Name: Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Aprenda a cultivar mucosa intestinal humana com estimulação polarizada por 24-36 horas. Este método preserva a polaridade tecidual e permite análise simultânea de até 20 condições para estudo de respostas imunes.

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Agradecemos Erika Mileti para excelente suporte técnico e Dr. Antonio Di Sabatino para fornecer as câmaras de oxigênio. Financiamento: Este trabalho foi financiado por doações do sétimo programa-quadro da UE (IBDase, ERC: Dendroworld) e Fundação Cariplo para MR e suporte por um Curie rede de mobilidade internacional de formação Marie (Cross-Talk, subvenção No: 21553-2) para KT.

1. Obtenção e Preparação do tecido <ol><li> Tissue (saudável ou IBD mucosa) é obtido durante a cirurgia. Quando a amostra é excisada transferência para o laboratório, logo que possível, mantendo-o em Ca + + / Mg + + tampão HBSS suplementado com Pen / Strep a 4 ° C ou sobre gelo. </li></ol> * O tamanho da amostra depende da disponibilidade do tecido: a parte do tecido obtido, é que não é estritamente necessária para o diagnóstico e pode variar bastante entre indivíduos saudáveis ​​e IBD. Tecido sadio é retirado de pacientes submetidos à cirurgia de câncer de cólon. <ol start="2"><li> Lave o tecido com cuidado e limpe-o de todo o material mesentérica. Separa-se a camada mucosa a partir da submucosa utilizando tesouras e pinças esterilizadas, mantendo o tecido em tampão HBSS numa placa de Petri (não necessariamente imersas). Tocar a superfície da mucosa com a pinça tão pouco quanto possível. </li><li> Corte mucosa em listras pelo menos um cm de largura e tanto tempo quanto possível. Utilize dois bisturis estéreis, tanto quanto se estivesse cortando seu alimento. </li><li> Lavar limpar suavemente mucosa em HBSS e estendê-la numa placa de Petri, com o lado apical voltada para cima. </li></ol> 2. Montagem do Tissue <ol><li> Prepare meio fresco (tisDMEM). Use DMEM suplementado com glutamina (2 mM) e de NaPyr (1 mM), e adicionar 15% de FBS-Na (Fetal Bovine Serum - norte-americana), 1% de ITS-X e de 200 ng / ml de EGF, no momento da utilização. </li><li> Encha de 10 cm de uma placa de Petri com o resto da SBF-Na (cerca de 30 ml de utilizar de modo a que as redes de metal será completamente submersa) e submergir as grelhas de metal. Mantenha a placa de abrir e apoiar os cilindros de plástico em sua torneira. </li></ol> * As grades de metal são feitos de ferro. A malha é de forma quadrada com um lado de 0,5 mm. <ol start="3"><li> Aqui 3 ul de cola cirúrgica com uma pipeta de 10 ou 20 ul. Aplique-o cuidadosamente a uma das fronteiras de um cilindro de plástico, mantendo-fIRM com a pinça. </li><li> Suavemente colocar o cilindro no lado apical da mucosa, tal como próximo de uma das bordas da tira possível. </li><li> Para se obter o tempo de cola para fixar firmemente o cilindro sobre o tecido, se preparar a placa de cultura de órgãos de centro bem: Pipetar 850 mL-1 ul do meio no centro do poço e apoiar a grade de metal nas bordas da cavidade central da placa. </li><li> Corte o excesso de tecido das bordas do cilindro usando dois bisturis estéreis como antes. </li><li> Suavemente levantar o cilindro com o tecido ligado e colocar o lado basolateral da grelha de metal no centro do prato. </li></ol> 3. Estimulação <ol><li> Use os estímulos de sua escolha em sua concentração preferido. </li><li> Aplicar volume apropriado no centro do cilindro de plástico, sem perturbar o cilindro ou a superfície da mucosa com a ponta da pipeta. Verifique se o seu volume de escolhido cobre uniformemente a superfície interna do cilindro. Emvolumes dicated: Cilindro de plástico grande: 200 ul Médio plástico do cilindro: 100 mL Cilindro de plástico de pequeno porte: 50 ul </li><li> Incubar por até 3 horas em uma incubadora convencional. </li></ol> * Se você deseja incubar por momentos mais longos, certifique-se de usar um volume muito menor de estímulos (10-20 mL) e coloque diretamente no tecido em uma atmosfera de 100% O 2 na pressão de 1 atm (ver 3.5) . <ol start="4"><li> Tome o meio com os estímulos fora da superfície apical do tecido e não substitui com meio fresco, porque o tecido não se cansa O 2 se uma espessa camada de meio na face apical impede a troca gasosa. Cubra o prato. </li><li> Colocar o tecido numa atmosfera de 100% de O2 na pressão de 1 atm. </li></ol> 4. Colheita <ol><li> Depois de 24 horas de tempo de cultivo total (± 2,5 hr) retire cuidadosamente o cilindro a partir de diade tecido e com a ajuda de um escalpelo cola raspando suavemente e armazená-lo em função da análise desejada (corrigir para imuno-histoquímica e / ou ensaios de imunofluorescência, encaixe ou por congelamento em N2 líquido para purificação de RNA e de perfis de expressão de genes ou a purificação de proteínas e ensaios de Western blot ). </li><li> Colha o meio basolateral para o perfil de secreção de citocinas. Centrifugar a 8000 rpm durante 7 min para detritos da pelota, transferir o sobrenadante num tubo Eppendorf (alternativamente aliquota) imediatamente e armazenar a -20 ° C. </li></ol> * Se você quiser manter sobrenadantes por mais tempo, armazená-los à temperatura de -80 ° C.

<ol><li>Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+response+of+human+intestinal+mucosa+to+enteropathogenic+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection.</a> Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. , (2012).</li>
<li>Tsilingiri, K., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Should+probiotics+be+tested+on+ex+vivo+organ+culture+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?</a> Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).</li>
<li>Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+immunomodulatory+properties+of+three+probiotic+strains+of+Lactobacilli+using+complex+culture+systems%3A+prediction+for+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy.</a> PLoS One. 4, e7056(2009).</li>
<li>Cencic, A., Langerholc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cell+models+of+the+gut+and+their+applications+in+food+microbiology--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review.</a> Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).</li>
<li>te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+current+practice+in+murine+TNBS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).</li>
<li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J. Anat. 134, 459-469 (1982).</li>
<li>Browning, T. H., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+of+mucosal+biopsies+of+human+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine.</a> J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).</li>
<li>Besselink, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+prophylaxis+in+predicted+severe+acute+pancreatitis%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 371, 651-659 (2008).</li>
<li>Lakhdari, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+NF-kappaB+modulation+capabilities+within+human+intestinal+commensal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A necessidade de modelos fisiologicamente relevantes em que os tratamentos para mucosa intestinal humana pode ser validamente testados tem sido enfatizada. Muitos pesquisadores têm identificado potenciais artefatos e defeitos tanto na célula 5 e 6 modelos de mouse usado até agora para esse fim. Na verdade, mesmo que os dados pré-clínicos promissores é muitas vezes obtido, estes raramente se traduzem em benefícios clínicos significativos. O método descrito neste trabalho...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagentes&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Eurocalne</td><td>ECM4006XL</td><td></td></tr><tr><td>Peni/Strepto</td><td>Lonza</td><td>DE17602E</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12614</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Na</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X 100X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-bio</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE17605E</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NaPyr</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materiais&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cilindros de clonagem 6x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>Cilindros de clonagem 8x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-0080</td><td></td></tr><tr><td>Cilindros de clonagem 10x10 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-01010</td><td></td></tr><tr><td>Grades metálicas</td><td>Produzido no local</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de órgãos com poço central</td><td>BD Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Cola cirúrgica (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Potes de oxigênio</td><td>Produzido no local</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Botijões de oxigênio</td><td>Air Liquid Sanit&amp;#224;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

um novo método para a cultura e polarizada estimulação dos humanos explantes mucosa intestinal

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Existem poucos modelos atualmente para simular realisticamente micro-ambiente do complexo do intestino humano, onde uma variedade de interações ocorrem. Homeostase adequada depende directamente estas interacções, visto que todo modelar uma resposta imunológica induzir tolerância contra os antigénios dos alimentos, enquanto ao mesmo tempo de montagem respostas imunes eficazes contra micróbios patogénicos acidentalmente ingeridas com alimentos. Homeostase intestinal também é preservada através de várias interacções complexas entre a microbiota (incluindo as estirpes bacterianas benéficas associadas ao alimento) e do hospedeiro, que regulam a fixação / degradação do muco, da produção dos péptidos antimicrobianos, através da barreira epitelial, e a &quot;formação&quot; do células epiteliais &quot;, que controla o fenótipo tolerogenic ou imunogênica de únicas, gut-residentes células linfóides das populações. Estas interacções têm sido muito difíceis de reproduzir com ensaios in vitroutilizando quer linhas de células cultivadas ou de células mononucleares do sangue periférico. Além disso, os modelos de rato diferem substancialmente em componentes da mucosa intestinal (organização da camada de muco, a comunidade de bactérias comensais) com respeito ao intestino humano. Assim, os estudos de uma grande variedade de tratamentos para ser interpostos nas clínicas para as condições relacionadas com o stress ou patológicos importantes, tais como a síndrome do intestino irritável, doença inflamatória do intestino ou o cancro colo-rectal têm sido difíceis de realizar. Para tratar dessas questões, foi desenvolvido um novo sistema que nos permite estimular explantes de mucosa intestinal humana, que mantêm o seu in situ condicionado pela microbiota de acolhimento e resposta imune, de forma polarizada. Estimulação apical polarizada é de grande importância para o resultado da resposta imunitária induzida. Tem sido repetidamente demonstrado que os mesmos estímulos podem produzir respostas completamente diferentes quando ignorar a cara apical do epi intestinalthelium, estimulando as células epiteliais basolateralmente ou entrar em contato direto com os componentes da lâmina própria, mudando o fenótipo de tolerogenic para imunogênica e causando inflamação excessiva e desnecessária na área. Conseguimos estimulação polarizada por colagem de um cilindro caverna que a área delimitada da estimulação na cara apical da mucosa, como será descrito no protocolo. Nós usamos este modelo para examinar, entre outros, os efeitos diferenciais de três estirpes diferentes de bactérias lácticas. Mostramos que este modelo de sistema é muito poderoso para avaliar as propriedades imunomoduladoras de probióticos em condições saudáveis ​​e doença.

Conseguimos manter a mucosa intestinal humana saudável e IBD em cultura por pelo menos 24 horas preservando o bem-estar do tecido. Em conformidade com as observações anteriores 1, isto foi apenas possível se a maior parte do tempo de cultura (de pelo menos 85% do total) foi realizada em O 2, tal como o tecido não sobreviveram durante 24 horas em incubadoras convencionais (Figura 2). Mostramos também que as diferentes respostas de explantes pode ser observado neste modelo, dependend...

Introduzimos um novo método para a manutenção da mucosa intestinal humana em cultura e monitorização da resposta a vários tipos de estímulos durante pelo menos 24 horas. Com o nosso método, a polaridade do tecido é mantida, o que permite um estímulo fisiológico por via apical.

Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal

Atualmente, existem poucos modelos para simular de forma realista o microambiente complexo do intestino humano, onde ocorrem diversas interações. A adequada...

O objetivo geral do experimento a seguir é imitar a situação in vivo para a estimulação da mucosa intestinal humana. Isso é conseguido colando um cilindro de cave no lado apical do tecido, impedindo que o estímulo entre em contato basolateral. Como segundo passo, aplica-se o estímulo, o que permitirá a análise da resposta imune provocada.Em seguida, o estímulo é removido do lado apical do tecido para mantê-lo viável por 24 a 36 horas. Os resultados obtidos podem mostrar efeitos diferenciais de diversas cepas probióticas com base em dados de imuno-histoquímica, secreção de citocinas, análise de perfil, entre outros. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a câmara ASIC, é que ela permite a análise de até 20 condições simultaneamente.Permite a extensão do tempo de cultivo até 36 horas e também fornece material suficiente para diversas análises de leitura, como análise de D-N-A-R-N-A, imunohistoquímica, secreção de citocinas, entre outras. Embora este metal possa fornecer insights no campo dos probióticos, também pode ser utilizado em outras tecnologias e para estudar o efeito de outros imunomoduladores, como biológicos, medicamentos anti-inflamatórios

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: In, J. G., et al. Monocamadas colonoides humanas para estudar interações entre patógenos, comensais e epitélio intestinal do hospedeiro. J. Vis. Exp. (2019).Este vídeo demonstra o procedimento para cultivar células epiteliais derivadas do cólon em um sistema Transwell revestido de colágeno para gerar uma monocamada produtora de muco que modela a barreira intestinal e possibilita estudos de interação hospedeiro-patógeno.

Geração de uma monocamada colonoide humana com função barreira para estudar as interações hospedeiro-patógeno

Neste vídeo, descrevemos a metodologia para configurar um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações entre fragmentos de tecido intestinal de camundongos e bactérias intestinais específicas. O dispositivo consiste em dois pares de portas de entrada e saída, a primeira conectando o lúmen do tecido intestinal e fornecendo a suspensão bacteriana específica a ele, e a segunda fornecendo continuamente meios aos poços do dispositivo para manter a viabilidade do tecido...

Um sistema de cultura de órgãos intestinais ex vivo para estudar as interações hospedeiro-microbiota

Descrevemos um método para estabelecer enteróides humanos a partir de criptas do intestino delgado e colonóides a partir de criptas do cólon coletadas de tecido cirúrgico e biópsias. Neste artigo metodológico, apresentamos as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento e manutenção bem-sucedidos de enteróides e colonóides humanos.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

Aqui, um protocolo para a colheita, manter, e tratar rato pequenas Organóides intestinais com padrões de agentes patogénicos associados moleculares (PAMPs) e Listeria monocytogenes é descrito, bem como a ênfase na expressão de genes e técnicas de normalização adequada para a proteína.

o<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Reconhecimento de Padrões Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organóides

Descreve-se um protocolo in vitro de co-cultura intestino microbiota e vilosidades intestinais por um período prolongado utilizando um sistema microphysiological intestino humano-on-a-chip.

Co-cultura de Vida Microbiome com Intestinal Microengineered Humano Villi num Gut-on-a-Chip Microfluidic Dispositivo

Este protocolo descreve o isolamento e cultura de células do intestino delgado de murídeo mistos. Estas culturas primárias intestinais permitir a investigação das vias de sinalização subjacentes a secreção do péptido intestino utilizando um número de técnicas.

Culturas primárias mistas de Murino Intestino Delgado destinadas ao estudo de Gut hormonal Secreção e imagens de células vivas de Células Enteroendócrinas

Aqui, apresentamos um protocolo para a cultura humana enteroid ou monocamadas de colonoid que têm a função de barreira intacta para estudar interações de epitélio-microbiota de acolhimento a nível celular e bioquímico.

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Este protocolo descreve como induzir a diferenciação de pilhas de M em monocamadas ileal derivado da pilha de haste humana e em métodos para avaliar seu desenvolvimento.

Diferenciação induzida de pilhas de M cell-like em monolayers Enteroid ileal derivado da pilha de haste humana

Aqui apresentamos dois protocolos que permitem a modelagem de interações apical-específicas intestinais. Monocamadas intestinais derivadas de organoides e culturas de Interface Ar-Líquido (ALI) facilitam a geração de epitélio bem diferenciadas acessíveis tanto de lados luminosos quanto basolaterais, enquanto as organoides intestinais invertidas pela polaridade expõem seu lado apical e são favoráveis a ensaios de alto rendimento.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

O estudo apresenta um método para investigação in vitro de infecção bacteriana utilizando organoides intestinais derivados de células-tronco teciduais. O protocolo descreve como cultivar e diferenciar organoides em duas dimensões, infectá-los com Escherichia coli invasiva aderente e avaliar leituras-chave, incluindo ruptura da barreira epitelial, imagem de infecção e resposta de RNA epitelial.

Uma cultura organoide bidimensional em extrato de invasina ou membrana basal para estudar as interações hospedeiro-bactéria

Aprenda a cultivar mucosa intestinal humana com estimulação polarizada por 24-36 horas. Este método preserva a polaridade tecidual e permite análise simultânea de até 20 condições para estudo de respostas imunes.

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