Name: Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Aprenda a usar eletroporação in ovo de plasmídeos baseados em microRNA para estudar orientação de axônios comissurais no tubo neural de embriões de galinha. Este método permite silenciamento gênico específico de tipo celular.

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Trabalho no laboratório do ES é apoiado pela National Science Foundation suíço. Gostaríamos de agradecer ao Dr. batida Kunz para a assistência com as filmagens.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
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<li>Boulland, J., Halasi, G., Kasumacic, N., Glover, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+Human+Stem+Cells+into+the+Chicken+Embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo.</a> J. Vis. Exp. (41), e2071(2010).</li>
<li>Kim, B. G., Dai, H. -N., McAtee, M., Vicini, S., Bregman, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+dendritic+spines+with+the+carbocyanine+dye+DiI+for+confocal+microscopic+imaging+in+lightly+fixed+cortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Labeling of dendritic spines with the carbocyanine dye DiI for confocal microscopic imaging in lightly fixed cortical slices.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162, 237-243 (2007).</li>
<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta simples, baseado em vectores de expressão artificial miRNA estratégia pode ser usada para knockdown expressão do gene endógeno no tubo neural frango. Estas ferramentas funcionais oferecer silenciamento de genes múltiplos, o controlo temporal e especificidade do tipo de célula, a fim de facilitar a elucidação das complexas vias de desenvolvimento. Em particular, foi demonstrado a utilidade destes plasmídeos em orientação axon comissural, uma vez que os plasmídeos podem ser usados ​​para genes distintos em knockdown ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> 0,5 milímetros capilares de vidro </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Vidro agulha extrator </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporator </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard elastómero de silicone </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Fio de tungstênio, 0,075 milímetros </td><td> Instrumentos de Precisão mundo </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Pinos de insetos, 0,20 milímetro </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Pinos de insetos, 0,10 milímetro </td><td> Belas Science Tools </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Tesoura Primavera </td><td> Ciência Fineols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont n º 5 fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 fórceps </td><td> Belas Science Tools </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Rápido DiI </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscópios fluorescentes </td><td> Olimpo </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

em eletroporação ovo de mirna-base de plasmídeos no tubo neural desenvolvimento e avaliação de fenótipos por dil injeção em livro aberto preparações

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Comissurais ED1 neurônios têm sido extensivamente estudadas para elucidar os mecanismos subjacentes a orientação axônio durante 1,2 desenvolvimento. Esses neurônios estão localizados na medula espinhal dorsal e enviar seus axônios ao longo de trajetórias estereotipados. Axônios comissurais inicialmente projetar ventralmente para e, em seguida, do outro lado da placa ventral. Depois de cruzar a linha média, esses axônios fazer uma curva acentuada rostral e projeto longitudinalmente para o cérebro. Cada uma dessas etapas é regulado pelas atividades coordenadas de pistas de orientação atrativas e repulsivas. A correta interpretação dessas pistas é fundamental para a orientação dos axônios ao longo de seu percurso demarcado. Assim, a contribuição fisiológica de uma molécula particular de orientação encontra-se idealmente axônio comissural investigado no contexto do embrião vivo. Por conseguinte, knockdown gene in vivo devem ser controlados com precisão, a fim de distinguir cuidadosamente actividades de orientação de axónios de genes que podem desempenhar múltiplaspapéis durante o desenvolvimento. Aqui, nós descrevemos um método para a expressão do gene knockdown no tubo neural galinha em uma célula de tipo específico forma rastreável. Usamos novos vectores plasmídicos 3 abrigar células específicas do tipo promotores / intensificadores que dirigem a expressão de um marcador de proteína fluorescente, seguido directamente por uma transcrição miR30 RNAi-4 (localizado dentro da 3&#39;-UTR do ADNc que codifica para a proteína fluorescente) ( Figura 1). Quando electroporado para dentro do tubo neural em desenvolvimento, estes vectores de eliciar downregulation eficaz da expressão do gene e expressar proteínas marcadoras fluorescentes brilhantes para permitir o rastreio directo das células experimentam knockdown 3. Misturando diferentes vetores de RNAi antes da electroporação permite que o knockdown simultânea de dois ou mais genes de regiões independentes da medula espinhal. Isto permite complexas interacções celulares e moleculares a serem examinados durante o desenvolvimento, de um modo que é rápido, sim, preciso e de baixo custo. Em combinação com Dil rastreamento de trajetórias axônios comissurais em livro aberto preparações 5, este método é uma ferramenta útil para estudos in vivo dos mecanismos celulares e moleculares do crescimento do axônio comissural e orientação. Em princípio, qualquer promotor / intensif icador poderiam ser utilizados, o que poderia tornar a técnica mais extensamente aplicável para estudos in vivo da função do gene durante o desenvolvimento 6. Este primeiro vídeo demonstra como manipular e ovos de janela, a injecção de plasmídeos de ADN para dentro do tubo neural e do procedimento de electroporação. Para investigar orientação axônio comissural, a medula espinhal é retirado do embrião como uma preparação de livro aberto, fixo, e injetado com Dil para permitir percursos de axónios a ser traçada. A medula espinal é montado entre lamelas e visualizadas por microscopia confocal.

Um método através do qual a expressão do gene no tubo neural pode ser downregulated em um tipo de célula específico forma rastreável é descrito. Demonstramos como<em&gt; In ovo</em&gt; Electroporação de microRNA baseados em plasmídeos que eliciam espaço-temporalmente controlada RNA de interferência pode ser utilizada para investigar a orientação do axónio comissural no tubo neural em desenvolvimento.

Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações

Os neurônios comissurais dI1 têm sido extensivamente estudados para elucidar os mecanismos subjacentes ao guia axonal durante o desenvolvimento1,2. Esses neurônios são ...

O objetivo deste procedimento é avaliar defeitos na orientação de axônios no tubo neural de embrião de galinha após a redução da expressão gênica de maneira rastreável e específica para um tipo celular. Isso é realizado preparando ovos de galinha fertilizados para eletroporação in ovo, fazendo uma janela na casca do ovo. O segundo passo consiste em injetar e eletroporar construtos de DNA que codificam microRNAs no tubo neural.Em seguida, as medulas espinhais eletroporadas são dissecadas e fixadas em preparações planas do tipo "livro aberto". O passo final consiste na injeção de um corante fluorescente para visualizar as projeções axonais. Por fim, utiliza-se microscopia fluorescente para demonstrar tanto as células submetidas ao silenciamento gênico quanto para avaliar os efeitos subsequentes na orientação dos axônios comissurais.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é o silenciamento gênico específico de tipos celulares. Para preparar os plasmídeos, consulte o protocolo escrito para obter instruções. Incube os ovos a 38,5 graus Celsius e cerca de 45% de umidade até que o estágio desejado de desenvolvimento seja atingido. Para estudar o direcionamento

in-ovo-electroporation-mirna-based-plasmids-developing-neural-tube

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Neurociência

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Na eletroporação útero permite a entrega rápida em um gene espacialmente e temporalmente maneira controlada no desenvolvimento do sistema nervoso central (SNC). Aqui nós descrevemos um adaptável altamente in utero protocolo de eletroporação que pode ser usado para entregar constrói expressão em vários domínios embrionário do SNC, incluindo o telencéfalo diencéfalo e retina.

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Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

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Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

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Desenvolvemos uma nova abordagem de perda de função que envolve a introdução e integração genômica de sequências artificiais de micro-RNA em embriões de pintinhos usando eletroporação em ovo e o sistema transposon Tol2. Esta técnica fornece uma metodologia robusta e estável de knockdown gênico para estudos da função gênica durante o desenvolvimento.

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Neste protocolo, descrevemos como injetar a cavidade amniótica do camundongo no E7.5 com lentivírus, levando à transdução uniforme de toda a placa neural, com efeitos mínimos prejudiciais sobre a sobrevivência ou desenvolvimento embrionário.

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Aprenda a usar eletroporação in ovo de plasmídeos baseados em microRNA para estudar orientação de axônios comissurais no tubo neural de embriões de galinha. Este método permite silenciamento gênico específico de tipo celular.

Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações (Vídeo) | JoVE Journal

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