Investigações sobre alterações da função Circuito Hippocampal Após lesão cerebral traumática leve

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar alterações na função da rede de áreas cerebrais afetadas por um modelo experimental de traumatismo cranioencefálico leve. Os experimentos iniciam com a administração de uma lesão por percussão lateral com fluido em um camundongo, o que imita tanto a patologia quanto a sintomatologia do traumatismo cranioencefálico leve em humanos. Como segundo passo, utiliza-se um comportamento dependente do hipocampo, a resposta condicionada de medo contextual, para avaliar o comprometimento cognitivo induzido pela lesão cerebral. Em seguida, empregam-se gravações extracelulares e intracelulares, juntamente com corantes sensíveis à voltagem, para determinar as alterações regionalmente específicas no equilíbrio sináptico entre a transmissão sináptica excitatória e inibitória. Na região de interesse, o hipocampo, os resultados mostram alterações específicas em subregiões na eficácia sináptica líquida no hipocampo, com base nas diferenças entre os camundongos controle e os com lesão cerebral, considerando as três técnicas de gravação descritas.

A principal vantagem desta abordagem é a capacidade de discernir os efeitos tanto do estado patológico quanto dos potenciais tratamentos terapêuticos em múltiplas escalas fisiológicas, permitindo uma visão mais coerente dos déficits desse circuito. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre lesão cerebral traumática, como, especificamente, quais neurônios são mais suscetíveis à lesão e, portanto, contribuem mais significativamente para a disfunção do hipocampo após a lesão. As implicações de nossa abordagem estendem-se ao tratamento da lesão cerebral traumática, pois nos permitem delinear, inicialmente, os mecanismos subjacentes e, em seguida, desenvolver terapias potenciais para restabelecer uma fisiologia normal em áreas danificadas pela lesão cerebral.

Neste procedimento, anestesie o camundongo usando uma mistura de cetamina e xilazina administrada por via intraperitoneal. Em seguida, realize uma craniectomia C sobre a região parietal direita utilizando uma broca com três milímetros de diâmetro externo. Então, fixe o alojamento da agulha lure lock sobre a craniectomia C usando cianoacrilato e acrílico dentário.

24 horas depois, anestesie o camundongo usando isoflurano por inalação. Assim que a respiração normal retornar, mas antes de o camundongo tornar-se sensível à estimulação, aplique um pulso de 20 milissegundos de solução salina sobre o crânio por meio do dispositivo de lesão por percussão líquida. Remova o conector imediatamente após a lesão. Posteriormente, reanestesie o camundongo usando isoflurano e sutura o couro cabeludo.

Manuseie o camundongo em dois dias consecutivos antes do treinamento da resposta condicionada ao medo. No dia do treinamento, coloque o camundongo na câmara de condicionamento por três minutos antes de administrar um choque de 1,5 minuto no piso da câmara por dois segundos. Em seguida, deixe o camundongo na câmara por mais 30 segundos antes de removê-lo.

Após um período de espera de 24 horas, retorne o camundongo à câmara de condicionamento por cinco minutos e, então, avalie o congelamento em intervalos de cinco segundos sete dias após a lesão. Prepare um litro de fluido espinhal cerebral artificial e 250 mililitros de solução de corte com sacarose. Certifique-se de que todos os instrumentos e soluções utilizados durante o preparo de fatias cerebrais estejam gelados com gelo.

Anestesie o camundongo usando isoflurano de forma rápida e suave. Remova o cérebro do camundongo e coloque na sacarose. Em seguida, corte o cérebro.

Coloque a superfície recém-cortada do cérebro sobre uma gota de cola supercola na plataforma do Vibram, em frente a um bloco de ágar. Corte fatias coronais com espessura de 350 mícrons. Você deverá ser capaz de obter quatro ou cinco fatias com o circuito hipocampal intacto.

Após isso, incubar as fatias por pelo menos uma hora a 37 graus Celsius. Agora, preparar alguns eletrodos de vidro borossilicato de dois a cinco mega ohms. Utilizando o puxador vertical, transferir uma fatia para a câmara, em seguida colocar um eletrodo no suporte do eletrodo para gravação do potencial de campo extracelular.

Posicione o eletrodo estimulante acima do trato axonal na fatia, como o caminho perent ou os colaterais de Shafer. Em seguida, continue abaixando o eletrodo de registro na fatia. A seguir, aplique um único pulso elétrico para evocar o potencial pós-sináptico extracelular de campo.

Continue a estimulação variando a profundidade do eletrodo de registro entre os estímulos quando a resposta máxima for alcançada. Isso indica que os eletrodos estão no mesmo nível. A análise no plano Z geralmente consiste em medições, comparando a amplitude do potencial de fibra em camundongos com lesão cerebral e em camundongos submetidos a cirurgia simulada para avaliar a ativação pré-sináptica, bem como comparando a inclinação do PEPSP para avaliar a ativação pós-sináptica. Para gravação com patch clamp, transfira novamente uma fatia para a câmara e abaixe o eletrodo de registro.

Aproxime-se de uma célula com pressão positiva no eletrodo para garantir que o eletrodo de gravação não entupa enquanto se move através do tecido. Quando o eletrodo tocar suavemente a célula, aplique pressão negativa para criar um selo giga entre o eletrodo e a membrana plasmática. Em seguida, aplique ráfagas breves de pressão negativa para romper a membrana plasmática e alcançar a configuração de célula inteira.

Elimine o transitório de capacitância utilizando o amplificador e compense a resistência em série para garantir medições precisas. Em seguida, quantifique e compare a taxa e o tamanho das correntes sinápticas espontâneas em camundongos com lesão cerebral e controles submetidos a cirurgia simulada. Nesta etapa, prepare o estoque do corante misturando um miligrama do corante três onap DHQ em 50 microlitros de etanol.

Dispense alíquotas de dois microlitros em tubos envoltos em papel alumínio e armazene a menos 20 graus Celsius. Prepare diariamente a solução de corante de trabalho em uma diluição de 1 para 200 em LCR A. Em seguida, incube uma fatia sobre papel filtro umedecido com LCR A e marque com 90 microlitros de corante durante 16 minutos.

Depois disso, enxágue-o e coloque-o na câmara de gravação de interface. Posicione os eletrodos estimulantes e de gravação conforme descrito no campo extracelular. Gravação do potencial.

Ajuste a intensidade da estimulação luminosa até que a resposta esteja centralizada no meio da câmera. As imagens de alcance são tipicamente adquiridas a uma taxa de 500 a 1000 quadros por segundo. Dispare o obturador para a estimulação luminosa 200 milissegundos antes da estimulação elétrica para permitir que o fotoesbranquecimento inicial rápido se estabilize.

Pausar 10 segundos entre os ensaios. Alternar os ensaios de aquisição entre estimulação elétrica e não estimulação elétrica para permitir a subtração posterior do fundo de não estimulação elétrica. Em seguida, registrar a intensidade de luz de repouso antes de abrir o obturador.

Cada ensaio de VSD pode ser analisado como um filme de leituras de fluorescência. Ou seja, cada ensaio é uma matriz tridimensional de dados com valores nas dimensões espaciais X e Y ao longo do tempo. Registre de 10 a 12 ensaios de VSD em cada condição de teste e calcule a variação da fluorescência normalizada por pixel pré-iluminação conforme o manuscrito acompanhante.

Esta figura mostra um exemplo de gravação F-E-P-S-P na área CA1. O primeiro desvio descendente é o artefato do estímulo, seguido pela onda de fibra pré-sináptica e, em seguida, pelo F-E-P-S-P. Abaixo estão as curvas entrada-saída que retratam uma diminuição da eficácia sináptica líquida em CA1 após lesão por percussão líquida.

E aqui estão as curvas entrada-saída que mostram um aumento na eficácia sináptica líquida no giro denteado após a lesão por impacto fechado (FPI). Aqui há um exemplo de uma corrente pós-sináptica excitatória espontânea de uma célula paramedial do CA1. Aqui há um exemplo de um trem de potenciais de ação de uma célula paramedial do CA1 e de um interneurônio do CA1 de disparo rápido.

Este é um interneurônio inibitório preenchido com amarelo de Lucifer no hipocampo CA1 sem espinhos dendríticos, e aqui está um neurônio parametal do CA1 preenchido com amarelo de Lucifer com espinhos dendríticos. Essas figuras mostram um corte coronal do hipocampo de camundongo. Os pixels de amarelo a vermelho representam a atividade excitatória na região CA1, 14 milissegundos após a estimulação aferente do colateral de Schaffer.

O vermelho indica maior despolarização, enquanto o amarelo indica uma despolarização menor, mas ainda significativa. Os pixels azuis representam os locais de atividade inibitória na área CA1 56 milissegundos após a mesma estimulação colateral aferente de Schaffer, sendo que o azul mais escuro indica maior hiperpolarização. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como combinar múltiplas técnicas de registro ex vivo para abordar uma condição patológica clinicamente relevante que envolva disfunção de circuito.