Ressonância Magnética Funcional (fMRI), com estimulação auditiva em aves canoras

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um protocolo otimizado para a visualização bem-sucedida da percepção e do processamento sonoro em regiões auditivas e de controle da vocalização no cérebro de aves canoras. Utilizando ressonância magnética funcional, isso é alcançado primeiramente pela preparação de estímulos auditivos de boa qualidade, que podem ser incorporados a um paradigma de blocos alternados (ligado-desligado) para apresentação ao animal durante a aquisição de imagens por ressonância magnética funcional ou FMRI. O segundo passo consiste em preparar a ave para a aquisição de imagens, primeiramente anestesiando-a e, em seguida, posicionando-a sobre uma maca adaptada para animais, a qual é então colocada no interior do orifício do scanner de ressonância magnética. Em seguida, podem ser adquiridas imagens de FMRI durante a estimulação auditiva.

O passo final consiste em pré-processar os dados de RM adquiridos, incluindo a normalização das imagens para o atlas do tentilhão-zebra. Em última análise, utiliza-se uma análise estatística baseada em voxel para permitir a visualização dos resultados obtidos e localizar as ativações cerebrais induzidas pelos estímulos auditivos. A principal vantagem desta técnica em comparação com outros métodos mais comumente utilizados na pesquisa com beija-flores, como eletrofisiologia, histologia e técnicas de mapeamento molecular, é que a RMf é um método não invasivo in vivo, que permite estudar o mesmo indivíduo ao longo do tempo e analisar todo o cérebro simultaneamente, sem hipótese prévia sobre a localização dos substratos neurais envolvidos no processo investigado.

Indivíduos novos neste método podem enfrentar dificuldades porque a implementação de ressonância magnética funcional em aves é muito diferente e muito mais desafiadora do que usar o mesmo método em humanos ou roedores. Isso se deve não apenas ao pequeno tamanho dos cérebros desses animais, mas também ao fato de que seus crânios são compostos por numerosas cavidades aéreas, o que induz artefatos de suscetibilidade; ao utilizar uma sequência de eco de spin menos suscetível a esses artefatos em comparação com uma sequência por gradiente, podemos realizar imagem funcional de todo o cérebro do pássaro cantor com excelente especificidade espacial. O orifício do scanner é um espaço confinado que pode distorcer os estímulos auditivos.

Portanto, para iniciar o preparo deste protocolo, grave os estímulos sonoros enquanto são reproduzidos dentro do orifício do sistema de RM de sete T usando um microfone de fibra óptica e verifique as distorções para o sistema de RM utilizado. Aqui podemos observar as frequências realçadas e suprimidas, conforme mostrado pelas gravações de ruído branco feitas fora do escâner e na posição da cabeça do pássaro dentro do orifício do ímã. Para compensar esse realce artificial, aplique uma função equalizadora a cada estímulo usando o software Wave Lab para a configuração apresentada.

Neste protocolo, a função consiste em um kernel gaussiano com os parâmetros exibidos na tela. Aqui, os estímulos sonoros devem ser compostos por vários motivos individuais de canto de um pássaro específico, intercalados com períodos de silêncio; ajuste a duração desses períodos silenciosos para manter a quantidade total de som e silêncio idêntica em todos os estímulos. O comprimento total de cada estímulo é de 16 segundos, o que corresponde ao tempo de aquisição de duas imagens de RMf.

Utilizando um software de preparação, normalize a intensidade de cada música em termos de média quadrática ajustada e aplique um filtro passa-alta em 400 hertz antes de integrar ao estímulo completo. O experimento pode ser planejado usando um software de apresentação com um delineamento em blocos ligado-desligado, alternando períodos de estimulação auditiva com períodos de repouso. Cada bloco deve durar 16 segundos, correspondendo ao tempo de aquisição de duas imagens, apresentando cada tipo de estímulo 25 vezes, resultando na aquisição de 50 imagens por estímulo e por sujeito.

A ordem de apresentação das condições deve ser randomizada dentro e entre os sujeitos. Configure também o paradigma experimental de modo que ele receba gatilhos do escâner. Isso garante que, durante a aquisição, a cada repetição dentro da sequência de FMRI, o software do escâner envie um gatilho ao software de apresentação auditiva, que por sua vez registra o número da aquisição e executa o comando correspondente.

Aqui apresentamos um protocolo especificamente adaptado para o uso de tentilhões-zebra adultos. Os tentilhões-zebra devem ser mantidos em aviários sob um fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas de escuro e ter acesso a alimento e água ad libitum durante todo o estudo. O número mínimo de indivíduos por experimento é 15.

Este número leva em consideração a sensibilidade do FMRI de eco de spin e a variabilidade interindividual natural dos fenômenos biológicos medidos no experimento. Para se preparar para o experimento, primeiro conecte a máscara bucal ao dispositivo controlador de gás com tubos plásticos e instale-a na maca de ressonância magnética de um sistema de 7 T. Abra os frascos de gás oxigênio e nitrogênio e ligue o dispositivo controlador de gás.

Ative também o sistema controlado por feedback e o dispositivo de fluxo de ar quente. Em seguida, anestesie o tentilhão com 3% de isoflurano em uma mistura de oxigênio e nitrogênio, introduzindo o bico da ave na máscara e segurando a cabeça até que o pássaro esteja completamente anestesiado. Isso pode ser verificado puxando suavemente a pata.

Quando a ave estiver totalmente sedada, a pata não será retraída. Além disso, os olhos da ave estarão fechados. Introduza uma sonda de temperatura cloacal para monitorar a temperatura corporal durante todo o experimento e coloque um sensor pneumático sob o abdômen para acompanhar a frequência respiratória.

Em seguida, coloque uma jaqueta para imobilizar o corpo do pássaro durante todo o experimento. Mantenha a frequência respiratória entre 40 e 00 respirações por minuto e a temperatura corporal constante em 40 graus. Se a faixa respiratória estiver muito baixa ou alta, ajuste o nível de anestesia conforme necessário.

Se o problema persistir, o experimento deve ser interrompido e o animal deve ser removido do equipamento. Para recuperar, posicione alto-falantes dinâmicos não magnéticos em ambos os lados da cabeça do tentilhão-de-zebra e conecte-os ao amplificador. Certifique-se de que os fios dos alto-falantes sejam conduzidos longe da sonda de temperatura, pois isso pode influenciar a leitura de temperatura.

Quando estiver muito próximo, posicione a bobina RF de superfície sobre a cabeça do tentilhão-de-asa-listada. Em seguida, posicione o tentilhão-de-asa-listada no centro do ímã. Por fim, reduza o nível de anestesia para 1,5% de ISO de flúor antes da aquisição de imagens.

Para iniciar a varredura, primeiro determine a posição do cérebro no ímã. Adquira um conjunto de imagens orientadoras de única fatia com gradiente eco, nos planos sagital, horizontal e coronal, bem como imagens orientadoras multifaixa utilizadas posteriormente para o posicionamento dos exames funcionais. Em seguida, reduza o ruído dos gradientes aumentando seus tempos de rampa para 1000 microssegundos.

Em seguida, prepare uma aquisição rápida com relaxamento realçado, conhecida também como FMRI ponderada em T2 RARE. Em seguida, defina uma sequência com 15 cortes sagitais que cubram quase todo o cérebro. Agora, selecione o protocolo auditivo no software de apresentação para garantir que o software de apresentação auditiva não perca nenhum gatilho proveniente do scanner.

Inicie o protocolo auditivo primeiro. Em seguida, uma vez que o protocolo esteja completamente carregado, inicie a sequência de FMRI. Cada experimento de FMRI deve ser precedido pela aquisição de 10 imagens simuladas para permitir que o sinal atinja um estado estável antes do início da estimulação auditiva.

Após a aquisição estar completa, preencha os dados até 64 por 64. Para determinar a qualidade dos dados, dê uma olhada preliminar nos resultados, utilizando a ferramenta funcional.

No software ParaVision, calcule a resposta bold diferencial entre todos os blocos de ativação e a linha de base. Se nenhuma ativação for observada nas áreas auditivas primárias, é provável que o pássaro não tenha ouvido ou processado os estímulos auditivos devido a problemas técnicos ou ao nível de anestesia. O arranjo experimental deve ser verificado e a medição repetida.

Após a aquisição funcional, execute uma sequência ponderada em T dois 3D rare anatômica na mesma orientação dos exames de FMRI anteriores. Em seguida, preencha esses dados até 2 56 por 2 56 por 2 56.

Finalmente, remova o tico-tico da mesa de ressonância magnética e permita que ele se recupere da anestesia em uma gaiola sob uma lâmpada de aquecimento. Normalmente, a recuperação de um tico-tico da anestesia com fluoreto de isoflurano leva menos de cinco minutos. Após alguns minutos, o pássaro tentará se levantar e, quando estiver completamente recuperado, pousará em um galho em vez de permanecer sentado no fundo da gaiola, podendo então iniciar o processamento de dados.

Primeiro, converta os dados de RM para o formato analyze ou nifty. Em seguida, antes de iniciar o processamento dos dados no SPM, é necessário adaptar os dados de FMRI de pássaros multiplicando o tamanho do vóxel por 10. Como o software de análise de FMRI foi desenvolvido para processar dados de FMRI adquiridos em humanos, a forma mais simples de proceder é aumentar artificialmente o tamanho do vóxel dos dados de FMRI de pássaros utilizando o software MRI Crow.

Observe que esse ajuste não influencia os próprios dados. Nenhuma reamostragem ou outras modificações nos dados é aplicada. Em seguida, os dados adquiridos são pré-processados.

Utilizando o SPM, primeiro realinhe os dados de FMRI e coregistre o conjunto de dados anatômicos 3D à série temporal de FMRI. Em seguida, normalize os dados 3D e a série temporal de FMRI COREGISTRADA para o cérebro do tentilhão-zebra, conforme o Atlas de Ressonância Magnética.

Aplicar a matriz de transformação ao conjunto de dados de FMRI e suavizar os dados com um kernel gaussiano de 0,5 milímetro. Em seguida, realizar a análise estatística baseada em voxel no SPM oito, primeiro no nível dos pássaros individuais, seguido pela análise no nível do grupo. Por fim, para visualizar os resultados e localizar as ativações funcionais, projetar o mapa paramétrico estatístico no atlas do tentilhão-zebra, o atlas tridimensional de alto resolução do cérebro do tentilhão-zebra, e as coordenadas estereotáxicas utilizadas na análise descrita dos resultados de FMRI do tentilhão-zebra foram projetadas para este experimento no laboratório de Bioimagem, o conjunto de dados do Atlas de Ressonância Magnética.

Os contornos do cérebro e os contornos dos núcleos estão disponíveis gratuitamente por meio do site mostrado aqui. Aqui é apresentada uma vista lateral de uma representação 3D do hemisfério esquerdo, com estruturas delineadas do atlas projetadas sobre sua fatia médio-sagital. Aqui podemos ver um exemplo de resposta BOLD no FMRI na região auditiva primária campo L e em regiões auditivas secundárias adjacentes, evocadas por diferentes estímulos auditivos em comparação com a condição de repouso.

Os valores de T são codificados por cores de acordo com a escala exibida na figura, e somente os voxels nos quais o teste T foi considerado significativo são mostrados. Este é outro exemplo de um experimento de FMRI em tentilhões-zebra. As imagens mostram respostas seletivas à própria canção do pássaro nas regiões cerebrais área XMLD e HVC.

Os números sob as imagens indicam coordenadas em milímetros a partir da linha média. O sinal positivo indica que as fatias e os resultados estatísticos são do hemisfério direito. O protocolo descrito neste vídeo pode ser facilmente adaptado para aplicações em outros pássaros cantores, como as estorninhos.

Este é um exemplo dos resultados de um experimento de FMRI. Em um estorno, a figura mostra ativações induzidas por estímulos auditivos em comparação com o repouso no mesmo indivíduo ao longo das estações. A implementação e otimização da ressonância magnética funcional em aves cantoras abre novas perspectivas de pesquisa no campo do estudo dessas aves.

Já se demonstrou ser uma técnica valiosa para a análise experimental de processos sensoriomotores e cognitivos complexos subjacentes à comunicação vocal nesses modelos animais. Além disso, graças à sua abordagem não invasiva e ao exame cerebral completo, a RMf pode ser usada como um método complementar para subsidiar métodos locais e invasivos mais comumente realizados. O crescente número de experimentos de RMf em SUNBIRDS demonstra sua aplicabilidade a questões de pesquisa cognitiva, um esforço futuro que deveria ser feito para ampliar ainda mais os experimentos de RMf além do processamento auditivo, um processo que permanece ativo sob anestesia, sendo o uso de sujeitos acordados habituados ao protocolo de imagem.

Isso pode oferecer novas possibilidades de pesquisa em que as aves possam participar ativamente de experimentos de EMI e em que a atenção das aves possa ser controlada experimentalmente.