O inseto Galleria mellonella Como um modelo de infecção poderosa para investigar Patogênese Bacteriana

O objetivo geral deste procedimento é infectar as larvas de insetos Galleria melanoma com bactérias patogênicas. Para fazer isso, as larvas de insetos são eliminadas para o estágio de crescimento apropriado e uma solução bacteriana é preparada. A larva então infectada com a bactéria por injeção intra-hemofílica ou forçada A mortalidade larval da alimentação é então monitorada por um período de 48 horas.

A análise dos dados resultantes descreve a virulência bacteriana em um modelo de infecção de inseto. Os insetos apresentam a vantagem de ter um sistema avançado de defesas antimicrobianas e, em particular, possuem um sistema imunológico inato complexo, portanto, evite o custo e as questões éticas que podem ser encontradas ao usar modelos de mamíferos. Os insetos fornecem um ótimo modelo alternativo para infecção de mamíferos.

Trabalhamos com as larvas da mariposa-da-cera G Mee, que são relativamente grandes e podem ser usadas para estudos de infecção realizados entre 15 e acima de 37 graus. Para imitar um ambiente de mamíferos, Carina NI demonstrará o procedimento de criação e Elizabeth GME e Christophe Beon demonstrarão os protocolos de infecção. Todo o ciclo do ovo ao último nas larvas das estrelas dura cerca de cinco semanas.

A 25 graus Celsius, são necessárias uma ou duas semanas adicionais para obter borboletas adultas. As borboletas machos medem de 10 a 15 milímetros. A mariposa macho adulta é bege com manchas claras e escuras fracas.

As borboletas fêmeas medem cerca de 20 milímetros. As fêmeas são mais escuras do que os machos com uma cor marrom a cinza colocam pelo menos 100 borboletas de melanoma genético adulto puy ou recém-fundidas. Em uma gaiola de malha de arame de cinco litros, suspenda dois pacotes de papel de quatro camadas na gaiola para a postura dos ovos.

Após dois dias, a fêmea adulta põe ovos na borda entre os papéis duas vezes por semana. Coloque as embalagens de papel para ovos em novas caixas plásticas de criação com grades para permitir a circulação do ar. As caixas devem conter pólen e cera de abelha como fonte de alimento.

Os ovos eclodem em cerca de três dias e pequenas larvas começam a se desenvolver alimentando-se de cera e pólen para fornecer uma proporção adequada de alimento por lava. Separe regularmente as larvas em novas caixas e reabasteça a comida a cada dois dias. As larvas são criadas durante os seis estágios do estádio de larvas.

Cada estádio é caracterizado pelo deslizamento da cápsula da cabeça das larvas. Quando as larvas atingiram o último estágio antes da pação, elas pararam de se alimentar e começaram a construir um casulo de seda leve em seus casulos protetores. As larvas descansarão e se transformarão em púbis. Cera.

Os vermes permanecem no estágio de cocô por uma a duas semanas para emergir em mariposas adultas. As mariposas adultas não bebem nem comem. O acasalamento ocorre e o ciclo de vida dos vermes de cera começa novamente.

Para padronizar o ensaio anatomopatológico, pegue as larvas durante o último estágio larval. Durante esta fase, eles param de se alimentar, passam para a tampa da caixa de criação e começam a produzir seda. Este estágio dura cerca de cinco dias, após os quais as larvas começam a encolher.

O casulo torna-se mais espesso e as larvas se cristalizam. A qualquer momento durante o estágio larval, remova o casulo de seda nascente. Selecione por último as larvas de estrelas, que têm de dois a três centímetros de comprimento e 180 a 250 miligramas de peso, 24 horas antes da infecção e coloque-as em uma caixa vazia para matá-las de fome.

As suspensões de Priscilla, bacterianas ou de esporos são preparadas conforme descrito no documento anexo em concentrações finais, variando de 10 a quatro unidades formadoras de colônias por mililitro a 10 a oito unidades formadoras de colônias por mililitro. Cada lava receberá 10 microlitros de suspensão na concentração desejada Para preparar a cultura de toxina C cry one B, a cepa CI 4 0 7 se transformou com o plasmídeo PHTF 31 C, carregando o gene que codifica cry one C em 100 mililitros, meio HCT com 10 miligramas por mililitro, eritromicina e 30 graus Celsius por 72 horas. Isso permitirá a toxina de esporulação completa, a produção de cristais e a liberação no estado de cultura.

Para purificar os cristais da cultura bacteriana, prepare um gradiente de sacarose em um tubo de 40 mililitros. Primeiro, adicione 17 mililitros de 79% de sacarose. Em seguida, coloque cuidadosamente 17 mililitros de sacarose 72% em cima da sacarose 79%.

Finalmente, coloque de cinco a seis mililitros da cultura de esporulado concentrado 10 X e feche o tubo, centrifugue o tubo por 14 horas a 20.000 vezes G a quatro graus Celsius para separar os cristais dos esporos. Os cristais de toxina se depositarão na interface do gradiente, enquanto os esporos densos atingirão o fundo do tubo. Use uma pipeta para coletar os cristais e centrifugue 20.000 vezes.

G. Após a rotação, suspenda a paleta de cristais em 25 mililitros de água fria e estéril para lavá-la centrifugue a 8.000 vezes G. Esta etapa é repetida três vezes para remover toda a sacarose grudada nos cristais. Após o isolamento do cristal, suspenda novamente os cristais em cinco mililitros de água estéril e observe ao microscópio. Para avaliar a pureza, avaliar a concentração de proteína da toxina pela coloração clássica de Bradford em solução cristalina pré-solubilizada em hidróxido de sódio 50 milimolar.

A toxina pode ser armazenada a menos 20 graus Celsius antes do uso. Em seguida, os insetos serão injetados com a solução bacteriana. Para cada condição, encha uma seringa hipodérmica de um mililitro por condição com 300 microlitros de água ou a solução bacteriana para a infecção de 20 a 25 larvas.

Remova as bolhas batendo cuidadosamente na seringa. Em seguida, coloque uma agulha de 0,45 por 12 milímetros na seringa. Coloque a seringa em uma bomba de seringa automatizada com velocidade de ajuste de um microlitro por segundo e configure o volume de 10 microlitros.

Execute uma injeção em branco de 10 microlitros em um tubo vazio para controlar o volume injetado. Coloque o inseto manualmente entre o polegar e o indicador. Em seguida, insira a agulha fixada no injetor na pele de lava ou cutícula na base da última prola e injete 10 microlitros da solução bacteriana.

Remova cuidadosamente o inseto da agulha. Coloque o inseto infectado em uma placa de Petri de cinco centímetros. Cinco larvas por prato, infectar pelo menos 20 larvas para cada condição experimental, colocar os pratos a 37 graus Celsius em uma incubadora.

Os insetos também podem ser infectados por via oral, conforme demonstrado nesta seção do vídeo em um tubo de fendor de dois mililitros. Misture 0,2 microgramas por microlitro de toxina criogênica C com esporos ou suspensão de células vegetativas para obter concentrações finais variando de três vezes 10, três a uma vez 10, seis por enchimento de 10 microlitros, seringa de um litro equipada com uma agulha hipodérmica de calibre 30 e 25 milímetros com 300 microlitros do choro bacteriano. Uma solução de toxina C para a infecção de 20 a 25 larvas.

Retire as bolhas da seringa, coloque manualmente o inseto de forma que sua boca entre na agulha fixada no injetor e alimente-o à força com 10 microlitros da solução bacteriana. Usando a bomba de seringa automatizada após a injeção oral, a solução se espalhará no intestino do inseto. Neste exemplo, são introduzidos 10 microlitros de solução de corante azul.

Observe que o corante preenche rapidamente o lúmen intestinal das larvas do inseto Depois que o inseto ingeriu a solução, coloque-a em uma pequena placa de Petri de cinco centímetros, infecte pelo menos 20 larvas para cada condição experimental, coloque cinco larvas em cada placa Após experimentos de alimentação forçada ou injeção. Mantenha as larvas na placa de Petri sem comida a 25 graus Celsius ou 37 graus Celsius, verifique a mortalidade larval regularmente. Durante um período de 48 horas, as larvas mortas são marrons a pretas e móveis desconhecidas.

No final dos experimentos, libere todas as larvas e vivas a menos 20 graus Celsius por 24 horas em uma bolsa autoclavável e, em seguida, autoclave-as para matar todas as bactérias. Analise os dados de mortalidade usando um software de broca de log prob ou software similar. Este programa testa a linearidade das curvas de mortalidade de dose e fornece doses letais.

A injeção intra-hemofílica de LD 50 de bactérias em g Melan provou ser muito útil para a identificação de muitos fatores de virulência que lidam com danos teciduais e resistência a fatores imunes inatos de vários patógenos humanos para determinar o papel da potencial parede celular bacteriana Peptidase C-W-P-F-M na mortalidade de insetos de virulência, após várias doses de cepas selvagens e mutantes de bactérias BOUs foram avaliadas conforme mostrado aqui. A mortalidade de insetos foi dependente da dose, mas diminuiu significativamente quando as larvas receberam a bactéria com CWP fm mutante. Assim, esta peptidase da parede celular desempenha um papel crucial durante a virulência séria da priscilla em relação às larvas de insetos para demonstrar o efeito sinérgico dos esporos de bether na atividade inseticida da toxina cryo one C crio one c cristais foram adicionados aos esporos da cepa selvagem de bether e alimentados com Galleria.

Melanoma beis sem cristais foram usados como controle. Após 48 horas a 25 graus Celsius, a mortalidade das larvas foi avaliada conforme mostrado neste gráfico, a taxa de mortalidade após a ingestão de mistura de toxinas de esporos é significativamente aumentada em relação à taxa de mortalidade após a ingestão de crio uma toxina C ou apenas a ingestão de esporos. Isso demonstra um efeito sinérgico, os esporos ou bactérias vegetativas na atividade inseticida da toxina criogênica C.

O papel da criogenia one C no melanoma Galleria é ajudar as bactérias que passam pela matriz paraatrófica, uma estrutura rica em quitina e muco que protege o intestino dos insetos do contato direto com alimentos e patógenos. O uso de insetos, especialmente no estágio de nível como modelos de infecção para diversos patógenos, está se tornando cada vez mais comum. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar infecções orais e hemel, e chamamos a mortalidade de insetos em gálio melan.

Esses métodos podem ser facilmente aplicados a outros sistemas modelo, como espécies bombex, ma e spotter, uma vez que esses genomas foram sequenciados, de modo que os hospedeiros podem ser desligados por métodos de RNA ou outras manipulações de genes.