Do genoma deleções de genes em

O objetivo geral deste procedimento é realizar deleções de genes individuais em todo o genoma em Streptococcus sanguinis por meio de PCR de alto rendimento. Isso é realizado primeiramente obtendo-se três amplicons por amplificação PCR de alto rendimento, incluindo o gene de resistência a antibióticos, bem como as sequências de DNA upstream e downstream do gene alvo. O segundo passo é obter o amplicon recombinante linear por PCR utilizando três amplicons como modelos.

Em seguida, preparam-se as células competentes de s. sanguinis. O passo final consiste em transformar o amplicon recombinante linear obtido por PCR em células competentes de s. sanguinis. Por fim, utiliza-se amplificação por PCR do gene colon A e sequenciamento de DNA para verificar os mutantes corretos.

A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos exaustivos, como o knockout com plasmídeo suicida, é que este método pode criar mutantes com deleção em todo o genoma diretamente, utilizando alto rendimento. Os iniciadores de PCR podem ser projetados e sintetizados conforme descrito no protocolo escrito, utilizando scripts internos baseados na sequência do genoma de Streptococcus sanguineus SK36. Três conjuntos de iniciadores foram projetados para amplificação da sequência upstream de um quilobase do gene alvo, do gene ENC que codifica a proteína de resistência à anfotericina A, e da sequência downstream de um quilobase do gene alvo.

Primeres específicos para o gene. R um e F três são projetados com base nas sequências cinco prime e três prime do gene alvo para amplificar em alto rendimento a região de um quilobase upstream ou downstream dos genes s sanguine. Primeiro, monte uma mistura coquetel de PCR em gelo em um tubo cônico de 15 mililitros.

Veja o texto para os componentes da mistura de PCR contendo DNA genômico sanguíneo; transfira 23 microlitros da mistura para cada poço de uma placa de PCR de 96 poços utilizando uma pipeta multicanal. Para a sequência upstream do gene alvo, adicione um microlitro de cada iniciador F1 e R1 a partir de placas de iniciadores trabalhando a 10 micromolar à placa de PCR usando a pipeta multicanal. Faça o mesmo com os iniciadores F3 e R3 para amplificar a sequência downstream do gene alvo. Selle a placa de PCR e realize a amplificação a 94 graus Celsius por um minuto, seguido por 30 ciclos de 94 graus Celsius por 30 segundos.

54 graus Celsius por 30 segundos e 68 graus Celsius por 1,5 minuto. Após a amplificação, prepare um gel de agarose a 1% contendo brometo de etídio com 48 poços adequados para carregamento com pipeta multicanal. Misture quatro microlitros do produto de PCR com um microlitro de tampão de carregamento de DNA 5X.

Em uma placa de 96 poços, carregue as amostras em um gel de agarose utilizando pipetas multicanais de 10 microlitros. Realize a eletroforese a 135 volts por 30 minutos. Examine a banda no gel sob um sistema de documentação e análise UVP.

Purifique os produtos de PCR utilizando o kit de purificação PCR Pure Link 96 com centrifugação, conforme as instruções do fabricante para eluir o DNA. Adicione 40 microlitros de água estéril bidestilada a cada poço da placa de ligação. Escolha aleatoriamente vários amplicons purificados na placa para examinar as concentrações de DNA.

Usando um espectrofotômetro NanoDrop, ajuste a concentração de amplicons na placa para aproximadamente 10 nanogramas por microlitro. Em seguida, use o eco R one para digerir um plasmídeo contendo a resistência à canamicina gisette, de modo que possa servir como modelo para PCR. Purifique o plasmídeo digerido utilizando o kit de purificação PCR kayak quick e ajuste o DNA do plasmídeo linearizado para uma concentração final de DNA de 10 nanogramas por microlitro.

Monte uma mistura de PCR de 25 microlitros para o amplicon do cassete de resistência à canamicina, incluindo os primers F dois e R dois conforme listado no procedimento escrito. Acompanhando este vídeo, prossiga para realizar a amplificação por PCR conforme instruído aqui. Para analisar o produto da PCR, realize eletroforese em gel em um gel de agarose 1%.

Em seguida, reúna um lote dos amplicons do cassete de resistência a canamicina provenientes de 10 indivíduos purificados por PCR. Ajuste a concentração dos amplicons para 10 nanogramas por microlitro. O aspecto mais difícil deste procedimento é obter o PCR final linearmente competente a partir de seus três amplicons de PCR.

Para garantir o sucesso, os três iniciadores de PCR são ajustados a quantidades quase iguais. Combine um microlitro de cada um dos três iniciadores de PCR a 10 nanogramas por microlitro em uma placa de PCR, bem como o molde de PCR. Em seguida, prepare a mistura de PCR, incluindo os primers F1 e R3 conforme listados no procedimento escrito.

Em seguida, realize a amplificação por PCR das amostras. Examine os AMPLICONS DE PCR em um gel de agarose após a purificação e quantificação dos amplicons de PCR. Como antes, congele os amplicons de PCR recombinados a menos vinte graus Celsius.

Para começar, prepare o meio Todd Hewitt e soro de cavalo conforme instruído no procedimento escrito que acompanha este vídeo; alíquotas de dois mililitros e 10 mililitros de meio em dois tubos cónicos de 15 mililitros. Inocule cinco microlitros de cultura estoque de S. sanguinis SK36 descongelada, previamente congelada a -80 graus Celsius, em dois mililitros de meio. Incube a cultura bem fechada durante a noite a 37 graus Celsius.

Além disso, pré-incube o tubo de meio de 10 mililitros sob as mesmas condições após incubação durante a noite. Transfira 50 microlitros da cultura para o tubo de meio de 10 mililitros. Incube o tubo a 37 graus Celsius por três horas.

Imediatamente após a incubação, adicione dois microlitros de 70 nanogramas do peptídeo estimulador da competência sanguineous, SK 36, e dois microlitros do amplicon recombinante linear de PCR a tubos einor em uma placa de 96 poços e pré-aqueça-os a 37 graus Celsius. Transfira 330 microlitros da cultura de SK 36 incubada por três horas para cada tubo. Substitua o DNA por água estéril bidestilada como controle.

Incube os tubos a 37 graus Celsius por uma hora após a incubação. Coloque o bloco sobre gelo e espalhe 100 microlitros de cada transformação em placas de ágar infusão cérebro-coracão ou BHI com 500 microgramas por mililitro de canamicina. Incube as placas a 37 graus Celsius por dois dias em condições microaeróbias. Para cada mutante de substituição, escolha aleatoriamente duas colônias individuais e inocule cada colônia em cinco mililitros de BHI contendo 500 microgramas por mililitro de canamicina. Incube cada inóculo durante a noite a 37 graus Celsius em condições microanaeróbias.

Criopreservar cada cultura em glicerol a 30% a menos 80 graus Celsius. Para verificar se o mutante contém a substituição gênica esperada, realizar PCR de colônia para cada mutante utilizando os primers F1 e R3 em uma placa de PCR de 96 poços.

Utilize cerca de um microlitro de cultura de crescimento prolongado de cada colônia individual como molde de DNA em uma reação de amplificação por PCR de 25 microlitros. Prossiga com a amplificação por PCR para confirmar a substituição do gene mutante, identificando com precisão mutantes com duas bandas ou amplicons contaminantes. Analise o amplicon de PCR por eletroforese em gel durante quatro horas em um gel com mais de 12 centímetros de comprimento.

Gel de agarose a 2% com coloração por brometo de etídio sob esta condição de eletroforese em gel de agarose. Qualquer amplicon com diferença maior ou igual a 100 pares de bases pode ser claramente identificado. Alternativamente, quando as bandas resultantes da amplificação do cassete de resistência à canamicina e do gene selvagem forem esperadas diferir em menos de 100 pares de bases, utilize um iniciador interno T um do gene alvo para determinar se o gene selvagem pode ser detectado por PCR.

Para confirmar ainda mais a deleção, purifique os amplicons com o kit de purificação de PCR Pure Link 96 e faça o sequenciamento utilizando o iniciador P um, que se liga ao cassete de resistência à canamicina, mantendo apenas os mutantes corretos confirmados por sequenciamento após amplificação por PCR utilizando os iniciadores F1 e R um para a sequência a montante e F três e R três para a sequência a jusante. Aproximadamente um quilobase a montante e a jusante de cada gene de s. sanguinis foi obtida no formato de 96 poços sob as condições de PCR e utilizando os iniciadores projetados.

Um produto específico foi amplificado a partir do DNA genômico de s sanguineus em cada reação de PCR, o que indicou que os iniciadores foram altamente específicos aos alvos de s sanguineus por meio da reamplificação PCR utilizando os iniciadores F1 e R3 e três amplicons como modelos de DNA. Construtos de PCR recombinante linear foram criados com alto rendimento. Em uma placa de 96 poços composta por uma região a montante de cada gene alvo, um cassete cany e uma região a jusante de cada gene alvo, nessa ordem, os construtos de PCR recombinante foram então transformados em s sanguineus SK36 e selecionados por cany em placas de ágar BHI.

Na maioria das transformações, foram obtidas mais de 1000 colônias em cada placa após uma incubação microaerófila de dois dias. Quando essas colônias foram amplificadas por PCR utilizando os primers F1 e R3, uma única banda de DNA correspondente ao tamanho esperado do mutante foi observada por eletroforese em gel ao tentar deletar genes potencialmente essenciais. Nenhuma colônia deve ser obtida na maioria das transformações ao deletar certos genes essenciais.

No entanto, colônias ainda foram obtidas após a transformação, e após a amplificação por PCR dessas colônias usando os iniciadores F1 e R, duas bandas de DNA 2D correspondentes aos tamanhos esperados do mutante e do tipo selvagem apareceram, conforme revelado pela eletroforese em gel. Para alguns mutantes, o tamanho esperado do mutante e o tamanho do tipo selvagem do amplicon de PCR eram muito próximos para serem separados por gel de agarose longo. Nesse caso, um iniciador interno T1 do gene alvo foi projetado com base na sequência do gene do tipo selvagem.

A PCR foi realizada utilizando o primer interno T um e o primer F1. O tipo selvagem SK 36 foi usado como controle positivo para esta PCR. Se uma banda com o tamanho esperado foi amplificada do mutante utilizando o primer interno, o gene foi identificado como um gene essencial.

Como a presença do cassete de canamicina no mutante foi confirmada anteriormente por sequenciamento de DNA utilizando o iniciador P um. Com base neste protocolo, foram coletados 2048 mutantes de genes não essenciais de S. sanguineus. Excluindo os quatro quadros de leitura aberta contidos inteiramente dentro de outros quadros de leitura aberta.

218 genes, que são essenciais para a sobrevivência de s sanguine, foram identificados sob as condições experimentais. Após assistir a esses vídeos, acredito que você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a análise em todo o genoma. As detecções gênicas utilizam PCR de alto rendimento.