Name: Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: למד כיצד לכוון יומית ציטומטר מסה CyTOF ולהכין דגימות תאים לניתוח. פרוטוקול זה מדגים כוונון אופטימלי של הגדרות המכשיר, התאמת קצב זרימה ותחזוקה שוטפת לשיפור איכות הנתונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ברצוננו להודות לד&quot;ר האוון ניואל וד&quot;ר שון Bendall למשוב. אנחנו גם רוצים להודות למדעים וDVS ד&quot;ר שון Bendall למדגם בחרוזי הקלקר בעל מספר lanthanide המכיל. אנו מודים למימון ממענק NIH 2 U19 AI057229.

<ol><li>Bandura, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+Technique+for+real+time+single+cell+multitarget+immunoassay+based+on+inductively+coupled+plasma+Time-of-Flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).</li>
<li>Lou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer-based+elemental+tags+for+sensitive+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.%2C+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Polymer-based elemental tags for sensitive bioassays.</a> Angew. Chem., Int. Ed. 46, 6111-6114 (2007).</li>
<li>Majonis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curious+results+with+palladium-+and+platinum-carrying+polymers+in+mass+cytometry+bioassays+and+an+unexpected+application+as+a+dead+cell+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Curious results with palladium- and platinum-carrying polymers in mass cytometry bioassays and an unexpected application as a dead cell stain.</a> Biomacromolecules. 12, 3997-4010 (2011).</li>
<li>Leipold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mass+cytometry+methods+for+bacterial+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination.</a> Anal. Biochem. 419, 1-8 (2011).</li>
<li>Bendall, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+of+differential+immune+and+drug+responses+across+a+human+hematopoietic+continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.</a> Science. 332, 687-696 (2011).</li>
<li>Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytometry+by+Time-of-Flight+shows+combinatorial+cytokine+expression+and+virus-specific+cell+niches+within+a+continuum+of+CD8%2B+T+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytometry by Time-of-Flight shows combinatorial cytokine expression and virus-specific cell niches within a continuum of CD8+ T cell phenotypes.</a> Immunity. 36, 142-152 (2012).</li>
</ol>

המחברים גם עבודה במרכז האנוש החיסוני הניטור, מרכז שירות באוניברסיטת סטנפורד שגובה דמי שימוש אך ורק כדי לשחזר את העלות של מבחנים, כולל cytometry המוני.

במשך העשורים האחרונים, cytometry הזרימה פלואורסצנטי היה סוס עבודת שיטה לניתוח תאים בודדים, הוא במונחים של ביטוי בשטח ומבחנים תפקודיים. עם זאת, בסוגיות של חפיפת ספקטרום של צבעי הניאון הגבילו את מספר הסמנים בו זמנית. בעוד ניסויים באמצעות יותר מ 12 סמנים בו זמנית כבר דיווחו, סכום הפיצוי הנדרש עושה את זה קשה מבחינה טכנית. במקום fluorophores, cytometry ההמוני החלוץ ידי מדעי DVS משתמש פולימרים בעלי אתרי chelating למתכו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם המגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> CyTOF TM ההמוני cytometer </td><td> מדעי DVS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> שטוף את הפתרון </td><td> מדעי DVS </td><td> 201071 </td><td> 0.05% חומצה הידרופלואורית במים </td></tr><tr><td> כוונון פתרון </td><td> מדעי DVS </td><td> 201072 </td><td> 0.5 ppm La, Cs, שחפת, TM, עיר, חומצה חנקתית עקבות </td></tr><tr><td> חרוזי קלקר איחוד אירופי המכילים </td><td> מדעי DVS </td><td> 201073 </td><td> מכיל איזוטופים טבעי שפע איחוד האירופיים; חרוזים מסופקים בכ 1 מ&#39;/ מ&quot;ל </td></tr><tr><td> Multi-lanthanide המכיל (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - חרוזי קלקר </td><td> מדעי DVS </td><td> עדיין לא זמין המסחרי </td><td> מכיל איזוטופים טבעי שפע של lanthanides הרשום </td></tr><tr><td> חומצה חנקתית (מרוכז) </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> A467-500 </td><td> אופטימה עקבות מתכת טהורה ICP-MS כיתה </td></tr><tr><td> צינור פוליסטירן עגול עם תחתית תא מסננת כובע-5 מ&quot;ל </td><td> BD </td><td> 352235 </td><td> משמש לסינון דגימות תאים לפני ההזרקה </td></tr><tr><td> נורמה מקרינה tuberkulin מזרק 1ml </td><td> הנקת זאס וולף </td><td> 4010-200V0 </td><td> סיליקון חופשי, לטקס חינם </td></tr><tr><td> נורמה מקרינה מזרק-3 מ&quot;ל </td><td> הנקת זאס וולף </td><td> 4010.000V0 </td><td> סיליקון חופשי, לטקס חינם </td></tr><tr><td> מי MilliQ </td><td></td><td></td><td> מים טהורים MΩ 18; לא חייבים להיות מאוחסנים בזכוכית או בקבוקי פלסטיק שנשטפו עם חומר ניקוי מסחרי (עקב הרמות הגבוהות של הווה בריום). </td></tr><tr><td> Citranox </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> Z273236 </td><td> חומר ניקוי חומצה </td></tr><tr><td> ארגון גז </td><td> Praxair </td><td> AR 5.0UH-T </td><td> 99.999% טוהר גבוה במיוחד </td></tr></tbody></table>

cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על cytometer המוני cytof

Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

בשנים האחרונות, הניתוח המהיר של תאים בודדים יש בדרך כלל בוצע באמצעות cytometry זרימה ונוגדנים שכותרת-fluorescently. עם זאת, סוגיית חפיפת רפאים של פליטות fluorophore הגבילה את מספר הבדיקות בו זמנית. לעומת זאת, cytometer ההמוני CyTOF החדש על ידי זוגות מדעי DVS מערכת הקדמת תא בודד נוזל ICP-MS. 1 במקום fluorophores, פולימרים המכילים איזוטופים chelating מתכת מועשרת-מאוד הם מצמידים לנוגדנים או בדיקות ספציפיות אחרות. 2-5 בגלל טוהר המתכת והרזולוציה המונית של cytometer ההמוני, אין &quot;חפיפת רפאים&quot; מהאיזוטופים שכנים, ולכן אין צורך מטריצות פיצויים. בנוסף, בשל השימוש במתכות lanthanide, אין רקע ביולוגי ולכן אין לה מקבילה של autofluorescence. עם חלון המוני הפורשים מסה אטומית 103-203, באופן תיאורטי עד 100 תוויות יכולות להבחין בו זמנית. כיום, יותר מ 35 ערוצים זמינים באמצעות ריאגנטים chelating הזמינים ממדעי DVS, המאפשר לנתיחת תקדים של הפרופיל החיסוני של דגימות. 6-7 חסרונות cytometry המוני כוללים דרישה המחמירה לאיזוטופ נפרד מתכת לבדיקה (אין מקביל לפיזור קדימה או בצד), ועובדה שמדוברת בטכניקה הרסנית (אין אפשרות למיון החלמה). התצורה הנוכחית של cytometer המסה יש גם שיעור תא שידור של רק ~ 25%, ולכן דורש קלט מספר גבוה יותר של תאים. ביצועים יומיים אופטימליים של cytometer ההמוני דורשים מספר שלבים. המטרה הבסיסית של אופטימיזציה היא למקסם את עוצמת האות הנמדדת של איזוטופים המתכת הרצויה (M) תוך מזעור ההיווצרות של תחמוצות (16 &#39;), שיהיה הפחתה בעוצמת אות M ולהפריע לאות רצויה בM 16. הצעד הראשון הוא לחמם את המכונה כל כך חם, אני יציבCP פלזמה כבר נקבע. שנית, את ההגדרות עבור קצב זרימת גז נוכחי ואיפור חייבות להיות מותאמות על בסיס יומי. במהלך איסוף דגימה, שיעור אירועי התא המרבי מוגבל על ידי יעילות גלאי ומהירות עיבוד עד 1000 תאים / 2. עם זאת, בהתאם לאיכות המדגם, שיעור אירועי תא איטי יותר (300-500 תאים / 2) הוא בדרך כלל רצוי שיאפשר רזולוציה טובה יותר בין אירועי תאים ובכך למקסם את הגופיות שלמות על כפילויות ופסולות. לבסוף, ניקוי נאות של המכונה בסוף היום מסייע למזער אות רקע בשל מתכת חופשיה.

בעקבות הפרוטוקול הנ&quot;ל צריך להשיג ארבעה דברים. ראשית, המאפשר זמן חימום נאות לcytometer ההמוני יפיק פלזמה חמה, יציבה הכרחית לאות אופטימלית והיווצרות תחמוצת מינימאלית. כביסה שנייה, נאותה cytometer ההמוני עם פתרון לשטוף DVS מי MilliQ ו( איור 9) תעזור להפחית את הרמות של מתכת ספיחה לצינורות וחלקים אחרים של המכונה, כדי לסייע להפחית רקע במהלך רכישת מדגם (איור 8). זה גם יעזור להסיר את כל תאים שעלולים להיתקע במכונה ובכך לצמצם carryover ממדגם למדגם. תוך...

את הצעדים הדרושים לכוונון ואופטימיזציה יומיים של ביצועים של cytometer המוני CyTOF מתוארים. תגובות על הכנת מדגם אופטימלי וקצב זרימה נדונות

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

בשנים האחרונות, ניתוח מהיר של תאים בודדים בוצע בדרך כלל באמצעות ציטומטריית זרימה ונוגדנים מסומנים פלואורסצנטית. עם זאת, ה...

מטרתו הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את הכיול היומי הנכון ואת ניתוח הדגימות במכשיר CyTOF. ראשית, המכשיר מורכב ומופעל. לאחר מכן, הגדרות המכשיר מותאמות (optimized) לצורך כיול להשגת אות מקסימלי.כעת המכונה מוכנה להרצת הדגימות. בשלב הסופי, המכונה מנוקה ומכובה. בסופו של דבר, ניתן להשיג נתוני תאים אופטימליים בהתאם לדרישות זמן ספציפיות.הדגמה ויזואלית של טכניקה זו היא קריטית. קשה ללמוד את נהלי ההקמה, הכיול והניקוי היומיים מתוך המדריך, כיוון שהם כוללים מספר שלבים תוכנתיים המבוצעים בו-זמנית.עליכם לרכוש ניסיון כדי להבין את רמות הרקע ועצמות האות המתאימות. לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי, פתחו את תוכנת ה-CyTOF ובחרו ב-instrument setup. לאחר מכן, בלשונית card cage, לחצו על כפתור ה-heater כדי לאפשר למעטפת תא הריסוס להגיע ל-200 °C.החליפו את המזרק במזרק חשמלי במזרק חדש מלא במי milli cube. לאחר מכן, נקו את הנבולייזר על ידי שטיפה לאחור עם 5% Citron פעמיים דרך כל פתח. כדי להסיר שאריות Citron, חזרו על השטיפה לאחור עם מי Milli Q.בשלב הבא, פתחו את שסתום מיכל גז הארגון, פעולה שתוביל להדלקת נורית הארגון בחזית המכשיר. לאחר מכן, חברו את הנבולייזר לכניסת גז המילוי (makeup gas) ואת הנבולייזר לצינור הזרקת הנוזל. הכניסו את קצה הנבולייזר לפתח הלבן במעטפת החימום בלשונית בקר ה-RFG בחלון הגדרות המכשיר.לחצו על start

mass-cytometry-protocol-for-daily-tuning-running-cell-samples-on

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטון זה מדגיש שיטה פרוטאומית חד-תאית המשתמשת בנוגדנים מצומדים במתכת כבדה לברקוד תאים מובחן. לאחר מכן, immunostaining ו cytometry המסה מוחלים כדי להעריך שינויים פנוטיפיים חיסוניים ותפקודיים בתאי חיסון אנושיים שמקורם בדם שלם.

בדיקת ברקוד לאפיון פנוטיפי ופונקציונלי של תאי מערכת החיסון

מאמר זה מתאר את האיסוף והעיבוד של דגימות לניתוח ציטומטריית מסה.

לדוגמא הכנה לניתוח Cytometry Mass

כאן נתאר בגישה פרוטיאומיה מבנית תא בודד כדי להעריך את החיסון פנוטיפי ו פונקציונלי (ציטוקינים תאיים אינדוקציה) שינויים בדגימות דם היקפיים, נותחו באמצעות cytometry המוני.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

מאמר זה מדגים שיטה חזקה לכמת המיטוכונדריה או lysosomes בתאים חיים. השילוב של צבעי ספציפיים ליזוזום או המיטוכונדריה עם נוגדנים fluorescently מצומדת סמני פני השטח מאפשר כימות של אלה organelles אוכלוסיות מעורבות לתאים, כמו ראשי תאים שנקטפו דגימות רקמה, באמצעות cytometry זרימה ססגוניות.

כימות מבוססי Cytometry זרימה ססגוניות של המיטוכונדריה, Lysosomes בתאי T

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבודד keratinocytes העור מדגמי העכבר, כדי להכתים עם מתכת מתויג נוגדנים, ולנתח תאים ויטראז על ידי cy, try המונית כדי לפרופיל את דפוס הביטוי של חלבונים של עניין בשלבים שונים מחזור התא.

בידוד וכתמים של העור העכבר Keratinocytes עבור ניתוח מחזור התא הספציפי של חלבון הביטוי הסלולרי על ידי המוני הקיקומטריה

פרוטוקול זה מתאים את מדידות מחזור התא לשימוש בפלטפורמת ציטומטריית מסה. עם היכולות מרובות הפרמטרים של ציטומטריית מסה, מדידה ישירה של שילוב יוד מאפשרת זיהוי תאים בפאזה S בעוד סמני מחזור תוך תאיים מאפשרים אפיון של כל מצב מחזור תא במגוון תנאי ניסוי.

שימוש באנלוגי פירימידין, 5-Iodo-2′-Deoxyuridine (IdU) עם סמני מחזור התא כדי לקבוע שלבי מחזור התא בפלטפורמת ציטומטריית מסה

כאן אנו מציגים את הפרוטוקול לשחזור צעדים של תאים סינתטיים המציגים אנטיגן באמצעות Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים ואת השימוש בהם כדי לחקור את הפלט הסינפטי מתאי T מופעלים.

הכנת Bilayers השומנים הנתמכים על ידי חרוזים לחקר תפוקת החלקיקים של הסינפסות החיסוניות של תאי T

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להכנת חרוזי לטקס לבדיקות באמצעות נוגדני IgY לזיהוי אנטיגן.

סטנדרטיזציה של בדיקת חרוזים ציטומטרית המבוססת על נוגדנים לחלמון ביצה

פרוטוקול זה ידגים מיצוי וניתוח של חומצות שומן ביו-אקטיביות חופשיות ואסטריות מהתאים. חומצות שומן מכומתות במדויק באמצעות דילול איזוטופים יציב, כרומטוגרפיה נוזלית כיראלית, לכידת אלקטרונים, יינון כימי אטמוספרי, ספקטרומטריית מסה לניטור תגובות מרובות (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ליפידים מיצוי נייד עבור דילול ממוקד איזוטופ יציב ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ספקטרומטריית-Mass

אנו בודקים את התוצאות האחרונות שלנו על שילוב של מיקרוסקופ פלואורסצנטי וכלי cytometry זרימת הדמיה בטלפון סלולרי באמצעות קבצים קומפקטיים וחסכוניים Opto-fluidic. מכשירים הבוסס טלפון הסלולרי אלה מייקרו ניתוח עשויים להיות שימושיים לניתוח cytometric, כגון ביצוע משימות ספירת תאים שונות, כמו גם לתפוקה גבוהה הקרנה של דוגמה, דגימות מים בגדרות משאבים מוגבלות.

מיקרוסקופי שדה רחב פלורסנט וזרימת cytometry הדמית פלורסנט בטלפון סלולרי

למד כיצד לכוון יומית ציטומטר מסה CyTOF ולהכין דגימות תאים לניתוח. פרוטוקול זה מדגים כוונון אופטימלי של הגדרות המכשיר, התאמת קצב זרימה ותחזוקה שוטפת לשיפור איכות הנתונים.

Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

גלה סרטונים נוספים