Name: 1 F Ó ATPase Vesicle Preparação e Técnica para Execução de Remendo Recordings Grampo de membranas de vesículas submitocondriais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprenda a isolar vesículas sub-mitocondriais contendo F1FO ATPase de cérebro de rato para gravações de patch clamp. Este método permite estudar a atividade e modulação do complexo ATP sintase mitocondrial.

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1. Cérebro mitocondrial Isolation (Adaptado de Brown MR et al. 9) <ol><li> Sacrificar o rato usando métodos aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC). </li><li> Corte a cabeça do animal por decapitação, cortar a pele e expor o crânio. </li><li> Abra o crânio delicadamente cortando com uma tesoura ou rongeur. Remover o cérebro. </li><li> Picar finamente o cérebro sem cerebelo em tampão de isolamento (ver Tabela 1) e transferi-lo para a 5 ml de vidro / teflon homogeneizador (veja lista de equipamentos). </li><li> Homogeneizar o tecido suavemente 10 vezes (sem bolhas), cerca de 5 min. </li><li> Centrifugar amostra a 1500 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada. </li><li> Salve o sobrenadante (mitocondrial e sinaptossomas) e descartar o pellet (material nuclear e de restos celulares). Centrifugar a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada. </li><li> Descartarsobrenadante e re-suspensão da pelota em 500 ul de tampão de isolamento. Disrupt sinaptosomas com uma embarcação rompimento celular (veja lista de equipamentos). Aplicar uma pressão de 1200 psi, durante 10 min, seguido por descompressão rápida. </li><li> Camada a mistura em gradientes de Ficoll (ver Tabela 2), em lugar do rotor SW-50.1 e centrifugar a 126.500 x g durante 20 min a 4 ° C numa ultracentrifugadora (ver lista de equipamento). O sedimento é purificado a mitocôndria, a camada entre as diferentes densidades de Ficoll sinaptossomas é ininterrupto. </li><li> Lavar pelete por centrifugação em tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada. </li></ol> 2. Submitocondriais vesículas (SMV) Isolamento (Adaptado de Chan et al. 10) <ol><li> Re-suspender as mitocôndrias em 200 ul de tampão de isolamento combinada com um volume igual de 1% de digitonina e permitir a sentar-se em gelo durante 15 min. </li><li> Adicionar mais isolamento Buffer e centrifugar a 16000 x g durante 10 min a 4 ° C numa centrífuga de bancada. Faça isso duas vezes. </li><li> Re-suspender o pellet em 200 mL tampão de isolamento e adicionar 2 mL de 10% Lubrol PX (C12E9). Misture e permitir a sentar-se no gelo durante 15 min. </li><li> Camada de mistura em tampão de isolamento, no lugar do rotor SW-50.1 e centrifugar a 182.000 x g a 4 ° C durante 1 hora. </li><li> Lavagem final dos aglomerados por centrifugação numa centrífuga de mesa superior em tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 min a 4 ° C. </li></ol> 3. A gravação eletrofisiológico <ol><li> Um equipamento típico electrofisiologia inclui um amplificador, um computador PC 1440A equipado com um interface de conversor de analógico para digital Digidata em conjunto com o software pClamp10.0, manipuladores, um microscópio, uma mesa de isolamento de vibrações, gaiola de Faraday. </li><li> Tubos capilares de vidro de borosilicato são inseridos em um Flaming / Brown Micropipeta Puller modelo P-87. Um programa de pipeta-extrator é otimizado paragerar pipetas com resistências entre 80 a 100 mohms. </li><li> SMVs são colocadas numa solução fisiológica intracelular (ATP é adicionado no momento apropriado, durante a gravação) (Tabela 3). Patch clamp pipetas são cheias com a mesma solução (sem ATP). As gravações são feitas através da formação de um selo giga-ohm para SMVs à temperatura ambiente. As vesículas são visualizadas por microscopia de contraste de fase com um microscópio invertido Nikon ou Zeiss. </li><li> O potencial de membrana é mantida a tensões que variam de -100 mV a +100 mV, por períodos de 10 segundos. As gravações são filtradas em 5 kHz utilizando os circuitos de amplificador. Nível de ruído elétrico ou não-específico de rua de menos de 1 pA são desejáveis ​​para a gravação bem sucedida. </li><li> Os dados são analisados ​​com o software Clampfit 10.0, por exemplo, para determinar a frequência e amplitude de eventos de canal único. Dependência de tensão é determinado traçando uma relação de tensão atual. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Os métodos aqui descritos permitem o isolamento de mitocôndrias puro no fim da etapa 1 e vesículas (submitocondriais SMVs) após a etapa 2 a partir de cérebro inteiro sem distinção de célula phenotypes.SMVspurified por este método são essencialmente isentos de contaminação por outros organelos subcelulares, como mostrado na A Figura 1 e o nosso trabalho anterior (Alavian KN et al. 8) e mantêm a sua integridade estrutural e funcional antes da congelação. Após congelação e descongelação...

<table><tbody><tr><td>Moedor de Tecidos Potter-Elvehjem com Pistilo de PTFE</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Vaso de Ruptura Celular 4639</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de policarbonato</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>Rotor SW-50.1 </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga L8-70M</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulador</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro borossilicato</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de Micropipetas Flaming/Brown Modelo P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; Ó</sub&gt; atpase vesicle preparação e técnica para execução de remendo recordings grampo de membranas de vesículas submitocondriais

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

As mitocôndrias são envolvidos em várias funções celulares importantes incluindo o metabolismo, uma sobrevivência, desenvolvimento e, a sinalização de cálcio 2. Duas das mais importantes funções mitocondriais estão relacionadas com a produção eficiente de ATP, a moeda de energia da célula, pela fosforilação oxidativa, e na mediação de sinais para a morte programada das células 3. A enzima primariamente responsável pela produção de ATP é a F1FO-ATP sintase, também chamada ATP sintase 4-5. Nos últimos anos, o papel da mitocôndria na morte celular por apoptose e necrose tem recebido uma atenção considerável. Na morte celular por apoptose, Bcl-2, tais como as proteínas da família Bax entrar na membrana mitocondrial externa, e oligomerizar permeabilizar a membrana externa, libertando factores pró-apoptóticos para o citosol 6. Na morte celular necrótica clássico, tal como a produzida por isquemia ou excitotoxicidade em neurónios, um large, aumento pouco regulada em matriz de cálcio contribui para a abertura de um poro da membrana interior, a poro de transição da permeabilidade mitocondrial ou PTPm. Este despolariza a membrana interna e provoca deslocamentos osmóticos, contribuindo para a ruptura da membrana externa, a libertação de factores pró-apoptóticos e disfunção metabólica. Muitas proteínas, incluindo Bcl-xL 7 interagir com F1FO ATP sintase, modulando a sua função. Bcl-xL, interage directamente com a subunidade beta da sintase ATP F1FO, e esta interacção diminui uma condutância de vazamento dentro do F1FOATPasecomplex, aumentando a rede de transporte de H + por F1FO durante F1FO ATPase 8 e aumentando assim a eficiência mitocondrial. Para o estudo da atividade e modulação da ATP sintase, que isolado do cérebro de roedores submitocondriais vesículas (SMVs) contendo F1FO ATPase. Os SMVs manter a integridade estrutural e funcional do F1FO ATPase como mostrado na Alavian et ai. Aqui, nós descrevemos um métodoque temos utilizado com sucesso no isolamento de SMVs de cérebro de rato e delinear a técnica de patch clamp para analisar a actividade de canal (ião vazamento condutância) dos SMVs.

O primeiro passo do nosso protocolo permite o isolamento de mitocôndrias purificadas como mostrado por Western blot na figura 1. Na Figura 2 é mostrado um exemplo de uma gravação de remendo vesícula submitocondriais derivado do cérebro. Usando a configuração de patch de dentro para fora, demonstramos a atividade do canal modulado pela ATP. O controle (CTL) de gravação (esquerda) mostra a atividade multi-canal de condutância com uma condutância pico de 600 pS em média. que foi imediatame...

Um método para isolar vesículas submitocondriais enriquecidas em F1FO ATP sintase a partir de complexos de cérebro de rato é descrito. Essas vesículas permite o estudo da actividade de F1FO complexo ATPase ea sua modulação por meio da técnica de gravação de patch clamp.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; Ó</sub&gt; ATPase Vesicle Preparação e Técnica para Execução de Remendo Recordings Grampo de membranas de vesículas submitocondriais

As mitocôndrias estão envolvidas em muitas funções celulares importantes, incluindo o metabolismo, a sobrevivência1, o desenvolvimento e a sinalização de cálcio2. Duas das mais...

O objetivo geral deste procedimento é isolar vesículas F1 F zero APAs do cérebro de rato para realizar gravações por patch clamp. Isso é realizado primeiramente removendo o cérebro de um rato e homogeneizando-o. O segundo passo é romper as zonas sinápticas aplicando pressão.Em seguida, os sinaptossomos são depositados sobre os gradientes de frasco. O passo final é a incubação com digitonina e L para obter as vesículas finais para gravação por patch clamp. Uma função importante das mitocôndrias é a produção de TP por fosforilação oxidativa.A enzima responsável pela produção de TP é a ATP sintase localizada na membrana interna mitocondrial. Para estudar em detalhes a função da ATP sintase, isolamos vesículas submitocondriais especiais que chamamos de VSMs. Elas contêm a enzima ATP sintase em uma configuração invertida (lado interno para fora).Em seguida, registramos esses PPM com um eletrodo de grampo de patch e determinamos a vazão de sua membrana. Isso nos informa sobre a eficiência da produção de TP pelas mitocôndrias. Demonstrando este procedimento hoje será Sylvia Ti, pesquisadora pós-doutoranda no meu laboratório na Universidade de Yale.Neste procedimento, após obter a cabeça de uma rata por decapitação, corte a pele para expor o crânio e, em seguida, abra o crânio suavemente cortando-o com uma tesoura ou Rons. Posteriormente, remova o cérebro, pique o cérebro sem o cerebelo finalmente isolado, tamponado, e então transfira-o para um homogeneizador de vidro e teflon de cinco mililitros, homogeneizando o tecido suavemente 10 vezes, aproximadamente cinco minutos no total. Depois disso, centrifugue a amostra a 1.500 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada.Guarde o sobrenadante com mitocôndrias e sinaptossomos e descarte o precipitado. Em seguida, centrifugue novamente a 16.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada. Depois, descarte o sobrenadante e re-suspenda o precipitado em 500 microlitros de tampão de isolamento. Rompa os sinaptossomos com um recipiente de disruptura celular aplicando uma pressão de 1.200 PSI durante 10 minutos, seguida por descompressão rápida. Deposite as zonas sinápticas disruptadas sobre tubos de centrífuga contendo duas concentrações diferentes de fial, que formarão duas camadas.Em seguida, coloque os tubos em um rotor SW 50.1 e centrifugue a 126.500 ×g por 20 minutos a quatro graus Celsius. Em uma ultracentrífuga, o pellet corresponde às mitocôndrias purificadas. A camada entre as diferentes densidades do fial é o sinaptossomo não rompido.Posteriormente, lave o pellet por centrifugação no tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga de bancada. Agora, ressuspenda as mitocôndrias em 200 microlitros de tampão de isolamento, combinado com um volume igual de digitonina 1%.Coloque-o no gelo por 15 minutos. Em seguida, adicione mais tampão de isolamento e centrifugue a 16.000 ×g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Repita este procedimento duas vezes, depois re-suspenda o pellet em 200 microlitros de tampão de isolamento e adicione dois microlitros de 10% Lu bra, PX, misture e coloque no gelo por 15 minutos.Após isso, sobreponha a mistura no tampão de isolamento nos tubos de centrífuga. Coloque os tubos em um rotor SSW 50.1 e centrifugue a 182.000 ×g a quatro graus Celsius por uma hora. Após uma hora.Lave a paleta final por centrifugação no tampão de isolamento a 16.000 × g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Um equipamento típico de eletrofisiologia inclui um amplificador, um computador PC equipado com um Digi Data 1.440, uma interface conversora analógico-digital em conjunto com o software P-Clamp 10.0, manipuladores, um microscópio, uma mesa de isolamento de vibrações e uma gaiola de Faraday. Primeiro, puxe uma pipeta a partir de um tubo capilar de vidro borossilicato em um puxador de micropipetas tipo flaming brown.A resistência ideal da pipeta deve estar entre 80 e 100 mega ohms. Adicione as vesículas submitocondriais em uma solução intracelular fisiológica. Em seguida, preencha uma pipeta para grampo de patch com a mesma solução.Visualize os vesículos em contraste de fase. Microscopia após os SMVs serem selados à temperatura ambiente. Registre a atividade quando o potencial da membrana for mantido na faixa de menos 100 milivolts a mais 100 milivolts durante 10 segundos em cada período.Os dados registrados são filtrados em cinco quilohertz utilizando a circuitaria do amplificador e analisados com o software ClampFit 10.0. Esta figura mostra a chapa de lisado preparado a partir do citosol e mitocôndrias. O painel superior mostra um imunoblot utilizando um anticorpo contra a proteína citosólica GA dh.O painel inferior mostra uma eletroforese usando um anticorpo contra a proteína da membrana interna mitocondrial. Cox quatro Aqui estão duas gravações representativas de patch clamp antes e após a adição de um milimolar de ATP. O potencial de retenção é de mais 70 milivolts. A linha tracejada representa zero picoampères.Cada traçado é registrado durante 10 segundos, com intervalos de 10 segundos entre os traçados. Abaixo estão exemplos de traçados mostrando as alterações na intensidade de fluorescência do indicador CMA ao longo do tempo, na presença de VSMs e na ausência ou presença de TP. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar mitocôndrias e vesículas submitocondriais contendo a ATP sintase F1 FO 80 TP. Além disso, você deverá compreender como formar um selo resistente do tipo "gigaseal" com um eletrodo na membrana da vesícula, a fim de analisar a atividade do canal da complexo ATP sintase.

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Neurociência

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