₁ F _Ó ATPase Vesicle Preparação e Técnica para Execução de Remendo Recordings Grampo de membranas de vesículas submitocondriais

O objetivo geral deste procedimento é isolar as vesículas F1 F zero APAs do cérebro de ratos para realizar gravações de patch clamp. Isso é feito primeiro removendo o cérebro de um rato e homogeneizando-o. O segundo passo é interromper as zonas sinápticas aplicando pressão.

Em seguida, o sinaptossomo é colocado em camadas nos gradientes do frasco. A etapa final é incubar com toin de dígito e L para obter as vesículas finais para gravação de patch clamp. Uma função importante das mitocôndrias é a produção de TP por fosforilação oxidativa.

A enzima responsável pela produção de TP é a A TP sintase localizada na membrana interna mitocondrial. Para estudar a função da A TP sintase em detalhes, isolamos vesículas submitocondriais especiais que chamamos de SMVs. Eles contêm a enzima A TP sintase em uma configuração de dentro para fora.

Em seguida, registramos esses SMVs com um eletrodo de patch clamp e determinamos o vazamento de sua membrana. Isso nos diz sobre a eficiência de uma produção de TP pelas mitocôndrias. Demonstrando esse procedimento hoje estará Sylvia ti, pós-doutoranda em meu laboratório na Universidade de Yale.

Neste procedimento, após obter a cabeça de um rato por decapitação, corte a pele para expor o crânio e, em seguida, abra o crânio suavemente, cortando-o com uma tesoura ou Rons. Posteriormente, remova o cérebro, pique o cérebro sem o cerebelo finalmente isolado, tampone e, em seguida, transfira-o para um homogeneizador de vidro de Teflon de cinco mililitros e homogeneize suavemente o tecido 10 vezes, aproximadamente cinco minutos no total. Depois disso, centrifugue a amostra a 1.500 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada.

Salve o sobrenadante com mitocôndrias e sinaptossomo e descarte o pellet. Em seguida, centrifugue novamente a 16.000 vezes, G por 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada. Em seguida, descarte o sobrenadante e ressuspenda o palato Em 500 microlitros de tampão de isolamento, interrompa o sinaptossomo com um vaso de ruptura celular aplicando uma pressão de 1.200 PSI por 10 minutos, seguido por uma camada de descompressão rápida das zonas de sinaps interrompidas nos tubos de centrífuga com duas concentrações diferentes de fial que formarão duas camadas.

Em seguida, coloque os tubos em um rotor SW 50.1 e centrifugue a 126.500 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em uma ultracentrífuga, o palato é a mitocôndria purificada. A camada entre as diferentes densidades de fial é o sinaptossomo ininterrupto.

Em seguida, lave o pellet centrifugando isoladamente. Tampão a 16.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada. Agora Resus, suspenda as mitocôndrias em 200 microlitros de tampão de isolamento, combinado com um volume igual de 1% de toína de dígitos.

Coloque no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione mais isolamento, tampão e centrifugue a 16.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Repita este procedimento duas vezes, depois ressuspenda o palato em 200 microlitros de tampão de isolamento e adicione dois microlitros de sutiã 10%Lu, PX, misture e coloque no gelo por 15 minutos.

Depois disso, coloque a mistura isoladamente, tampone nos tubos da centrífuga. Coloque os tubos em um rotor SSW 50.1 e centrifugue-o a 182.000 vezes G a quatro graus Celsius por uma hora. Depois de uma hora.

Lave a paleta final centrifugando-a em tampão isolado a 16.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Um equipamento típico de eletrofisiologia inclui um amplificador, um computador PC equipado com um digi data 1, 440, uma interface de conversor analógico para digital em conjunto com braçadeira P, manipuladores de software 10.0, um microscópio, uma mesa de isolamento de vibração e uma gaiola de Faraday. Primeiro, puxe uma pipeta de um tubo capilar de vidro de silicato Boros em um micro extrator de pipeta marrom flamejante.

A resistência ideal da pipeta deve estar entre 80 e 100 mega ohm. Adicione as vesículas submitocondriais em uma solução intracelular fisiológica. Em seguida, encha uma pipeta de grampo de remendo com a mesma solução.

Visualize as vesículas sob contraste de fase. Microscopia após SMVs serem corrigidos à temperatura ambiente. Registre a atividade quando o potencial de membrana é mantido na tensão variando de 100 milivolts negativos a 100 milivolts positivos por 10 segundos cada período.

Os dados registrados são filtrados em cinco kilohertz usando o circuito do amplificador e analisados com o software clamp fit 10.0. Esta figura mostra a mancha de lisado preparada a partir do citosol e das mitocôndrias. O painel superior mostra um immunoblot usando um anticorpo contra a proteína citosólica GA dh.

O painel inferior mostra uma mancha usando um anticorpo contra a proteína da membrana interna mitocondrial. Cox quatro Aqui estão duas gravações representativas de patch clamp antes e depois da adição de um milimolar a TP. O potencial de retenção é positivo em 70 milivolts. A linha tracejada representa zero picoamperes.

Cada traço é registrado por 10 segundos e há 10 segundos entre os traços e mostrados. Aqui estão os traços de exemplo das mudanças de intensidade de fluorescência do indicador A CMA ao longo do tempo na presença de SMVs e na ausência e presença de um TP. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar mitocôndrias, uma vesícula submitocôndria contendo F1 FO 80 TP Synthes. Além disso, você deve entender a vedação resistente à forma I com um eletrodo na membrana da vesícula para analisar a atividade do canal do Complexo A TP Syntase.