Name: Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprenda a ajustar diariamente um citômetro de massa CyTOF para análise de células únicas. Este protocolo demonstra otimização de sinal, preparo de amostras e procedimentos de limpeza para garantir aquisição confiável de dados.

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Gostaríamos de agradecer ao Dr. Evan Newell e Dr. Sean Bendall para o gabarito. Gostaríamos também de agradecer a DVS Ciências e Dr. Sean Bendall para uma amostra das contas Multi-lantanídeos contendo poliestireno. Estamos gratos pelo financiamento do NIH concessão 2 U19 AI057229.

Todas as amostras de células para a CyTOF devem ser fixadas e permeabilizadas. Isto permite uma maior entrada do intercalador de ADN contendo irídio, e também evita que a lise das células durante a lavagem com água MilliQ e ressuspensão passos imediatamente antes de proceder à injecção no citómetro de massa. 1. Start-up da Citómetro Massa <ol><li> Abra o programa de software CyTOF. Selecione Configuração do instrumento. Na guia do gabinete, ir para o canto inferior direito e clique aquecedor &quot;ON&quot; botão. Ligar o aquecedor, pelo menos, 15 min antes do momento desejado para permitir tempo suficiente para que o manto da câmara de pulverização para alcançar 200 ° C. </li><li> Substituir o branco Norm Ject-seringa de 3 ml na bomba de seringa, com uma seringa cheia de água fresca MilliQ. </li><li> Limpeza nebulizador. Backflush o nebulizador usando a seringa eo tubo de puxar 5% citranox 2-3 vezes por meio da porta tanto menor a introdução de líquidos e a porta de maior introdução de gás. Repita retrolavagem com água MilliQ to Remover citranox residual. </li><li> Verificar para confirmar que as luzes no painel frontal do CyTOF são iluminadas, como na Figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig1.jpg" /> Figura 1. CyTOF luzes do painel antes de inicialização. <ol start="5"><li> Abra argônio válvula do tanque de gás. Isso deve fazer com que o &quot;ARGON&quot; luz na frente para ligar. </li><li> Fixe o nebulizador para make-up de entrada de gás. Desaparafuse o make-up conector tubulação de gás e remover o preto de borracha o-ring ea peça cônica de plástico branco. Note-se a maior &quot;junta&quot; na haste porta gás introdução do nebulizador. Coloque o conector na porta de introdução de gás. Colocar o anel em O preto sobre a extremidade da porta de gás, e forçar o o-ring passado a parte mais larga da haste da porta. Coloque a peça cónica de plástico branco na parte superior com a parte mais estreita apontou, e parafuso para a tubulação de gás make-up. </li><li&gt; Coloque o nebulizador para o tubo de introdução de líquidos. Insira cuidadosamente o tubo pequeno dentro da abertura na extremidade do nebulizador. Haverá duas paradas, semelhantes em sentir as paradas em uma micropipeta. Primeiro, prima até encontrar resistência à luz, a extremidade do tubo deve ser pequeno, no final da secção recta de vidro. Em segundo lugar, pressionar mais difícil de forçar o fim da secção recta de vidro ainda mais no encaixe, e apertar o parafuso de montagem para selar. Inserir a extremidade do nebulizador para a abertura branco no manto de aquecimento. </li><li> No separador Controlador RFG da janela Configuração do Instrumento, pressione &quot;Start Plasma&quot;. Desde o nebulizador já está inserido, pressione &quot;OK&quot;. O software irá ligar o chiller, iniciar o fluxo de gás, e inflamar um plasma. A tensão detector irá aumentar. Haverá uma janela pop-up dizendo &quot;Plasma seqüência de inicialização foi concluído com êxito&quot; quando terminar, pressione &quot;OK&quot;. Novas luzes deve ser em no painel frontal (Figura 2 </strong<html> &gt;). </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig2.jpg" /> Figura 2. Luzes do painel de plasma CyTOF após inflamado e start-up com êxito. <ol start="9"><li> Ligar bomba de seringa. No canto superior direito, pressione o verde &quot;play&quot; para iniciar a bomba de seringa e começar a fluir líquido através do tubo e pulverização fora do nebulizador. As configurações de seringa padrão são de 3 ml de água. Para que amostra a fluindo através do loop de amostra, a bomba de seringa devem ser periodicamente alterada quando ele é executado fora de água. Na parte superior do ecrã, existe um contador que indica a quantidade de líquido fluiu para fora da bomba de seringa. A bomba de seringa parará quando o contador atingir &quot;3,000&quot; ou o êmbolo atinge a extremidade da seringa. Ao recarregar a seringa, você deve clicar em &quot;stop&quot; em vez do azul &quot;pausa&quot; botão para reiniciar o contador. </li></ol>e &quot;&gt; 2 de Calibração. Diário do Citómetro Massa <ol><li> O citômetro de massa vai precisar de aproximadamente 20 minutos para conseguir um plasma quente e estável antes de calibração. O objectivo dos passos de sintonia é maximizar o sinal desejado do Tm169 ou Tb159, mantendo &quot;Gd155&quot; (óxido; La139 + O16) de sinal inferior a 3% do valor mais elevado. Clique na Aquisição botão Configurações para abrir a janela Configurações de Aquisição de Dados. Na guia Parâmetros, clique na tabela periódica para abrir o painel de seleção de isótopo. Selecione os isótopos na solução de ajuste DVS Ciências listados no manual, em seguida, clique em &quot;salvar&quot;. </li><li> Clique nos Isótopos por leitura botão para abrir a Massa (s) por janela de leitura. Selecione &quot;Pulsos Count&quot;, e redimensionar o eixo-y, digitando um novo número e pressionar &quot;enter&quot;. </li><li> Encha uma seringa de 1 ml verde Norm-Ject com solução de sintonia. Rode o selector de porta amostra para &quot;carregar&quot;, injetar 450 ml de solução de sintonia, ligue o selector para &quot;injetar&quot;. Na guia Calibração de Missa do Acquisit Dados<html> íon janela Configurações, pressione &quot;Executar&quot; para monitorar o que as massas estão fluindo por. O lado esquerdo da janela é menor massa, enquanto que o lado direito é mais elevada em massa. Nota: existirão sinais na região de 9400-9800 TOF, devido aos isótopos de xénon no gás árgon (Figura 3). Espere até que os isótopos de soluções de afinação começam a aparecer como faixas neste display (Figura 4). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig3.jpg" /> Figura 3. Missa janela da guia de calibragem, mostrando os níveis de fundo para vários isótopos após a solução de lavagem e enxágüe. A região em torno TOF 9400-9800 corresponde a isótopos de xenônio no gás argônio, e deve estar sempre presente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . 4 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/4398/4398fig4.jpg / &quot;/&gt; Figura 4. Missa janela da guia de calibração, mostrando faixas verticais de vários isótopos em DVS solução tuning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <ol start="4"><li> Volte para o Massa (s) por leitura janela e pressione o verde botão &quot;Play&quot; no canto superior esquerdo. Cada isótopo seleccionado no passo 2.1 é representada por uma linha de cor diferente. O padrão eixo x é &quot;Time&quot;, em seg. Monitorizar os níveis de isótopos diferentes até que eles são estáveis. </li><li> Sintonia da corrente. Na guia Parâmetros da janela Configurações de Aquisição de Dados, selecione &quot;corrente&quot; no menu drop-down. Vamos começar = 0, acabamento = 10 valor do passo, = 0,5 tempo, estabelecendo-se = 200, e pressione &quot;salvar&quot;. Clique novamente no Massa (s) por janela Leitura e jogo da batida. O eixo x é agora &quot;atual&quot;. Notar que os sinais de pico de isótopos (Figura 5), e r<html> ECORD. Na guia Configuração do DAC Canais da janela de configuração do instrumento, desça até &quot;atual&quot; e digite o novo valor. Pressione o botão &quot;Definir valor actual&quot;, depois em &quot;salvar&quot;. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig5.jpg" /> Figura 5. Perfil ajuste atual. <ol start="6"><li> Sintonia do gás tornar-se-. Alterar menu drop-down para &quot;gás Make-up&quot;. Vamos começar = 0,55 final, = 0,95 valor do passo, = 0,05, tempo de sedimentação = 200. Pressione salvar. Voltar para a Massa (s) por janela Leitura e jogo da batida. O eixo x é agora &quot;Make-up gás&quot; taxa de fluxo. Gravar em que os sinais de pico de isótopos. Observar o rápido aumento da &quot;Gd155&quot; sinal perto do fim (Figura 6). Voltar para a guia Configuração DAC Canais, desça até &quot;gás Make-up&quot;, e digite o novo valor. Pressione o botão &quot;Definir valor actual&quot;, depois em &quot;salvar&quot;. </li></ol>igura 6 &quot;src =&quot; files/ftp_upload/4398/4398fig6.jpg / &quot;/&gt; Figura 6. Make-up perfil sintonia gás. <ol start="7"><li> Proporção de gravação desejado isótopo óxido vs. Faça uma injeção de 450 segundo ml de solução de sintonia. Na guia Parâmetros, selecione &quot;Time&quot; a partir do menu drop-down, vamos começar = 0 end, = 10, valor do passo = 1, tempo de repouso = 200. Pressione o botão &quot;salvar&quot;. Hit &quot;play&quot; em Massa (s) por leitura janela. Após as linhas de ter estabilizado (Figura 7), use o cursor para ler o valor nas caixas superior esquerdo para Tm169 ou Tb159 (maior valor) e também o valor &quot;Gd155&quot; (&lt;3% do valor mais elevado). Estes valores também podem ser salvos em um arquivo de ajuste para referência futura. </li></ol><img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig7.jpg" /> Figura 7. Medição de intensidades de ajuste de sinal solução após a otimização de gás atual e Make-up. <ol start="8"><li> Limpeza de samloop de PLE. Injectar 3 ml de água MilliQ através do laço de amostra, seguido de 500 ul de solução de lavagem DVS. Monitorar o progresso da limpeza pressionando &quot;corrida&quot; na guia Calibração de Massa. Lavar até que a intensidade das estrias (Figura 4) começa a diminuir, siga por 3 ml de água MilliQ e monitor até que a níveis de fundo (Figura 3). </li></ol> 3. Amostras de funcionamento <ol><li> Abrir a janela de aquisição. Configurações padrão: fazer uma análise = On-The-Fly, o sinal para analisar os dados = Dual, calibração de contagem dupla =. Redução de Ruído é selecionado. Qualquer um destes pode ser alterado, se desejado. Digite o nome do arquivo. Todos os arquivos devem ser salvos no :/ E / unidade. </li><li> Definir atrasos de aquisição. Haverá um ligeiro atraso no registo de eventos celulares de cerca de 30 segundos, devido ao comprimento do tubo entre o circuito de amostra e do nebulizador. Portanto, a soma total de &quot;atraso Aquisição&quot; e &quot;st Detectoratraso capacidade &quot;deve ser de pelo menos de 30 seg. atraso estabilidade Detector deve ser pelo menos de 20 seg. </li><li> Definir dados de tempo de coleta. &quot;Tempo de aquisição&quot; é o número de segundos que você deseja executar a sua amostra. Enchendo toda a malha 450 ul de amostra seria necessário para completar 600 sec. Sugere-se que 50-100 seg ser adicionado ao fim do tempo de execução para minimizar amostra carry-over. </li><li> A ressuspensão das amostras. Para minimizar a acumulação de sais na máquina, sugere-se que, pelo menos, duas lavagens em água MilliQ ser feito no final da coloração das células, seguida por uma re-suspensão final em água MilliQ. O volume de água MilliQ utilizado para ressuspender o sedimento de células variará dependendo do número de células que começaram com a recuperação de células e, após o procedimento de coloração inteiro. Um bom ponto de partida é 10 6 (partida) células / ml. Após ressuspensão, filtrar através de um filtro celular para remover agregados. </li><li> Inicial da amostra executado. Digite um novo nome para a amostra.<html> Mudar a válvula de loop de amostra para &quot;carregar&quot;, injectar a amostra, voltar para &quot;injetar&quot;, depois clique em &quot;Run&quot; na janela de Aquisição. </li><li> Registo de eventos celulares. As células serão representados na janela do instantâneo como coleções horizontais de marcas em cada canal isótopo / marcador vertical (Figura 8). Enquanto o citómetro de massa podem registar-1000 células / s, melhor resolução entre os eventos celulares é geralmente obtida a 300-500 células / seg. Isto corresponde a uma média de ~ 1 atualização celular / tela. Pode levar até 30 seg antes do contador de eventos celular começa a subir. Isto é devido ao &quot;On-the-fly&quot; de processamento de dados, sem informações sobre o evento celular é perdido. </li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig8.jpg" /> Figura 8. Janela Acquisition amostra durante funcionamento, mostrando as linhas horizontais de pontos correspondentes aos elementos associados com três eventos celulares separados.ww.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig8large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver maior figura. <ol start="7"><li> Qualidade de eventos celulares. Notar qualquer fundo faixas em cada canal de isótopos, bem como a taxa do evento de células. O citómetro de massa reconhece um &quot;evento de células&quot;, como um certo aumento no sinal acima do fundo, de modo de sinal de fundo a partir de metal livre ou não ligada do anticorpo pode alterar a &quot;célula&quot; evento de contagem. Além disso, as células funcionando em uma concentração demasiado elevada pode provocar um aumento do número de eventos de gibão. O fundo pode ser diminuída por lavagens adicionais ou de diluição maior de células. Dupletos podem ser minimizados através da diluição maior de células, com o custo de maior tempo de execução. </li><li> Acabamento de aquisição de dados de amostra. Quando o tempo de aquisição tenha sido alcançado, a recolha de dados irá terminar. Haverá um pouco de atraso antes de uma janela pop-up com um botão &quot;OK&quot; aparece, novamente, isso é devido ao &quot;On-the-fly&quot; processamento de dados. Aquisição da amostra também pode ser parado Prematurely por bater o botão &quot;Stop&quot;. Neste caso, todos os eventos celulares já registados serão contados e transformados em arquivos de saída. </li><li> Injecção de pelo menos 500 ul de água MilliQ entre cada uma das amostras também ajuda a minimizar a mistura de amostras. </li></ol> 4. Limpeza da máquina após o uso <ol><li> Lave solução. Após a amostra final é executado eo loop de amostra lavada com água, injetar 450 ml de solução de lavagem para o loop de amostra. Monitorar o lançamento de metal livre na guia Calibração de Massa da janela Configurações de Aquisição de Dados como no Passo 2,8 (Figura 9). Quando o sinal de metal livre começa a diminuir, lave com 3 ml de água MilliQ e monitorar os níveis de fundo até que sejam alcançados. </li></ol><img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/4398/4398fig9.jpg" /> Figura 9. Missa janela da guia de calibração, durante o pós-run limpeza com solução DVS Wash. As listras verticais em TOF região 9800-11000 são anticorpos rótulo isótopos sendo limpos para fora da máquina. As estrias verticais ao redor TOF 11.500 correspondem aos dois isótopos intercalador IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4398/4398fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . 5. Desligar a máquina <ol><li> No separador Controlador RFG da janela Configuração do instrumento, selecione &quot;Stop Plasma&quot;. Quando o procedimento estiver concluído, haverá uma janela pop-up pedindo que você retire o nebulizador. Pressione o botão &quot;OK&quot;. Na aba do gabinete, desligue o aquecedor. Fechar a válvula da fonte de árgon. </li><li> A remoção do nebulizador. Remover o nebulizador a partir da câmara de pulverização por puxar cuidadosamente para trás. Desaparafuse o tubo de introdução de amostra de 1,6 passo e colocar de lado. Desaparafuse o make-up de conexão introdução de gás para soltar um pouco, em seguida, puxe o nebulizador fora. Deixando o encaixe aparafusada irá reduzir as chances de losing a borracha preta o-ring e peça cónica de plástico branco. </li><li> Limpeza nebulizador. Backflush ambas as portas do nebulizador com citranox 5% utilizando a seringa e tubo como no Passo 1.3. Loja, coberto, no citranox 5% até a próxima utilização. </li></ol>

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

Os autores trabalho, tanto no centro de monitoramento imunológico humano, um centro de serviços na Universidade de Stanford, que cobra taxas de utilização apenas para recuperar o custo de ensaios, incluindo a citometria de massa.

Para as últimas décadas, a citometria de fluxo de fluorescência tem sido um método laborioso para a análise de células individuais, quer em termos de expressão de superfície e em ensaios funcionais. No entanto, os problemas de sobreposição espectral dos corantes fluorescentes tem limitado o número de marcadores em simultâneo. Embora experimentos com mais de 12 marcadores simultâneos têm sido relatados, o montante da compensação necessária torna esta tecnicamente difícil. Em vez de fluoróforo...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> CyTOF TM massa citómetro </td><td> DVS Ciências </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Lave solução </td><td> DVS Ciências </td><td> 201071 </td><td> 0,05% de ácido fluorídrico em água </td></tr><tr><td> Ajustando solução </td><td> DVS Ciências </td><td> 201072 </td><td> 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, traço de ácido nítrico </td></tr><tr><td> Ue contêm esferas de poliestireno </td><td> DVS Ciências </td><td> 201073 </td><td> Contém isótopos naturais abundância UE; contas fornecidos em aproximadamente 1 milhão / mL </td></tr><tr><td> Multi-lantanídeos contendo (La / Pr / Tb / TM / Lu) - esferas de poliestireno </td><td> DVS Ciências </td><td> Ainda não disponível comercialmente </td><td> Contém natural abundância de isótopos de lantanídeos listadas </td></tr><tr><td> Ácido nítrico (concentrado) </td><td> Fisher Scientific </td><td> A467-500 </td><td> Optima-trace metal puro ICP-MS grau </td></tr><tr><td> Tubo de fundo redondo de poliestireno com células coador-cap-5ml </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> usado para filtrar amostras de células antes da injecção </td></tr><tr><td> Norm-Ject tuberkulin seringa-1mL </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010-200V0 </td><td> sem silicone, sem látex </td></tr><tr><td> Norm-Ject-seringa de 3 mL </td><td> Henke Sass Lobo </td><td> 4010.000V0 </td><td> sem silicone, sem látex </td></tr><tr><td> Água MilliQ </td><td></td><td></td><td> 18 MQ água pura, não deve ser armazenado em garrafas de vidro ou de plástico que foram lavados com detergente comercial (devido a seus altos níveis de presente de bário). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z273236 </td><td> detergente ácido </td></tr><tr><td> O gás argônio </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99,999% de pureza ultra-elevada </td></tr></tbody></table>

citometria de massa: protocolo para ajuste diário e amostras de células em execução em um citômetro de massa cytof

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

Nos últimos anos, a análise rápida de células individuais tem sido normalmente realizadas utilizando a citometria de fluxo por fluorescência e anticorpos marcados. No entanto, a questão da sobreposição espectral de emissões fluoróforo tem limitado o número de sondas simultâneas. Em contraste, o citómetro de nova massa CyTOF por casais DVS Sciences um sistema de introdução de líquido de uma única célula de um ICP-MS. Uma vez de fluoróforos, os polímeros de quelação que contenham os isótopos de metal altamente enriquecidas são acopladas a anticorpos ou outras sondas específicas. 2-5 Devido à pureza do metal e resolução de massa do citómetro de massa, não existe nenhum &quot;sobreposição espectral&quot; de isótopos vizinhos, e, portanto, não há necessidade de matrizes de compensação. Além disso, devido ao uso de metais lantanídeos, não há biológico e, por conseguinte, qualquer equivalente de autofluorescência. Com uma janela de massa estendida massa atómica 103-203, teoricamente até 100 etiquetas podem ser distinguidos simultaneamente. Atualmente, Mais de 35 canais estão disponíveis usando os reagentes quelante disponível a partir de DVS Sciences, permitindo a dissecção sem precedentes do perfil imunológico de amostras. 6-7 Desvantagens para citometria de massa incluem o requisito estrito para um isótopo de metal separado por sonda (nenhum equivalente de dispersão frontal ou lateral), e o facto de que é uma técnica destrutiva (sem possibilidade de separação de recuperação). A actual configuração do citómetro de massa também tem uma taxa de transmissão de células de apenas ~ 25%, o que requer um maior número de células de entrada. Desempenho diário ideal do citômetro de massa requer várias etapas. O objectivo básico da optimização é maximizar a intensidade de sinal de medição dos isótopos de metal desejados (M) ao mesmo tempo minimizando a formação de óxidos (M 16), que irá diminuir a intensidade do sinal M e interferir com qualquer sinal desejado em M 16. O primeiro passo é aquecer a máquina para um quente, eu estávelCP plasma foi estabelecida. Segundo, as definições para a taxa atual e make-up de fluxo de gás deve ser otimizada em uma base diária. Durante a recolha de amostra, a taxa máxima de células evento é limitada pela eficiência do detector e a velocidade de processamento de 1000 células / segundo. No entanto, dependendo da qualidade da amostra, uma taxa mais lenta do evento de células (300-500 células / segundo), é usualmente desejável para permitir uma melhor resolução entre os eventos de células e, assim, maximizar singlets intactas sobre doublets e detritos. Por fim, a limpeza adequada da máquina no fim do dia, ajuda a minimizar o sinal de fundo, devido ao metal livre.

Seguindo o protocolo acima deve realizar quatro coisas. Em primeiro lugar, permitindo que o tempo de aquecimento adequado para o citômetro de massa irá produzir um plasma quente e estável necessário para o sinal ótima e formação de óxido mínimo. Lavagem, segundo adequada do citómetro de massa com MilliQ água e solução de lavagem DVS (Figura 9) vai ajudar a reduzir os níveis de metal de adsorção para a tubagem e outras partes da máquina, ajudando a reduzir o fundo durante a aquisição de amostras ...

Os passos necessários para a sintonização diária e optimização do desempenho de um citómetro de massa CyTOF são descritos. Comentários sobre a preparação da amostra ideal e vazão são discutidos

Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

Nos últimos anos, a análise rápida de células únicas tem sido comumente realizada utilizando citometria de fluxo e anticorpos marcados com fluorescência. No entanto, o ...

O objetivo principal deste procedimento é demonstrar o ajuste diário adequado e a análise de amostras em um instrumento CyTOF. Primeiro, a máquina é montada e ligada. Em seguida, as configurações do instrumento são otimizadas para o ajuste com sinal máximo.A máquina está então pronta para executar as amostras. Na etapa final, a máquina é limpa e desligada. Em última análise, dados celulares ideais podem ser obtidos de acordo com requisitos específicos de tempo.A demonstração visual desta técnica é essencial. Os procedimentos diários de configuração, calibração e limpeza são difíceis de aprender a partir do manual, pois envolvem múltiplas etapas de software simultâneas.Você precisa adquirir experiência para desenvolver uma percepção sobre os níveis de fundo e intensidades de sinal apropriados. Pelo menos 15 minutos antes de iniciar um experimento, abra o programa de software do CyTOF e selecione a configuração do instrumento. Em seguida, na guia do alojamento de placas, clique no botão ligar o aquecedor para permitir que a camisa da câmara de nebulização atinja 200 graus Celsius.Substitua a seringa na bomba de seringa por uma seringa nova preenchida com água milli cube. Em seguida, limpe o nebulizador fazendo uma lavagem reversa com 5% de Citron duas vezes por cada porta. Para remover qualquer resíduo de Citron, repita a lavagem reversa com água Milli Q.Em seguida, abra a válvula do tanque de gás argônio, fazendo com que a luz Argonne na frente da máquina se acenda. Depois, conecte o nebulizador à entrada de gás de compensação e ligue o nebulizador ao tubo de introdução de líquido. Insira a extremidade do nebulizador na abertura branca no manto de aquecimento na aba do controlador RFG da janela de configuração do instrumento.Clique em iniciar plasma, depois clique em ok. Após a inicialização terminar, clique em ok novamente na janela pop-up. Agora ligue a bomba de seringa.Ao reabastecer a seringa, pressione o botão de parada em vez do botão de pausa para redefinir o contador de volume. Antes de calibrar o citômetro de massa, certifique-se de que ele tenha aquecido por 20 minutos. Uma vez que a máquina tenha estabilizado, clique no botão de configurações de aquisição para abrir a janela de configurações de aquisição de dados. Na guia analitos.Clique na tabela periódica para abrir o painel de seleção de isótopos. Em seguida, selecione os isótopos na solução de ajuste DVS Sciences listada no manual e clique em salvar. Depois, clique no botão isótopos por leitura para abrir a janela de massas por leitura.Selecione a contagem de pulsos e reajuste o eixo y inserindo um novo número e pressionando enter. Agora, encha uma seringa verde de um mililitro norm inject com solução de calibração. Gire o seletor de porta da amostra para carregar.Injete 450 microlitros de solução de calibração e, em seguida, gire o seletor para injetar. Aguarde até que os isótopos da solução de calibração comecem a aparecer como traços neste visor. Os sinais no tempo de voo, na região de 9.400 a 9.800, são devidos aos isótopos de xenônio no gás argônio.Agora retorne à janela de massas por leitura e clique no botão verde de reprodução. Cada linha colorida representa isótopos selecionados da guia de analitos. Quando os níveis de isótopos estiverem estáveis, ajuste a corrente selecionada no menu suspenso na guia de parâmetros da janela de configurações de aquisição de dados.Na janela inicial, insira zero para o término, insira 10. Para o valor do passo, insira 0,5 e, para o tempo de estabilização, insira 200. Em seguida, clique em salvar.Em seguida, clique novamente na janela de massas por leitura e clique em reproduzir. Após observar onde os sinais dos isótopos atingem o pico, vá até a guia de configuração do canal DAC na janela de configuração do instrumento. Role para baixo até a corrente e insira o valor do pico do isótopo.Clique em definir valor atual da corrente e, em seguida, salve. Em seguida, altere o menu suspenso para gás de composição. Insira 0,55 na janela de início, 0,95 na janela final, 0,05 na janela de valor do passo e 200 na janela de tempo de estabilização.Clique em salvar. Após retornar à janela de massas por leitura e clicar em reproduzir novamente, o eixo x exibirá agora a taxa de fluxo do gás de arraste. Observe os valores onde os sinais dos isótopos atingem o pico e note o aumento rápido do sinal GD 1 55 próximo ao final.Em seguida, retorne à guia de configuração do canal DAC. Role para baixo até a seção de correção, gás, e insira o novo valor do pico de isótopo. Clique em definir valor atual.Em seguida, clique em salvar novamente para registrar a razão entre o isótopo desejado e o óxido. Primeiro, faça uma segunda injeção de 450 microlitros da solução de calibração. Depois, na guia de parâmetros, selecione tempo no menu suspenso e insira zero na janela de início, 10 na janela de fim, um na janela de valor do passo e 200 na janela de estabilização.Após clicar em reproduzir na janela de massas por leitura, use o cursor para ler o valor mais alto para TM 1 69 ou TB 1 59, e também o valor GD 1 55. Agora, injete três mililitros de água Milli Q através do loop de amostra, seguidos por 500 microlitros de solução de lavagem DVS. Na guia de calibração de massa, clique em executar para monitorar o progresso da lavagem de limpeza até que a intensidade das faixas comece a diminuir.Em seguida, adicione três mililitros de água millicubo e monitore até que as faixas diminuam até os níveis de fundo. Comece inserindo os isótopos da amostra conforme demonstrado anteriormente para os isótopos da solução de calibração e, depois, clique em salvar. A seguir, abra a janela de aquisição e altere as configurações de aquisição conforme necessário para o volume da amostra.Por exemplo, uma amostra de 450 microlitros preencherá o loop de amostragem e levará 600 segundos para ser executada, permitindo acomodar atrasos na aquisição dos dados celulares. Defina o atraso de aquisição em pelo menos 30 segundos e o atraso de estabilidade do detector em pelo menos 20 segundos antes da execução. Lave as amostras celulares pelo menos duas vezes com água milli cube e, em seguida, re-suspenda a amostra em uma concentração máxima de 10 elevado a seis células por mililitro e filtre a solução celular resultante através de um filtro celular de 35 micrômetros.Para remover quaisquer agregados. Agora, insira um novo nome de arquivo para a amostra atual. Observe que todos os arquivos devem ser salvos na unidade E.Em seguida, mude a válvula do loop da amostra para carregar, injete a amostra, retorne a válvula do loop da amostra para injetar e clique em executar na janela de aquisição. As células serão representadas na janela de instantâneo como conjuntos horizontais de marcas em cada canal isotópico vertical e exibirão a melhor resolução em torno de 300 a 500 células por segundo, conforme demonstrado aqui.Quando a aquisição de dados da amostra for concluída, uma janela pop-up aparecerá. Clique em OK para confirmar a conclusão da análise da amostra e, em seguida, injete pelo menos 500 microlitros de água MQ entre cada amostra para ajudar a minimizar qualquer contaminação cruzada e limpar o equipamento. Após o uso, injete 450 microlitros de solução de lavagem no loop de amostra. Monitore a liberação de metal livre e, em seguida, enxágue o loop de amostra com três mililitros de água Milli Q, monitorando o lavado até que sejam alcançados níveis de fundo de arraste.Em seguida, para desligar o equipamento, selecione a guia do controlador RFG na janela de configuração do instrumento e clique em parar plasma. Quando o procedimento estiver concluído, clique em ok na janela pop-up, que recomenda a remoção do nebulizador na guia sob o compartimento de cartões. Desligue o aquecedor, feche a válvula da fonte de argônio e, em seguida, puxe cuidadosamente para trás o nebulizador para removê-lo da câmara de pulverização.Em seguida, desparafuse o tubo de introdução da amostra e coloque-o de lado. Desparafuse a conexão de introdução do gás de compensação até que afrouxe ligeiramente e, então, retire o nebulizador. Por fim, utilizando a mesma seringa e tubo conforme demonstrado anteriormente, limpe ambas as portas do nebulizador com Citron 5% e guarde o nebulizador coberto com Citron 5% até o próximo uso.A lavagem adequada do citômetro de massa com água UE e solução de lavagem DVS reduzirá os níveis de absorção de metais nos tubos e em outras partes do equipamento, ajudando a diminuir qualquer fundo, conforme observado nestes gráficos. O ajuste inadequado, representado pela linha magenta, aumentou significativamente a formação de óxidos em m mais 16 em comparação com a amostra devidamente ajustada, conforme demonstrado pela linha azul-escura. Isso tem o efeito de diminuir ligeiramente os sinais desejados em m e aumentar significativamente a interferência de fundo indesejada em m mais 16.A lavagem adequada e a diluição apropriada das amostras em água Milli Q garantirão um fundo mínimo e a maior resolução de células, equilibrando a necessidade de velocidade. Semelhante aos dados de um experimento representativo mostrado aqui neste experimento, esferas de poliestireno contendo lantânio 139 ODIUM 140, térbio 159, DIUM 169 e lutécio 175 em abundância natural foram analisadas no modo de aquisição celular. Os dados foram analisados usando o FlowJo e os detritos provenientes de esferas quebradas foram excluídos por geração. Determinou-se que a amostra devidamente ajustada estava na vazão de 0,74 litros por minuto, conforme representado pela linha azul-escura. Intensidades de sinal mais altas foram observadas nesta vazão em comparação com vazões mais baixas, e observou-se que essa amostra devidamente ajustada apresentava sinal mais alto nas massas metálicas M e sinal mais baixo nas massas de óxido m + 16 do que os sinais inadequadamente ajustados. Um detalhe do sinal nas massas M LANTÂNIO 1 39 e TÚLIO 1 69 é mostrado aqui.Observe que a taxa de fluxo do gás de makeup afeta mais a intensidade do sinal do LANTÂNIO 1 39 do que a intensidade do sinal do túlio 1 69. Esses gráficos mostram o sinal em m mais 16 massas de óxido 1 55 e 180 5, correspondentes aos óxidos de LANTÂNIO 1 39 mais OH 16 e túlio 1 69 mais OH 16, respectivamente. Observe que a taxa de fluxo do gás de makeup aumenta muito mais o sinal da massa 1 55 do que o sinal da massa 180 5, pois o lantânio 1 39 é mais facilmente oxidado do que o túlio 1 69.As intensidades dos sinais m e m mais 16 em função da taxa de fluxo do gás de compensação são mostradas aqui. Os ícones preenchidos representam a massa M, enquanto os ícones vazados representam a massa M mais 16. As cores das linhas correspondem à respectiva massa M. Observe que as intensidades dos sinais de LANTÂNIO 139 e PRASEODÍMIO 141 são altamente afetadas pela taxa de fluxo do gás de compensação, chegando mesmo a um ponto em que há mais óxido de massa M mais 16 presente do que a massa M. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como ligar corretamente o CyTOF, ajustá-lo adequadamente, executar suas amostras e, finalmente, limpar e desligar corretamente o equipamento ao final das suas sessões diárias.

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JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

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