Name: Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Aprenda a usar eletroporação in ovo de plasmídeos baseados em microRNA para estudar orientação de axônios comissurais no tubo neural de embriões de galinha. Este método permite silenciamento gênico específico de tipo celular.

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Trabalho no laboratório do ES é apoiado pela National Science Foundation suíço. Gostaríamos de agradecer ao Dr. batida Kunz para a assistência com as filmagens.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta simples, baseado em vectores de expressão artificial miRNA estratégia pode ser usada para knockdown expressão do gene endógeno no tubo neural frango. Estas ferramentas funcionais oferecer silenciamento de genes múltiplos, o controlo temporal e especificidade do tipo de célula, a fim de facilitar a elucidação das complexas vias de desenvolvimento. Em particular, foi demonstrado a utilidade destes plasmídeos em orientação axon comissural, uma vez que os plasmídeos podem ser usados ​​para genes distintos em knockdown ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,5 milímetros capilares de vidro </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Vidro agulha extrator </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard elastómero de silicone </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Fio de tungstênio, 0,075 milímetros </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Pinos de insetos, 0,20 milímetro </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Pinos de insetos, 0,10 milímetro </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Tesoura Primavera </td><td> Ciência Fineols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont n º 5 fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Rápido DiI </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscópios fluorescentes </td><td> Olimpo </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

em eletroporação ovo de mirna-base de plasmídeos no tubo neural desenvolvimento e avaliação de fenótipos por dil injeção em livro aberto preparações

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Comissurais ED1 neurônios têm sido extensivamente estudadas para elucidar os mecanismos subjacentes a orientação axônio durante 1,2 desenvolvimento. Esses neurônios estão localizados na medula espinhal dorsal e enviar seus axônios ao longo de trajetórias estereotipados. Axônios comissurais inicialmente projetar ventralmente para e, em seguida, do outro lado da placa ventral. Depois de cruzar a linha média, esses axônios fazer uma curva acentuada rostral e projeto longitudinalmente para o cérebro. Cada uma dessas etapas é regulado pelas atividades coordenadas de pistas de orientação atrativas e repulsivas. A correta interpretação dessas pistas é fundamental para a orientação dos axônios ao longo de seu percurso demarcado. Assim, a contribuição fisiológica de uma molécula particular de orientação encontra-se idealmente axônio comissural investigado no contexto do embrião vivo. Por conseguinte, knockdown gene in vivo devem ser controlados com precisão, a fim de distinguir cuidadosamente actividades de orientação de axónios de genes que podem desempenhar múltiplaspapéis durante o desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um método para a expressão do gene knockdown no tubo neural galinha em uma célula de tipo específico forma rastreável. Usamos novos vectores plasmídicos 3 abrigar células específicas do tipo promotores / intensificadores que dirigem a expressão de um marcador de proteína fluorescente, seguido directamente por uma transcrição miR30 RNAi-4 (localizado dentro da 3&#39;-UTR do ADNc que codifica para a proteína fluorescente) ( Figura 1). Quando electroporado para dentro do tubo neural em desenvolvimento, estes vectores de eliciar downregulation eficaz da expressão do gene e expressar proteínas marcadoras fluorescentes brilhantes para permitir o rastreio directo das células experimentam knockdown 3. Misturando diferentes vetores de RNAi antes da electroporação permite que o knockdown simultânea de dois ou mais genes de regiões independentes da medula espinhal. Isto permite complexas interacções celulares e moleculares a serem examinados durante o desenvolvimento, de um modo que é rápido, sim, preciso e de baixo custo. Em combinação com Dil rastreamento de trajetórias axônios comissurais em livro aberto preparações 5, este método é uma ferramenta útil para estudos in vivo dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio comissural e orientação. Em princípio, qualquer promotor / intensif icador poderiam ser utilizados, o que poderia tornar a técnica mais extensamente aplicável para estudos in vivo da função do gene durante o desenvolvimento 6. Este primeiro vídeo demonstra como manipular e ovos de janela, a injecção de plasmídeos de ADN para dentro do tubo neural e do procedimento de electroporação. Para investigar orientação axônio comissural, a medula espinhal é retirado do embrião como uma preparação de livro aberto, fixo, e injetado com Dil para permitir percursos de axónios a ser traçada. A medula espinal é montado entre lamelas e visualizadas por microscopia confocal.

Um método através do qual a expressão do gene no tubo neural pode ser downregulated em um tipo de célula específico forma rastreável é descrito. Demonstramos como<em&gt; In ovo</em&gt; Electroporação de microRNA baseados em plasmídeos que eliciam espaço-temporalmente controlada RNA de interferência pode ser utilizada para investigar a orientação do axónio comissural no tubo neural em desenvolvimento.

Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações

Os neurônios comissurais dI1 têm sido extensivamente estudados para elucidar os mecanismos subjacentes ao guia axonal durante o desenvolvimento1,2. Esses neurônios são ...

O objetivo deste procedimento é avaliar defeitos na orientação de axônios no tubo neural de embrião de galinha após a redução da expressão gênica de maneira rastreável e específica para um tipo celular. Isso é realizado preparando ovos de galinha fertilizados para eletroporação in ovo, fazendo uma janela na casca do ovo. O segundo passo consiste em injetar e eletroporar construtos de DNA que codificam microRNAs no tubo neural.Em seguida, as medulas espinhais eletroporadas são dissecadas e fixadas em preparações planas do tipo "livro aberto". O passo final consiste na injeção de um corante fluorescente para visualizar as projeções axonais. Por fim, utiliza-se microscopia fluorescente para demonstrar tanto as células submetidas ao silenciamento gênico quanto para avaliar os efeitos subsequentes na orientação dos axônios comissurais.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é o silenciamento gênico específico de tipos celulares. Para preparar os plasmídeos, consulte o protocolo escrito para obter instruções. Incube os ovos a 38,5 graus Celsius e cerca de 45% de umidade até que o estágio desejado de desenvolvimento seja atingido. Para estudar o direcionamento de axônios de neurônios comissurais, incube os embriões por aproximadamente três dias, até que atinjam o estágio 17 a 18 de Hamburger e Hamilton.Uma vez atingida a fase desejada de desenvolvimento e antes que a proteína de interesse se acumule dentro do embrião, retire os ovos da incubadora e coloque-os em uma posição horizontal estável por 20 minutos para reposicionar o embrião na parte superior da gema, na face superior do ovo. Após os embriões se reposicionarem sobre a gema, retire os ovos da incubadora e limpe-os com etanol a 70%. Em seguida, coloque uma tira de fita ao longo do eixo longitudinal do ovo e use um bisturi para fazer um pequeno orifício na extremidade romba do ovo e outro no canto da área a ser aberta.Em seguida, insira uma seringa equipada com uma agulha de calibre 18 no orifício na extremidade romba do ovo em um ângulo de 45 graus e aspire cerca de três mililitros de albúmen, tomando cuidado para não danificar a gema. Use uma tesoura pequena segurada horizontalmente para cortar uma janela no ovo sem danificar o embrião. Em seguida, feche a janela usando a fita.Por fim, use um pincel para aplicar parafina derretida a fim de selar o orifício na extremidade romba do ovo e selar quaisquer rachaduras no ovo da mesma maneira. Em seguida, devolva o ovo à incubadora. Repita o processo com todos os ovos que serão eletroporados.Remova a fita de um dos ovos com janela e estagie o embrião de acordo com Hamburger e Hamilton. Em seguida, use uma pinça para levantar as membranas extraembrionárias da metade cordal do embrião na região onde estão localizadas as principais veias vitelinas direita e esquerda. Insira suavemente as membranas no tronco, rasgando ou cortando-as com tesoura de mola, e direcione-as em direção à cauda.Agora, use sucção suave para carregar a mistura de DNA a ser eletroporada em uma micropipeta de vidro com tubo acoplado. Insira a micropipeta no canal central do tubo neural logo acima dos membros posteriores e injete a solução de DNA, controlando o volume injetado por meio da boca. A tintura azul deve se espalhar desde a ponta da cauda até o ventrículo do cérebro em desenvolvimento.Adicione algumas gotas de PBS estéril sobre o embrião e posicione os eletrodos paralelamente ao eixo anterior-posterior do embrião sem tocar o embrião ou quaisquer vasos sanguíneos. Em seguida, mantenha os eletrodos firmes e realize a eletroporação. Após a eletroporação, remova os eletrodos e enxágue rapidamente com água estéril para remover proteínas desnaturadas do clara do ovo.Por fim, adicione um pouco mais de PBS estéril sobre o embrião e, em seguida, feche novamente o ovo com fita adesiva. Como antes, o fechamento adequado é essencial para evitar a desidratação do embrião. Em seguida, retorne o embrião ao incubador até que o estágio desejado de desenvolvimento seja atingido.Quando o embrião atingir o estágio 25 a 26 de Hamburger Hamilton, utilize pinças para remover o embrião do ovo e colocá-lo em uma placa de Petri revestida com elastômero de silício. Use as pinças para remover as membranas extraembrionárias e posicione o embrião com o lado dorsal voltado para baixo. Agora, utilize pinos para insetos de 0,2 milímetro para esticar e fixar suavemente o embrião através do pescoço e da cauda.Em seguida, fixe as extremidades do embrião, inserindo os alfinetes em um ângulo para que não interfiram na dissecação subsequente. Ilumine o recipiente contendo o embrião por baixo, de modo que a densidade tecidual possa ser percebida. Use tesoura de mola para abrir a cavidade abdominal e raspagem suave com pinça para remover o coração e os órgãos internos.Quando todos os órgãos forem completamente removidos, as vértebras segmentadas e a medula espinhal ficarão visíveis. Em seguida, gire o embrião 180 graus e use uma tesoura de mola para fazer um corte superficial através das vértebras que recobrem a medula espinhal na região do pescoço. Depois, faça dois cortes longitudinais curtos através das vértebras em ambos os lados da medula espinhal, desde o pescoço até a cauda.Use uma pinça para levantar as vértebras fláper longe da medula espinhal e, em seguida, retire as vértebras em uma única tira em direção à cauda. Em seguida, estique suavemente e fixe novamente o embrião pela cauda e membros. Agora, identifique as meninges da medula espinhal, que devem aparecer como uma linha escura e densa de tecido entre o tubo neural e os gânglios das raízes dorsais, e use uma agulha estéril ou um bisturi microcirúrgico fino para cortar as meninges longitudinalmente ao longo de cada lado da medula, do pescoço até a cauda.As meninges devem se separar facilmente da medula espinhal devido ao alongamento do embrião fixado. Por fim, corte a medula espinhal ao nível do botão da asa e caudal ao botão do membro. Em seguida, use uma pinça para levantar a medula espinhal com um movimento rostral-caudal, garantindo que a medula permaneça imersa no PBS Primeiro.Espalhe a medula espinhal isolada sobre uma espátula e transfira-a para um novo recipiente revestido com sylgard contendo paraformaldeído a 4% em PBS. Em seguida, fixe cuidadosamente a medula espinhal dorsalmente, medialmente e em quartos com alfinetes de inseto de 0,1 milímetro para obter uma preparação em montagem plana, incubando-a no paraformaldeído por 30 minutos a uma hora. Tenha cuidado para não superfixar.Isso aumentará o ruído de fundo e reduzirá a eficiência da difusão do diod. Em seguida, despeje cuidadosamente o paraformaldeído e substitua por PBS. Após preparar cinco miligramas por mililitro de fast di em etanol, quebre a ponta de uma micropipeta de vidro de pequeno diâmetro acoplada a uma tubulação de plástico e aspire a solução para dentro da micropipeta.Insira a agulha cheia em um recipiente com PBS e verifique se o corante não vaza da agulha. Caso vaze, o diâmetro está muito largo e uma nova agulha deve ser preparada. Certifique-se de que a preparação do tipo "livro aberto" esteja iluminada por baixo e localize a faixa longitudinal mais densa, situada a aproximadamente um quinto da largura do hemilivro a partir da borda lateral; os corpos celulares dos neurônios comissurais estão localizados logo dorsais a essa linha escura.Insira a ponta da micropipeta de vidro no tecido e, ao retirar a agulha, aplique uma pequena quantidade de D eye usando uma pipeta de boca, repetindo rapidamente o procedimento a cada 0,5 milímetro ao longo do comprimento do livro aberto. Após a conclusão das injeções, use uma pipeta de transferência para aspirar e descartar qualquer excesso de di; a falha em fazê-lo resultará em alto fundo.Repita o procedimento para todas as preparações em livro aberto. Em seguida, coloque o recipiente contendo as preparações injetadas a quatro graus Celsius por aproximadamente três dias para permitir que o corante se espalhe ao longo dos axônios. Após esse período, monte as preparações de acordo com as instruções no protocolo escrito.Seções transversais e livros abertos foram obtidos de embriões de galinha no Estágio 25 a 26 de Hamburger-Hamilton, os quais foram eletroporados no Estágio 18 de Hamburger-Hamilton. Como visto aqui em corte transversal, o promotor beta-actina induz expressão ubíqua. A seta indica a direção dorsoventral.Esta imagem mostra um exemplo de padrões de expressão de proteínas fluorescentes obtidos após a eletroporação dos vetores plasmidiais. Aqui, observa-se a expressão ubíqua do promotor beta-actina em uma preparação do tipo livro aberto. A seta indica a direção cordal rostral.Esta imagem mostra uma seção transversal após eletroporação com um construto contendo um potenciador de math one. Isso induz a expressão em neurônios di um. Aqui, a expressão proveniente do construto com potenciador de math one é observada em uma preparação do tipo livro aberto.Esta seção transversal mostra a expressão do falcão, um enhancer após a eletroporação bilateral do construto. O enhancer do falcão A um induz expressão especificamente na placa do assoalho. Esta preparação em livro aberto mostra o padrão de expressão do construto falcão A um na placa do assoalho.Esta imagem mostra uma imagem em campo claro da aplicação dos sítios de injeção de Dai. Em uma preparação do tipo "livro aberto", Dai foi injetado em um padrão pontual próximo à margem lateral do livro aberto. No lado eletroretado, esta imagem mostra a visualização da expressão de GFP na mesma preparação, e aqui Dai é visualizado.Após três dias de difusão, deve ser possível visualizar as trajetórias dos axônios comissurais por microscopia fluorescente. As trajetórias normais de axônios crescerão em direção à placa do assoalho, atravessarão a placa do assoalho e então mudarão de direção e continuarão a crescer, conforme visto aqui.Fenótipos anormais decorrentes da diminuição da expressão gênica, como o mostrado aqui, podem ser comparados à trajetória arquetípica. No exemplo, alguns axônios estacionam na placa do assoalho ou tomam decisões errôneas de mudança de direção no lado contralateral. Ao tentar este procedimento, é importante ter cuidado e paciência durante todas as etapas delicadas de injeção e dissecção.Esses procedimentos exigem alguma prática. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como injetar plasmídeos de RNAi para investigar a função gênica durante o desenvolvimento do tubo neural de maneira específica a um tipo celular.

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