Name: Do genoma deleções de genes em Streptococcus sanguinis Por PCR de Alto Rendimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Aprenda a criar deleções genômicas de genes em Streptococcus sanguinis usando PCR de alto rendimento. Este método permite estudos funcionais genéticos em bactérias com eficiência superior.

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Este trabalho foi financiado por doações R01DE018138 dos Institutos Nacionais de Saúde (PX) e, em parte, pela Virginia Commonwealth University Programa de Incentivo à Pesquisa Presidencial (PRIP) 144602-3 (PX). Agradecemos os drs. Lei Chen, Yuetan Dou e Xiaojing Wang para ajudar com a construção de mutantes do genoma de largura. Agradecemos também o Core Facility DNA da Virginia Commonwealth University de sequenciamento de DNA.

1. Projeto Primer <ol><li> Os iniciadores são concebidos utilizando em scripts casa baseada na S. sanguinis seqüência do genoma SK36. Três conjuntos de primers, F1/R1, F2/R2 e F3/R3 foram concebidos para amplificação da 1-kb de sequência a montante do gene alvo, a APHA-3 gene que codifica a resistência à canamicina (Km r) da proteína 3 e do 1 -kb de sequência a jusante do gene alvo, respectivamente (Figura 1). Entre estes iniciadores, F1 e R3 são concebidos utilizando ePrimer3 na suite de programas EMBOSS ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) para amplificar as regiões que flanqueiam a montante ou a jusante do alvo gene. Iniciadores específicos do gene, R1 e F3, foram concebidos com base na extremidade 5 &#39;e 3&#39; as sequências do gene-alvo. Primers R1 e F3 contêm sequências de 25 pb adaptador no seu final 5 &#39;que são complementares a APHA-3gene. As temperaturas de fusão de cada um dos iniciadores foram concebidos para serem tão próximo quanto possível de 60 ° C para permitir a utilização de uma temperatura uniforme do recozimento para todas as reacções de PCR em formato de 96 poços. </li><li> F1, R1, R3, F3 e iniciadores são sintetizados em placas de 96 poços com base em uma ordem de genes. Cada placa contém um tipo de iniciadores na ordem mesmo gene. Diluir os primers em placa de 96 poços de primer de trabalho para uma concentração final de 10 uM para a amplificação por PCR, utilizando uma pipeta multicanal. </li></ol> 2. High-throughput Amplificação por PCR e Purificação <ol><li> Para alto rendimento amplificar 1-kb a montante ou a jusante do alvo S. genes sanguinis, montar uma mistura cocktail de PCR em gelo, num tubo cónico de 15 ml contendo 1640 uL DDH 2 O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul de 10 mM de mistura dNTP, 100 ul de 50 mM de MgSO4, 100 ul de 10 ng / ul S. sanguinis DNA genómico SK36 e 10 ul Platinum Taq DNA polimetilmetacrilatorase de alta fidelidade e transferência de 23 uL da mistura para cada poço na placa de 96 poços de PCR, utilizando uma pipeta multicanal. Transferir 1 ul de cada F1 e R1 (ou F3 e R3), a partir das placas de 10 uM de iniciadores úteis para a placa de PCR, utilizando uma pipeta multicanal. Selar a placa de PCR e amplificação de realizar a 94 ° C durante 1 min, e 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 54 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 1,5 min. </li><li> Prepare 1% de gel de agarose contendo brometo de etídio com 48 poços de carregamento pipeta multicanal encaixe. Mix 4 uL do produto de PCR com 1 ul de tampão de carga 5xDNA em placa de 96 poços e carregar as amostras em gel de agarose utilizando uma pipeta multicanal de 10 jil. Executar a electroforese a 135 V durante 30 min. Examine a banda em gel sob UVP documentação e sistema de análise. </li><li> Purifica-se o produto de PCR por PureLink kit de purificação de PCR utilizando 96 de centrifugação de acordo com as instruções do fabricante. Para a eluição de DNA, adicionar 40 ul estéril DDH 2 O para o bem da binding placa. </li><li> Escolher aleatoriamente vários amplicons na placa para examinar as concentrações de ADN, utilizando espectrofotometria NanoDrop. Ajustar a concentração de amplicons na placa de ~ 10 ng / ul. </li><li> Um plasmídeo contendo km cassete r é digerido com EcoR I como molde de PCR. O plasmídeo digerido é purificado através de kit de purificação PCR QIAquick e o DNA linear do plasmídeo é ajustada para a concentração final de ADN de 10 ng / ul. Montar 25 ul de mistura de amplicon km cassete incluindo r 16,4 ul DDH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM mistura de dNTP, 1 ul de 50 mM Mg SO 4, 1 ul de 10 mM F2, 1 ul de 10 R2 ^ M, 1 ul de DNA linear do plasmídeo e 0,1 ul de Platinum Taq DNA polimerase de alta fidelidade. Realização da amplificação de PCR a 94 ° C durante 1 min, e 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 1 min. Examinar o produto de PCR por electroforese em gel de agarose a 1%. Poola maior parte do fragmento amplificado cassete km r desde 10 indivíduo PCR purificado por QIAquick kit de purificação de PCR. Ajustar a concentração de amplicon de 10 ng / ul. </li><li> Para obter a última linear amplicon de PCR recombinante, três amplicons de PCR são combinados uns com os uL 1 (em quantidades aproximadamente iguais-molar) em uma placa de PCR bem como o modelo de PCR. Outros componentes de PCR é adicionado 14,4 ul incluindo DDH 2 O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de mistura de dNTP, 1 ul de 50 mM Mg SO 4, 1 ul de 10 mM de F1, 1 ul de 10 R3 ^ M, 0,1 ul de Platinum Taq DNA polimerase de alta fidelidade. A amplificação por PCR é realizada a 94 ° C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos a 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 3,5 min, e finalmente 68 ° C durante 4 min. </li><li> Examinar o amplicons PCR em gel de agarose. Purificar e quantificar os produtos de amplificação por PCR como descrito acima. Congelar os amplicons de PCR recombinados a -20 ° C. </li></ol> 3. ComPreparação Células competente <ol><li> Caldo Todd Hewitt é preparado, pH ajustado para 7,6 utilizando NaOH 10 N, aquecida à ebulição e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente e esterilizada utilizando poliestireno 0,22 uM de filtro 4. Adicionar 300 ul de cavalo inactivado pelo calor soro (concentração final de 2,5%) a 11,7 ml de caldo Todd Hewitt a 15 ml tubo cónico para compensar TH + HS médio. TH alíquota + HS médio em 2 ml e de 10 ml em tubos. </li><li> Inocular 5 ul de estoque S. sanguinis SK36 congelado a -80 ° C em 2 ml de meio HT + HS e incubar a cultura durante a noite com capeamento hermeticamente, a 37 ° C, acompanhado por pré-incubação a 10 ml + TH-tubo HS. </li><li> Depois de uma noite, transferir 50 ul da cultura em 10 ml de TH + HS e incubar o tubo a 37 ° C durante 3 h (correspondente a OD 660 de 0,07-0,08), imediatamente utilizando para a transformação. </li></ol> 4. Transformação de células e selecção de antibióticos <ol><li> Adicionam-se 2 jil de 70 ng S. sanguinis SK36 competênciatência peptídeo estimulante (CSP) e 2 ul de PCR recombinante linear amplicon (~ 50 ng) para tubos Eppendorf com 96 poços de bloco e pré-aquecê-los a 37 ° C. Transferir 330 uL de 3 hr-incubada SK36 cultura em cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 1 h. Substitua DNA com estéril DDH 2 O como controle. </li><li> Colocar o bloco de gelo e espalhar 100 ul de cada transformação em infusão de cérebro e coração (BHI) em placa de ágar com 500 ug / ml de canamicina. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 d em condições de microaerofilia. </li></ol> 5. Confirmação mutante e Armazenamento <ol><li> Para cada mutante de substituição, aleatoriamente pegar 2 colónias individuais, inocular a colónia em 5 ml de BHI contendo 500 ug / ml de canamicina e incubadas durante a noite o inoculo microaerobically a 37 ° C. Criopreservar cada cultura em glicerol a 30% à temperatura de -80 ° C </li><li> Para examinar se o mutante contendo o gene de substituição previsto, executar colónia PCR para cada mutante utilizando F1 e R3primers em placa de 96 poços PCR. Cerca de cultura 1-ul durante a noite a partir de colónias individuais é utilizado como o molde de ADN de 25-ul de reacção de amplificação por PCR. A PCR é realizada a 94 ° C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 3,5 min, e finalmente 68 ° C durante 4 min. </li><li> Para identificar precisamente banda dupla mutantes ou amplicon PCR contaminante, examine o amplicon de PCR por eletroforese durante 4 h em&gt; 12 cm de comprimento de 2% em gel de agarose com brometo de etídio coloração. Sob esta condição eletroforese em gel de agarose, os fragmentos amplificados com uma diferença de ≥ 100 pb foram claramente identificadas. Quando as bandas resultantes da amplificação da cassete de Km e r o gene do tipo selvagem são antecipados para diferir &lt;100 bp, um iniciador interno T1 é usado para determinar se um gene de tipo selvagem pode ser detectada por PCR. </li><li> Para confirmar ainda mais a eliminação, os amplicons são purificados por PureLink kit de purificação de PCR 96 e sequenciado utilizando o iniciador P1 queliga-se a cassete de r Km. Mantenha apenas os mutantes corretas confirmados por seqüenciamento. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Para minimizar os possíveis efeitos polares da substituição de um gene-alvo com antibióticos gene exógeno em genes vizinhos, duas medidas são tomadas enquanto cartilha inicial de projeto. Para a maioria dos genes deletados, o R1 e F3 primers são concebidos para eliminar a região codificadora de 6 pb a seguir ao codão de iniciação para 30 pb antes do codão de paragem. Os últimos 30 pares de base são mantidas para proteger local potencial de ligação ribossomal usado por um gene adjacente a jusante. A região retido entre d...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nomes</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalog #</strong</td&gt;<td<strong&gt; Comentários (opcional)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; R2 Primer</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2P</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P1 Primer</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P2 Primer</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Sequência: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNA Polymerase</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc.</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt; Enzima de restrição</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; American Bioanalytical</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarose</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain Heart Infusion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Horse soro</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Horse soro</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Km</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Canamicina</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH caldo</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Caldo Todd Hewitt</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; 96 PureLink kit de purificação PCR</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; Kit de purificação PCR QIAquick</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtro</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; Filtro de 0,22 uM poliestireno</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sistema Anoxomat</td&gt;<td&gt; Mart Microbiologia bv</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Centrífuga de bancada</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT Além disso microplaca rotor</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Documentação Gel</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubadora</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet de Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet de Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrífuga</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrífuga 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pipetas Multicanal</td&gt;<td&gt; Thermo scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermal Cycler</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc.</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

do genoma deleções de genes em<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; por pcr de alto rendimento

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagênese e único gene exclusão são dois métodos aplicados no genoma nocaute de genes em 1,2 bactérias. Embora mutagénese transposon é menos demorado, menos dispendiosa, e não requer informação sobre o genoma completo, existem dois pontos fracos neste método: (1) a possibilidade de um mutantes diferentes na biblioteca misto mutante que contra-selecciona mutantes com competição reduzida; e (2) a possibilidade de inactivação parcial do gene por meio de que os genes não perder completamente a sua função após a inserção de um transposão. Single-gene análise de deleção pode compensar os inconvenientes associados com a mutagénese transposon. Para melhorar a eficiência do genoma deleção do gene único, tentamos estabelecer uma técnica de alto rendimento para o genoma de deleção do gene único usando Streptococcus sanguinis como um organismo modelo. Cada deleção do gene construir em S. sanguinis genoma foi concebido para incluir uma-Kb a montante do gene alvo, o gene APHA-3, a proteína que codifica a resistência à canamicina, e 1-kb a jusante do gene alvo. Três conjuntos de primers F1/R1, F2/R2 e F3/R3, respectivamente, foram concebidos e sintetizados de um formato de placa de 96 poços para amplificações por PCR destes três componentes de cada apagamento construir. Primers R1 e F3 conter 25-bp sequências que são complementares a regiões do gene APHA-3 no fim do seu 5 &#39;. Uma larga escala de amplificação por PCR do gene-3 APHA é executada uma vez para criar todas as construções de deleção de um único gene. O promotor do gene APHA-3 é inicialmente excluídos para minimizar o potencial efeito polar da cassete de canamicina. Para criar as construções de deleção de genes, de alto rendimento e de amplificação por PCR de purificação são realizados num formato de placa de 96 poços. Um fragmento amplificado de PCR recombinante linear para cada deleção do gene será composto por quatro reacções de PCR utilizando polimerase de alta fidelidade de ADN. O expon inicialfase de crescimento cial de S. sanguinis cultivados em caldo Todd Hewitt suplementado com soro de cavalo a 2,5% inactivado é utilizada para aumentar a capacidade para a transformação de PCR-recombinantes construtos. Sob esta condição, até 20% de S. As células podem ser transformadas sanguinis usando ~ 50 ng de DNA. Com base nesta abordagem, 2.048 mutantes com um único gene de exclusão foram finalmente obtidos a partir dos genes de S. 2270 sanguinis excluindo quatro ORFs de genes contido inteiramente dentro ORFs outros S. sanguinis SK36 e 218 potenciais genes essenciais. A técnica na criação de construções de deleção do gene é de alto rendimento e poderia ser fácil de usar em eliminações do genoma de um único gene para todas as bactérias transformáveis.

Após amplificação por PCR, utilizando iniciadores F1 e R1, R3 e F3 e, aproximadamente, 1 kb a montante e a jusante de cada um S. sanguinis gene foram obtidos em formato de 96 poços, respectivamente (Figura 2A). Sob as nossas condições de PCR e utilizando os iniciadores desenhados, um produto específico foi amplificado a partir de S. sanguinis ADN genómico em cada reacção de PCR. Este resultado indicou os primers foram altamente específico para as metas de S. sanguinis. Através...

Um eficiente do genoma método única mutação genética foi estabelecida utilizando<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Como um organismo modelo. Este método tem alcançado via PCRs recombinantes de alto rendimento e transformações.

Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

A mutagênese por transposon e a deleção de gene único são dois métodos aplicados no nocaute gênico em todo o genoma em bactérias 1,2. Embora a mutagênese por transposon seja...

O objetivo geral deste procedimento é realizar deleções de genes individuais em todo o genoma em Streptococcus sanguinis por meio de PCR de alto rendimento. Isso é realizado primeiramente obtendo-se três amplicons por amplificação PCR de alto rendimento, incluindo o gene de resistência a antibióticos, bem como as sequências de DNA upstream e downstream do gene alvo. O segundo passo é obter o amplicon recombinante linear por PCR utilizando três amplicons como modelos.Em seguida, preparam-se as células competentes de s. sanguinis. O passo final consiste em transformar o amplicon recombinante linear obtido por PCR em células competentes de s. sanguinis. Por fim, utiliza-se amplificação por PCR do gene colon A e sequenciamento de DNA para verificar os mutantes corretos.A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos exaustivos, como o knockout com plasmídeo suicida, é que este método pode criar mutantes com deleção em todo o genoma diretamente, utilizando alto rendimento. Os iniciadores de PCR podem ser projetados e sintetizados conforme descrito no protocolo escrito, utilizando scripts internos baseados na sequência do genoma de Streptococcus sanguineus SK36. Três

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Biologia

Sistemáticas e em grande escala genético sintético telas (gene-gene ou epistasia) interação pode ser usado para explorar a redundância genética e via de cross-talk. Aqui, descrevemos um alto rendimento quantitativo tecnologia de rastreamento genético sintético matriz, denominada eSGA que desenvolvemos para a elucidação de relações epistáticos e explorar redes de interação genéticos...

Mapeamento bacterianas redes funcionais e vias<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Usando sintéticos matrizes genéticas

O método permite que o monstro verde montagem rápida de exclusões múltiplas marcados com um gene que codifica a proteína verde fluorescente repórter. Este método baseia-se em estirpes de levedura de condução através de ciclos repetidos de sortimento sexual de deleções e fluorescência baseada enriquecimento de células que transportem mais deleções.

O Processo de monstro verde para a Geração de linhagens de levedura de transporte deleções de genes múltiplos

Fonte: Tomás, J. M., et al. Geração de mutantes nulos para elucidar o papel das glicosiltransferases bacterianas na motilidade bacteriana. J. Vis. Exp. (2022).Este vídeo demonstra a amplificação dependente do iniciador de um plasmídeo suicida em E. coli. O plasmídeo, que carrega um gene de resistência a antibióticos, se replica apenas na presença de uma proteína iniciadora codificada pelo hospedeiro. Após eletroporação e incubação em meio de recuperação, a mistura é semeada em ágar contendo...

Amplificação de um plasmídeo suicida em um hospedeiro bacteriano

CRISPR/Cas9 é um sistema robusto para produzir ruptura de genes e elementos genéticos. Aqui descrevemos um protocolo para a criação eficiente de deleções genômicas em linhagens celulares de mamíferos usando CRISPR/Cas9.

Geração de Genomic Eliminações em linhas celulares de mamíferos através CRISPR / Cas9

A validação experimental da atividade do intensificador é melhor abordada pela análise de perda de função. Apresentado aqui é um protocolo eficiente que usa deleção mediada por CRISPR / Cas9 para estudar a regulação específica do alelo da transcrição gênica em células F1 ES que contêm um genoma híbrido (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Gerando CRISPR / Cas9 Mediated monoalélicos Eliminações para estudar a função Enhancer em células-tronco embrionárias de camundongos

Este manuscrito descreve um ensaio de PCR digital duplex que pode ser utilizado para quantificar simultaneamente Enterococcus spp. E os marcadores genéticos HF183 como indicadores de contaminação fecal humana em geral e associada-em águas de recreio.

Um ensaio de PCR Duplex Digital para a simultânea Quantificação da<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ea Human Fecal-associado HF183 marcador no Waters

Nós descrevemos um método fácil, rápido e relativamente barato para a geração de gene-interrompeu Streptococcus mutans cepas; Esta técnica pode ser adaptada para a geração de linhagens gene-interrompido de várias espécies.

Geração de um Gene-interrompeu Streptococcus mutans estirpe sem Gene clonagem

Aqui nós apresentamos um protocolo para o uso de construções de exclusão de resistência aos antibióticos-gaveta pré-existente, como uma base para a tomada de mutantes de exclusão em outras estirpes de Escherichia coli . Tais mutações de exclusão podem ser mobilizadas e inseridas o locus correspondente de uma estirpe de destinatário usando transdução de bacteriófago P1.

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Descrito aqui é um método simples para a purificação de um produto genético em Streptococcus mutans. Esta técnica pode ser vantajosa na purificação de proteínas, especialmente proteínas de membrana e proteínas de massa molecular elevada, podendo ser utilizada com várias outras espécies bacterianas.

Purificação de uma proteína de massa molecular elevada em Streptococcus mutans

Descrito aqui é um método para exclusão genética direcionada e sem marcadores em Chlamydia trachomatis usando mutgênese de troca de floxed, FLAEM.

Exclusão genética sem marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagênese em Chlamydia trachomatis

Aqui, descrevemos a construção de mutantes nulos de Aeromonas em glicosyltransferases específicas ou regiões contendo glicosyltransferases, os ensaios de motilidade e a purificação de flagela realizadas para estabelecer o envolvimento e função de suas enzimas codificadas na biossíntese de um glicano, bem como o papel deste glicano em patógenos bacterianos.

Geração de Mutantes Nulos para Elucidar o Papel das Glicosyltransferases Bacterianas na Motilidade Bacteriana

Aprenda a criar deleções genômicas de genes em Streptococcus sanguinis usando PCR de alto rendimento. Este método permite estudos funcionais genéticos em bactérias com eficiência superior.

Do genoma deleções de genes em

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