Estudo quantitativo de locomoção livremente Natação Micro-organismos Usando Difração Laser

O objetivo geral deste procedimento é medir as frequências de debulhação de organismos microscópicos nadando livremente. Isso é feito preparando primeiro uma amostra de vermes microscópicos. Em seguida, a configuração óptica é preparada.

Em seguida, o padrão de difração introduzido pelos organismos vivos é registrado. Finalmente, os dados registrados são analisados para determinar as frequências de natação. Em última análise, a análise de difração é usada para mostrar mudanças nos padrões de locomoção de vermes irrestritos.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a microscopia tradicional, é que os padrões de natação podem ser observados à medida que a espécie se move livremente em um espaço tridimensional. Embora esse método possa fornecer informações sobre a elegância do mar nadando livremente, ele também pode ser aplicado a outros organismos transparentes, pequenos e microscópicos expostos a condições variadas. Para configurar a elegância C para análise de vídeo, comece usando uma palheta de fio de platina achatada para mover 10 a 20 nematóides adultos GR para NGM fresco.

Placas de Petri cheias de ágar contendo pequenas manchas circulares de E. coli. Deixe os nematóides botarem ovos por três a cinco horas e, em seguida, remova os adultos. Assim, estabelecendo uma pequena cultura sincronizada com o desenvolvimento de 50 a 150 nematóides para cultivar os nematóides até o início da idade adulta, incubar as placas de Petri a 20 graus Celsius por quatro a cinco dias.

No dia da análise do vídeo, use um mililitro de água destilada deionizada para lavar um prato de nematóides adultos jovens, coletando assim de 50 a 150 vermes da cultura sincronizada. Use uma microcentrífuga para girar os vermes até o fundo do tubo ou deixe-os assentar por gravidade por cerca de 15 minutos. Ele remove a maior parte da água do tubo e a substitui por um mililitro de água destilada deionizada para lavar qualquer bactéria aderente dos nematóides.

Usando uma micropipeta, transfira de cinco a 10 nematóides em água para um veterinário de quartzo. Monte a configuração óptica como mostrado aqui, usando um laser de néon de hélio de 543 nanômetros para sobreamostragem de dois espelhos de alumínio de superfície frontal usados para direcionar o feixe de laser através do vete, um suporte vete, uma tela de projeção e uma câmera de alta velocidade capaz de filmar a aproximadamente 240 quadros por segundo. Em seguida, use um pedaço de paraforma para cobrir a parte superior do vete e inverta-o para misturar os nematóides na coluna d'água.

Coloque o vete em um suporte vete de forma que as minhocas fiquem inicialmente perto do topo do vete. Usando os espelhos, dirija o feixe de laser através do centro do vete. Como os nematóides são mais densos que a água, eles cairão lentamente no fundo do vete enquanto nadam dentro da coluna de água na tela de projeção, colorem o ponto correspondente ao feixe de laser transmitido de preto para reduzir a dispersão à medida que o feixe transmitido encontra a tela de projeção.

Eliminar ou reduzir a dispersão do feixe transmitido evitará que a matriz CCD da câmera sature devido ao feixe transmitido. Para capturar uma medida do tamanho do padrão de difração, desenhe uma linha de cerca de cinco centímetros na tela de projeção ao lado do ponto do feixe de laser transmitido sem interferir na imagem de luz difratada. Desligue a luz da sala e grave imagens de difração na tela à medida que os vermes passam pelo feixe de laser.

Para preparar os dados de vídeo, instale o seguinte programa de análise de vídeo e importe o vídeo para o programa. Defina a origem para coincidir com o ponto de laser transmitido usando o software. Rastreie o deslocamento angular da imagem de difração formada por cada nematóide.

Copie e cole dados em uma planilha e adicione 180 graus ou PI para todos os ângulos negativos. Para produzir um gráfico contínuo. Usando a configuração de análise de vídeo, coloque um fotodiodo com uma pequena área fora do centro no padrão de difração diretamente na frente da tela de projeção via uma porta USB.

Conecte o fotodiodo ao osciloscópio digital que se conecta ao computador. Observe os padrões de debulha na tela do computador. Salve conjuntos de dados em formato ASCI ou texto para analisar os dados.

Use o vídeo ou a foto para importar os dados para um programa de análise de dados capaz de ajustar formas de onda. Usando a minimização de chiqua, ajuste uma curva senoidal para determinar a frequência de debulhação. Calcule a média das frequências de natação de várias amostras e determine a variância.

Para este estudo, os dados foram analisados estatisticamente usando um único fator Inova, seguido pelo Bon Ferran. Teste de comparações múltiplas Um valor de P inferior a 0,05 é considerado estatisticamente significativo para modelar padrões de difração. Comece usando um microscópio para tirar imagens para izar uma imagem.

Arraste-o para o Mathematica. Use o comando olhos binários para convertê-lo em preto e branco. Como alternativa, use o comando de detecção de borda para criar uma imagem em preto e branco em que os dois números à direita controlam a aspereza das bordas resultantes.

Em seguida, usando o comando image data, converta a imagem em uma matriz de zeros e uns. Use o comando forer para forer, transforme a matriz, eleve ao quadrado o valor absoluto da matriz e visualize a imagem resultante, que é o padrão de difração correspondente à imagem original. Além disso, use a função log para dimensionar o contraste da imagem.

Finalmente, compare os padrões de difração do modelo com os padrões de difração obtidos de vermes nadando livremente. Neste exemplo, a elegância do mar foi estudada em um veterinário de quartzo Q, com um centímetro de largura, cinco milímetros de espessura e quatro centímetros de altura. Amostragem de um único worm usando análise de vídeo.

A frequência média de natação obtida a partir da análise de vídeo em um veterinário de cinco milímetros de espessura foi de cerca de 2,5 hertz. Da mesma forma, a amostragem de um único verme usando o método de aquisição de dados em tempo real e um osciloscópio digital resultou em uma frequência de natação de cerca de 2,7 hertz. Este procedimento pode ser repetido para muitos vermes.

Um estudo detalhado de vermes nadando livremente revelou uma frequência média de natação de 2,37 hertz em um vete de cinco milímetros. Como esperado, a frequência de natação é maior do que a de um verme rastejante. Usando este método de difração, descobriu-se que as frequências médias de natação de uma elegância do mar, que está confinada a uma lâmina de microscópio, correspondem ao valor publicado anteriormente de dois hertz.

Seguindo o vídeo. A preparação de dados e modelagem de padrões de difração demonstrados neste vídeo permitem a modelagem de padrões de difração de natação. Com a ajuda de imagens de vermes obtidas com um microscópio convencional, os padrões de difração modelados são usados para simular um ciclo de natação da elegância do mar.

Um modelo bem-sucedido consiste no sucesso fisicamente viável dos padrões de natação, combinando as frequências de natação. O verme deve estar na mesma forma no final do ciclo de natação que estava no início de um ciclo de natação. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em menos de um minuto para cada verme usando a dieta rápida de fotos enquanto observa os ciclos de natação na tela do computador.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar os nematóides que nadam livremente.