Um novo método para a Cultura e polarizada Estimulação dos Humanos explantes mucosa intestinal

O objetivo geral do experimento a seguir é imitar a situação in vivo para a estimulação da mucosa intestinal humana. Isso é conseguido colando um cilindro de cave no lado apical do tecido, impedindo que o estímulo entre em contato basolateral. Como segundo passo, aplica-se o estímulo, o que permitirá a análise da resposta imune provocada.

Em seguida, o estímulo é removido do lado apical do tecido para mantê-lo viável por 24 a 36 horas. Os resultados obtidos podem mostrar efeitos diferenciais de diversas cepas probióticas com base em dados de imuno-histoquímica, secreção de citocinas, análise de perfil, entre outros. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a câmara ASIC, é que ela permite a análise de até 20 condições simultaneamente.

Permite a extensão do tempo de cultivo até 36 horas e também fornece material suficiente para diversas análises de leitura, como análise de D-N-A-R-N-A, imunohistoquímica, secreção de citocinas, entre outras. Embora este metal possa fornecer insights no campo dos probióticos, também pode ser utilizado em outras tecnologias e para estudar o efeito de outros imunomoduladores, como biológicos, medicamentos anti-inflamatórios, entre outros. O tecido da mucosa intestinal de indivíduos saudáveis ou com doença inflamatória intestinal deve ser obtido durante cirurgia.

Uma vez que o espécime é ressecado, transfira-o rapidamente para o laboratório, mantendo-o refrigerado em HBSS com penicilina e estreptomicina. Em seguida, inicie lavando o tecido com o tampão e remova qualquer material mesentérico. A seguir, separe a camada da mucosa da submucosa usando tesoura e pinça estéreis, mantendo o tecido no tampão HBSS.

Em uma placa de Petri, não é necessário manter o tecido totalmente submerso, mas toque a superfície mucosa o mínimo possível com a pinça. Em seguida, corte a mucosa em tiras com pelo menos um centímetro de largura e o mais compridas possível, usando dois escalpelos estéreis de maneira semelhante ao corte de alimentos. Após o corte, lave e limpe suavemente a mucosa em HBSS livre de cálcio e magnésio.

Por fim, estenda as tiras de mucosa em uma placa de Petri com as faces apicais voltadas para cima. Comece preparando o DMEM TIS fresco. Em seguida, preencha uma placa de Petri de 10 centímetros com cerca de 30 mililitros de F-B-S-N-A e submerja completamente uma grade de ferro na solução.

Mantenha a placa aberta e posicione cilindros de plástico sobre a placa. Cubra. Agora, aspire três microlitros de cola cirúrgica para uma pipeta e aplique cuidadosamente a cola em uma das bordas de um cilindro de plástico, segurando-o firmemente com a pinça. Em seguida, posicione suavemente o cilindro no lado apical da mucosa, o mais próximo possível da borda de uma das tiras, enquanto a cola seca.

Dispense de 850 a 1000 microlitros de meio no poço central da placa de tecido e apoie a grade de ferro nas bordas do poço central da placa. Usando dois bisturis, corte o tecido excedente das bordas do cilindro. Agora levante suavemente o cilindro com o tecido aderido e posicione o lado basolateral do tecido sobre a grade de ferro no centro da placa.

Em seguida, prossiga com a estimulação do tecido. Aplique os estímulos de interesse no centro do cilindro de plástico na concentração desejada. Não perturbe o cilindro nem a superfície mucosa com a ponta da pipeta e cubra uniformemente a superfície interna do cilindro.

Agora, incube o tecido por até três horas. A incubação por mais de três horas também é viável, utilizando um volume menor de solução de estímulo. Após a incubação, remova o estímulo da superfície apical do tecido, mas não o substitua por meio fresco.

A adição de meio asfixiaria o tecido. Agora, encha o frasco de oxigênio com uma atmosfera de pressão de oxigênio a 100% para um período de cultivo de 24 horas. Tenha sempre cuidado ao manusear o tanque de oxigênio e certifique-se de fechá-lo corretamente após o uso.

Após o cultivo de estimulação de 24 horas, use um bisturi para remover cuidadosamente o cilindro do tecido, raspando suavemente a cola. Em seguida, para ensaios de IHC ou imunofluorescência, fixe o tecido. Ou, para análise de expressão gênica ou proteica, congele rapidamente o tecido em nitrogênio líquido.

Em seguida, colete o meio lateral basal para perfis de secreção de citocinas. Após isso, transfira o meio para um tubo de centrífuga e pelletize os detritos utilizando o protocolo descrito. A mucosa intestinal humana saudável e com DII foi cultivada por pelo menos 24 horas, preservando o bem-estar dos tecidos.

Isso só foi possível se pelo menos 85% do tempo de cultivo ocorresse em um ambiente rico em oxigênio. A mucosa cultivada convencionalmente não apresenta um desempenho tão bom. O tecido saudável foi então estimulado com salmonela invasiva pró-inflamatória.

Duas horas após a inoculação, a destruição da camada superior do epitélio já era visível em comparação com os controles. Após 24 horas, a degeneração tornou-se bastante extensa. Uma discussão mais aprofundada sobre aplicações experimentais com resultados publicados encontra-se no manuscrito escrito após o seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para pesquisadores que atuam na área de gastroenterologia estudarem a interação entre hospedeiro e microrganismos no trato gastrointestinal. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como manter uma mucosa intestinal humana em cultura e estimulá-la topicamente. Não se esqueça de que trabalhar com amostras humanas pode ser extremamente perigoso e as precauções necessárias devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.