro tem sido descrita em uma ampla gama de espécies. O sono excessivo, em particular, é conhecido...

O objetivo geral do experimento a seguir é avaliar o sono e a função imunológica em drosófila. Isso é primeiramente alcançado por meio do registro da atividade locomotora de moscas infectadas para medir o sono, e da sobrevida como segundo passo após a infecção, as moscas são homogeneizadas, diluídas e espalhadas em placas de ágar LB. O número de unidades formadoras de colônias que crescem indica a capacidade das moscas de eliminar a infecção.Em seguida, moscas infectadas que expressam um transgene contendo o repórter luciferase de NF kappa b são adicionadas a uma placa de 96 poços contendo luciferina, o substrato da luciferase. A medição em tempo real da luciferase kappa b indica a ativação de uma via de sinalização NF kappa B durante a infecção, considerando em conjunto o resultado de sobrevivência e sono. A eliminação bacteriana e a atividade do repórter NF KB são medidas que fornecem subsídios mecanicistas sobre a ligação molecular entre função imunológica e comportamento. Em geral, indivíduos novos neste método enfrentam dificuldades porque leva tempo e prática aprender a infectar manualmente as moscas com consistência. A principal vantagem da técnica com o gene repórter Lucife

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Descrevemos os procedimentos para registrar os ritmos diários de atividade locomotora...

Assaying atividade locomotora para estudar ritmos circadianos e sono Parâmetros em Drosophila</em

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para medir a carga bacteriana de E. coli após a injeção de E. coli no tórax de Drosophila melanogaster.

Medindo a carga bacteriana de E. coli em Drosophila melanogaster após infecção por E. coli

Aqui nós descrevemos um método para a medição rápida e precisa do desempenho de vôo em Drosophila, permitindo seleção de alto rendimento.

Um método melhorado para rápido e preciso de medição de desempenho em vôo<em&gt; Drosophila</em

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar a evitação de indivíduos estressados. Este paradigma é poderoso, mas fácil de usar, e pode ser usado para avaliar a influência de genes e ambiente em um tipo de interação social em Drosophila melanogaster.

Ensaio simples para Quantificação de Prevenção Social Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster é um excelente organismo modelo para estudar o sistema imunológico inato e as consequências fisiológicas de infecções e doenças. Este protocolo descreve como fornecer infecções bacterianas robustas e quantitativamente repetíveis a D. melanogaster e como medir subsequentemente a gravidade da infecção e quantificar a resposta imune do hospedeiro.

Infecção bacteriana sistêmica e Imune Defesa Phenotypes em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este relatório descreve um método para medir a atividade larval de Drosophila usando o TriKinetics Drosophila Activity Monitor. O dispositivo emprega feixes infravermelhos para detectar movimentos de até 16 animais individuais. Os dados podem ser analisados para representar parâmetros de movimento, incluindo taxas e posições dos animais dentro das câmaras de ensaio.

Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

Este protocolo descreve métodos para oralmente expor e infectar a mosca de fruta Drosophila melanogaster com patógenos bacterianos e para medir o número de bactérias infecciosas galpão após infecção do intestino. Ainda mais, descrevemos o efeito de mutantes imunes na mosca sobrevivência após infecção bacteriana oral.

Infecção bacteriana e oral Shedding em Drosophila melanogaster.

Este protocolo descreve um ensaio in vivo de fagocitose no adulto Drosophila melanogaster para quantificar o fagócito reconhecimento e apuramento das infecções microbianas.

Avaliar a resposta imune celular de mosca da fruta, Drosophila melanogaster, usando um ensaio de fagocitose em Vivo

A privação do sono é uma ferramenta poderosa para investigar a função e a regulação do sono. Descrevemos um protocolo para dormir privar Drosophila usando o Aparelho de Anulação do Sono, e determinar a extensão do sono de recuperação induzido pela privação.

O aparelho de anulação do sono: um método altamente eficiente de privação do sono Drosophila

Apresenta-se um protocolo de triagem de drogas de alto rendimento para melhorar o sono por meio do monitoramento do comportamento do sono de moscas-das-frutas em um modelo idoso de Drosophila .

Triagem de drogas de moléculas pequenas de alto rendimento para distúrbios do sono relacionados à idade usando Drosophila melanogaster

Esse protocolo fornece uma estrutura para avaliar mudanças comportamentais induzidas pelo estresse em Drosophila melanogaster. Combinar ensaios complementares permite quantificar atividade, exploração e tomada de decisão para moscas individuais. A abordagem é flexível e pode ser adaptada a uma ampla gama de estudos que investigam biologia do estresse, metabolismo e função neurocomportamental.

Fenotipagem Comportamental Multimodal de Estados Semelhantes à Depressão Induzidos pelo Estresse em Drosophila melanogaster

Aprenda a medir resposta imune e sono em Drosophila usando atividade locomotora, sobrevivência e repórter luciferase NF-κB. Este método permite analisar a relação entre função imunológica e comportamento em tempo real.

Medição quantitativa da resposta imune e do sono em

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