Citometria de massa: Protocolo para Ajuste Diário e amostras de células em execução em um citômetro de Massa CyTOF

O objetivo da revisão deste procedimento é demonstrar o ajuste diário adequado e a análise da amostra em um instrumento CyTOF. Primeiro, a máquina é montada e ligada. Em seguida, as configurações do instrumento são otimizadas para afinar o sinal máximo.

A máquina está então pronta para executar as amostras. Na etapa final, a máquina é limpa e desligada. Em última análise, os dados celulares ideais podem ser adquiridos de acordo com requisitos de tempo específicos.

A demonstração visual dessa técnica é crítica. Os procedimentos diários de configuração, ajuste e limpeza são difíceis de aprender com o manual. Como há várias etapas de software simultâneas envolvidas.

Você precisa ganhar experiência para ter uma ideia dos níveis de fundo apropriados e intensidades de sinal Pelo menos 15 minutos antes de iniciar um experimento. Abra o programa de software CyTOF e selecione a configuração do instrumento. Em seguida, na guia da gaiola de cartão, clique no botão do aquecedor para permitir que o manto da câmara de pulverização atinja 200 graus Celsius.

Substitua a seringa na bomba da seringa por uma seringa nova cheia de água em mili cubos. Em seguida, limpe o nebulizador lavando com 5% de cidra duas vezes através da porta de alcance. Para remover qualquer resíduo de Cidra, repita a retrolavagem com água Milli Q.

Em seguida, abra a válvula do tanque de gás argônio, resultando no acendimento da luz Argonne na frente da máquina. Em seguida, conecte o nebulizador à entrada do gás de reposição e conecte o nebulizador à tubulação de introdução de líquido. Insira a extremidade do nebulizador na abertura branca no manto de aquecimento na guia do controlador RFG da janela de configuração do instrumento.

Clique em iniciar plasma e, em seguida, clique em OK. Após a conclusão da inicialização, clique em OK novamente na janela pop-up. Agora ligue a bomba de seringa.

Ao reabastecer a seringa, pressione o botão de parada em vez do botão de pausa para redefinir o contador de volume Antes de calibrar o citômetro de massa, certifique-se de que ele tenha aquecido por 20 minutos. Depois que a máquina estiver estabilizada, clique no botão de configurações de aquisição para abrir a janela de configurações de aquisição de dados. Na guia de analitos.

Clique na tabela periódica para abrir o painel de seleção de isótopos. Em seguida, selecione os isótopos na solução de ajuste de ciências DVS listada no manual e clique em salvar. Em seguida, clique no botão isótopos por leitura para abrir a janela de massas por leitura.

Selecione a contagem de pulsos e redimensione o eixo y inserindo um novo número e pressionando enter. Agora encha uma norma verde de um mililitro injete seringa com solução de ajuste. Gire o seletor de porta de amostra para carregar.

Injete 450 microlitros de solução de ajuste e, em seguida, gire o seletor para injetar. Aguarde até que os isótopos da solução de ajuste comecem a aparecer como listras nesta tela. Os sinais no tempo de voo, 9.400 a 9.800 região, são devidos a isótopos de xenônio no gás argônio.

Agora retorne às massas por janela de leitura e clique no botão verde de reprodução. Cada linha colorida representa os isótopos selecionados da guia de analitos. Quando os níveis de isótopos estiverem estáveis, ajuste a corrente de seleção atual no menu suspenso na guia de parâmetros da janela de configurações de aquisição de dados.

Na janela inicial, insira zero para concluir, insira 10. Para o valor da etapa, insira 0,5 e, para o tempo de estabilização, insira 200. Em seguida, clique em salvar.

Em seguida, clique novamente nas massas por janela de leitura e clique em reproduzir. Depois de observar onde os sinais dos isótopos atingem o pico, vá para a guia de configuração do canal DAC da janela de configuração do instrumento. Role para baixo até atual e insira o valor de pico do isótopo.

Clique em definir valor atual real e em salvar. Em seguida, altere o menu suspenso para compensar o gás. Insira 0,55 na janela inicial, 0,95 na janela final, 0,05 na janela de valor da etapa e 200 na janela de tempo de estabilização.

Clique em salvar. Depois de retornar às massas por janela de leitura e clicar em reproduzir novamente, o eixo x agora exibirá a taxa de fluxo de gás de reposição. Observe os valores em que os sinais dos isótopos atingem o pico e observe o rápido aumento do sinal GD 1 55 perto do final.

Em seguida, retorne à guia de configuração do canal DAC. Role para baixo até maquiagem, gás e insira o novo valor de pico de isótopo. Clique em definir valor atual real.

Em seguida, clique em salvar novamente para registrar a proporção do isótopo desejado versus óxido. Primeiro, faça uma segunda injeção de 450 microlitros de solução de ajuste. Em seguida, na guia de parâmetros, selecione tempo no menu suspenso e insira zero na janela inicial, 10 na janela final, um na janela de valor da etapa e 200 na janela de liquidação.

Depois de clicar em reproduzir nas massas por janela de leitura, use o cursor para ler o valor mais alto para TM 1 69 ou TB 1 59, e também o valor GD 1 55. Agora injete três mililitros de água Milli Q através do loop de amostra, seguido por 500 microlitros de solução de lavagem DVS. Na guia de calibração de massa, clique em executar para monitorar o progresso da lavagem de limpeza até que a intensidade das estrias comece a diminuir.

Em seguida, siga com três mililitros de água em mili cubos e monitore até que as listras estejam nos níveis de fundo. Comece inserindo os isótopos de amostra demonstrados para os isótopos da solução de ajuste e clique em salvar. Em seguida, abra a janela de aquisição e altere as configurações de aquisição conforme necessário para o volume de amostra.

Por exemplo, uma amostra de 450 microlitros preencherá o loop de amostra e levará 600 segundos para ser executada para permitir atrasos na aquisição dos dados da célula. Defina o atraso de aquisição para pelo menos 30 segundos e o atraso de estabilidade do detector para pelo menos 20 segundos antes de executar. Lave as amostras de células pelo menos duas vezes com água em mili cubos e, em seguida, ressuspenda a amostra a um máximo de 10 a seis células por mililitro e filtre a solução celular resultante através de um filtro de células de 35 micrômetros.

Para remover quaisquer agregados. Agora insira um novo nome de arquivo para o exemplo atual. Observe que todos os arquivos devem ser salvos na unidade E.

Em seguida, troque a válvula de loop de amostra para carregar, injete a amostra, troque a válvula de loop de amostra de volta para injetar e clique em executar. Na janela de aquisição. As células serão representadas na janela de instantâneo como coleções horizontais de marcas em cada canal de isótopo vertical e exibirão a melhor resolução em torno de 300 a 500 células por segundo, conforme demonstrado aqui.

Quando a aquisição de dados da amostra for concluída, uma janela pop-up aparecerá. Clique em OK para confirmar a conclusão da execução da amostra e, em seguida, injete pelo menos 500 microlitros de água MQ entre cada amostra para ajudar a minimizar qualquer transferência de amostra para limpar a máquina Após o uso, injete 450 microlitros de solução de lavagem no circuito de amostra. Monitore a liberação de metal livre e, em seguida, lave o loop de amostra com três mililitros de água mili Q, monitorando a lavagem até que os níveis de faixa de fundo sejam alcançados.

Em seguida, para desligar a máquina, selecione a guia do controlador RFG da janela de configuração do instrumento e clique em parar plasma. Quando o procedimento estiver concluído, clique em OK na janela pop-up, recomendando a remoção do nebulizador na guia da gaiola de cartão. Desligue o aquecedor, feche a válvula do suprimento de argônio e, em seguida, puxe cuidadosamente o nebulizador para trás para removê-lo da câmara de pulverização.

Em seguida, desparafuse o sample tubo de introdução e coloque-o de lado. Desaparafuse a conexão de introdução do gás de reposição até que ela se solte ligeiramente e, em seguida, retire o nebulizador. Por fim, usando a mesma seringa e tubo demonstrados anteriormente, limpe ambas as portas do nebulizador com 5%Citron e guarde o nebulizador coberto com 5%Citron até o próximo uso.

A lavagem adequada do citômetro de massa com água UE e solução de lavagem DVS reduzirá os níveis de absorção de metal para a tubulação e para outras partes da máquina, ajudando a reduzir qualquer fundo, como visto nesses gráficos. A afinação inadequada representada pela linha magenta aumentou significativamente a formação de óxido em m mais 16 em comparação com a amostra devidamente ajustada, conforme demonstrado pela linha azul escura. Isso tem o efeito de diminuir ligeiramente os sinais desejados em m e aumentar significativamente a interferência de fundo indesejada em m mais 16.

A lavagem adequada e a diluição adequada das amostras em água Milli Q garantirão um fundo mínimo e a maior resolução das células, equilibrando a necessidade de velocidade. Semelhante aos dados de um experimento representativo mostrado aqui neste experimento, grânulos de poliestireno contendo lantânio de abundância natural 1 39 ODIUM one 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 e LUTETIUM 1 75 foram executados no modo de aquisição celular. Os dados foram analisados usando FlowJo e os detritos de quaisquer contas quebradas foram fechados.

A amostra devidamente ajustada foi determinada como estando na vazão de 0,74 litros por minuto, representada pela linha azul escura. Intensidades de sinal mais altas foram observadas nesta taxa de fluxo do que nas taxas de fluxo mais baixas, e esta amostra devidamente sintonizada foi observada como tendo sinal mais alto nas massas de metal M e menos sinal nas massas de óxido m mais 16 do que os sinais sintonizados incorretamente. Um close-up do sinal em M Mass LANTÂNIO 1 39 e TÚLIO 1 69 é mostrado aqui.

Observe que a taxa de fluxo do gás de reposição afeta a intensidade do sinal de lantânio 1 39 mais do que a intensidade do sinal de túlio 1 69. Esses gráficos mostram o sinal em m mais 16 massas de óxidos 1 55 e 180 5 correspondendo aos óxidos de LANTÂNIO 1 39 mais oh 16 e túlio 1 69 mais oh 16, respectivamente. Observe que a taxa de fluxo do gás de reposição aumenta o sinal de massa 1 55 muito mais do que o sinal de massa 180 5, pois o lantânio 1 39 é mais facilmente oxidado do que o túlio 1 69.

As intensidades de sinal m e m mais 16 em função da taxa de fluxo do gás de reposição são representadas aqui. Os ícones preenchidos representam a MASSA M.Enquanto os ícones abertos representam a massa M mais 16, as cores das linhas correspondem à respectiva massa M.Observe que as intensidades de sinal do LANTÂNIO 1 39 e do preço ODIUM 1 41 são altamente afetadas pela taxa de fluxo do gás de reposição. Mesmo chegando a um ponto em que mais massa m mais 16 óxido está presente do que massa M. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como iniciar o CyTOF corretamente ajustá-lo, depois executar suas amostras e, finalmente, limpar e desligar adequadamente a máquina no final de suas execuções diárias.