Name: Estudo quantitativo de locomoção livremente Natação Micro-organismos Usando Difração Laser (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Aprenda a analisar a locomoção de C. elegus usando padrões de difração a laser em ambiente tridimensional. Este método permite medir frequências de natação em organismos microscópicos de forma não invasiva e em tempo real.

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Agradecemos Tzlil Rozenblat, Alexandra Bello e Karl Spuhler para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Faculdade Vassar Graduação Pesquisa Summer Institute (URSI), Maynard Lucy Fundo de Investigação salmão eo prêmio NASA # NX09AU90A, National Science Foundation Centro de Excelência de Pesquisa em Ciência e Tecnologia (NSF-CREST) ​​prêmio # 0630388 e da NSF prêmio # 1058385.

1. C. elegans Preparação para Análise de Vídeo <ol><li> Mova 10-20 nemátodos adultos grávidos para placas de agar fresco NGM cheios de Petri, utilizando um fino fio achatado picareta platina. As placas de Petri cheio com o agar NGM conter uma pequena mancha circular de E. coli (estirpe um crescimento limitado, OP50, dá os melhores resultados) para os nematóides para comer. Permitir que os nematóides para colocar ovos de 3-5 horas e, em seguida, remova os adultos, estabelecendo assim uma cultura pequena, developmentally sincronizado de 50-150 nematóides. Permitir que os nemátodos a crescer até à idade adulta precoce, incubando as placas de Petri a 20 ° C durante 4-5 dias. Estes métodos baseiam-se na cultura de procedimentos estabelecidos (Stiernagle 2006) 5. </li><li> No dia da análise de vídeo, lavar a placa de nemátodos adultos jovens com 1 ml de água desionizada destilada, recolhendo assim 50-150 vermes da cultura sincronizados. Uma solução tampão M9 ou PBS como também pode ser usado. Use uma microcentrífuga para girar a wORMs para a parte inferior do tubo, ou que permitam a resolver pela força da gravidade para cerca de 15 min. Remover a maior parte da água a partir do tubo e substitui-la com 1 ml de água desionizada destilada, a fim de lavar as bactérias que aderem a partir dos nematóides. </li><li> Transferir nematóides em água ou tampão para uma cuvette de quartzo utilizando uma micropipeta. É importante trabalhar com um número pequeno, a cerca de 5-10 nemátodes no total de uma só vez ou até mesmo menos, de modo que um nemátodo de cada vez é susceptível de ser iluminada pelo laser. Se o número de nemátodos sobre as placas de cultura é muito grande, os vermes diluir em água ou tampão até uma densidade desejada seja atingida. Também é possível escolher os nemátodos individuais para uma gota de água ou tampão numa placa de ágar fresco para lavá-los e transferir vermes individuais para a cuvete. Em nosso estudo, foram utilizados 1 mm, 2 mm e 5 mm para tamanhos cuvete examinar os efeitos de restrições físicas em nadar comportamento. </li></ol> 2. Configuração ópticos para a Analysi vídeos <ol><li> Faça a configuração como mostra a Figura 1, usando um 543 nm (verde) Hélio-Neon (HeNe) laser, dois espelhos frente da superfície de alumínio, um detentor cuvete, uma tela de projeção, e uma câmera de alta velocidade (Casio High Speed ​​Exilim) capazes de filmar em ~ 240 fps. Os dois espelhos são usados ​​para dirigir o feixe de laser através da cuvete. Os tamanhos diferentes de cuvetes pode ser utilizado, dependendo da natureza do estudo. Como um exemplo, utilizou-se cuvetes que 5 mm de espessura para mostrar os efeitos de limitações espaciais em frequências de natação. O feixe de laser deve satisfazer os requisitos de sobreamostragem,. Isto é, o organismo deve obstruir não mais do que um terço do raio laser. Para C. elegans, o feixe de laser deve ser de cerca de 2 mm de diâmetro quando ele interage com um nemátodo. O feixe de laser não deve ser maior do que 5 mm de diâmetro uma vez que o padrão de di fracção será difícil de localizar. A distância a partir do organismo de difração para a tela deve ser muito maior do queo próprio organismo. </li><li> Parafilme lugar sobre a parte superior da cuba e inverter para misturar os nemátodos na coluna de água. Coloque a cuvete num suporte de cuvete de modo a que os vermes são inicialmente perto do topo do cadinho. Usando os espelhos, dirigir o feixe de laser através do centro da cuvete. Uma vez que os nemátodes são mais densos do que a água, que vai lentamente cair para o fundo da tina, enquanto que, ao mesmo tempo nadando na coluna de água. </li><li> Na tela de projecção de cor, a mancha correspondente ao feixe laser transmitido negro para diminuir a dispersão do que o feixe transmitido se encontra com o ecrã de projecção (Figura 2). Alternativamente colocar uma abertura no ecrã de projecção para permitir que o feixe transmitido para passar através da tela. Eliminar ou reduzir a dispersão do feixe transmitido irá manter a matriz CCD da câmara de saturação em função do feixe transmitido. </li><li> Para capturar uma medida do tamanho do padrão de difracção, desenhar uma linha decerca de 5 cm no ecrã de projecção ao lado do ponto de laser de feixe transmitido, sem interferir com a imagem de luz difractada. </li><li> Iniciar a gravação com a câmera enquanto a luz do quarto está no modo que a linha de 5 cm é sobre a mesma metragem como as imagens de difração. Desligue a luz da sala. Gravar imagens de difração na tela com a câmera como vermes passam pelo feixe de laser. </li></ol> 3. Preparação de dados de vídeo <ol><li> Instale o programa de vídeo análise (Logger Pro: <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> ) no computador. Importe o vídeo para programa de análise de vídeo </li><li> Definir a origem de forma a coincidir com o ponto de laser transmitido. Defina a escala usando a linha de 5 cm na tela de projeção. </li><li> Controlar o deslocamento angular da imagem de difracção formado por cada nemátodo usando o software de análise de vídeo (figura 3) </li><li> Para encontrar o angular deslocamento tomando o arctan (y / x), copiar e colar dados em uma planilha eletrônica (Excel) e adicionar 180 graus ou π para todos os ângulos negativos para produzir um gráfico contínuo (Figura. 4). </li></ol> 4. Real Time de Aquisição de Dados para a observação instantânea de Frequências Natação <ol><li> Usando a mesma configuração como para a análise de vídeo, coloque um fotodíodo (DET10A de Thorlabs) com uma área pequena (~ 1 mm 2) para fora do centro do padrão de difracção em frente do ecrã de projecção. </li><li> Conecte o fotodiodo para o osciloscópio digital (PicoScope feito por tecnologia Pico) que se conecta ao computador via porta USB. Observar os padrões thrashing na tela do computador. </li><li> Salvar conjuntos de dados adquiridos em formato ASCII ou texto. </li></ol> 5. Análise de Dados <ol><li> Importe os dados adquiridos através de vídeo ou o fotodiodo em um programa de análise de dados capaz de encaixe onda qui-quadrado de minimização. O programa usado aqui é Origem ( <a href="http://www.originlab.com/" target="_blank">http://www.originlab.com/</a> ). Traçar uma curva sinusoidal para determinar a freqüência goleada (Figuras 4 e 5). </li><li> Média de freqüências de natação de várias amostras e determinar variância. Para este estudo, os dados foram analisados ​​estatisticamente utilizando uma ANOVA factor único seguido pelo teste de comparações múltiplas de Bonferroni. Um valor de p &lt;0,05 foi considerado estatisticamente significativo. </li></ol> 6. Modelo Padrões de difração usando Mathematica como Exemplo Nota: os padrões de difração pode ser modelada utilizando diversas ferramentas computacionais. Este procedimento será diferente para diferentes ferramentas computacionais, como MatLab, Excel, origem, etc <ol><li> Criar Imagem: Tire fotos de nematóides em uma lâmina de microscópio utilizando um microscópio tradicional. </li><li> Binarize imagem: Importar &#39;Verme&#39; a imagem verme into Mathematica, arrastando a imagem em Mathematica. Converter a imagem em uma imagem em preto e branco (binarize). Isto pode ser conseguido com o &#39;Binarize&#39; comando em Mathematica: BlackandWhiteImage = Binarize [Worm]. A imagem pode ser vista como uma imagem em preto e branco. Como alternativa, use o comando &#39;EdgeDetect&#39; para criar uma BlackandWhiteImage: EdgeDetect [Worm, 6.0,0.035], onde os dois números finais controlar a aspereza das bordas resultantes. </li><li> Converter a imagem em uma matriz de zeros e uns: Isso pode ser alcançado com o &quot;ImageData &#39;comando no Mathematica: Matrix = ImageData [BlackandWhiteImage]. </li><li> Transformada de Fourier matriz: Use o comando &quot;Fourier&quot; em Mathematica para Fourier transformar a matriz usando as FourierParameters indicados: FTransform = Fourier [Matrix, FourierParameters -&gt; {0, -2}]. </li><li> Módulo quadrado da matriz para obter a matriz de difração e melhorar o contraste da imagem: Praça do absolutovalor da matriz e visualizar a imagem resultante, que é o padrão de difracção correspondente à imagem original. Além disso, usar o &#39;Log&#39; função para escalar o contraste da imagem: ImageContrast = Imagem [Log [1 + (Abs [FTransform]) ^ 2] / 0,5]. </li><li> Redimensionar a imagem para facilitar a visualização: Cortar o padrão de difração central e redimensionar como desejado: ImageResize [ImageContrast [y, 100], 500]. </li><li> Comparar os padrões de difração modelados com padrões de difração obtidos de vermes livremente natação. (Figura 6) </li></ol>

<ol><li>Korta, J., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mahadevan, L., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+mechanical+load+modulate+the+locomotory+gait+of+swimming+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and mechanical load modulate the locomotory gait of swimming C. elegans.</a> J. Exp. Biol. 210, (2007).</li>
<li>James, J. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJames%2C+JF+%22A+student%27s+guide+to+Fourier+transforms+with+applications+in+physics+and+engineering%22">A student's guide to Fourier transforms with applications in physics and engineering</a>. , Cambridge Univ. Press. (1995).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 20982-20987 (2008).</li>
<li>Li, W., Feng, Z., Sternbert, P. W., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+stretch+receptor+neuron+revealed+by+a+mechanosensitive+TRP+channel+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans stretch receptor neuron revealed by a mechanosensitive TRP channel homologue.</a> Nature. 440, 684-687 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22WormBook%22">WormBook</a>. ed, W. ormB. ook, , (2006).</li>
<li>Dynamic Diffraction Analysis and the Transformation of C. elegans. Eells, R., Lueckheide, M., Magnes, J., Susman, K., Rozenblat, T., Kakhurel, R. Symposium for Undergraduate Research, Division of Laser Science (APS) - LS XXVII, San Jose, CA, , (2011).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Melikechi, N., Sampson, A., Eells, R., Bello, A., Lueckheide, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Freely+Swimming+C.+elegans+using+Laser+Diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22O.+J.+Biphys%22%5BJournal%5D)">Analysis of Freely Swimming C. elegans using Laser Diffraction.</a> O. J. Biphys. , (2012).</li>
<li>Magnes, J., Raley-Susman, K. M., Sampson, A., Eells, R. Locomotive Analysis of C. Elegans through Diffraction, Control number: 348 Session: JTuA - Joint FiO/LS Poster Session I Pres. number: JTuA39. FiOs/LS, October 26, Rochester, NY, , (2010).</li>
<li>Kim, N., Dempsey, C. M., Kuan, C. J., Zoval, J., O'Rourke, E., Ruvkun, G., Madou, M. J., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gravity+fource+transduced+by+the+MEC-4%2FMEC-10+DEG%2FEnaC+channel+modulates+DAF-16%2FFoxO+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gravity fource transduced by the MEC-4/MEC-10 DEG/EnaC channel modulates DAF-16/FoxO activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 177, 835-845 (2007).</li>
<li>Park, S., Hwang, H., Nam, S. -W., Martinez, F., Austin, R. H., Ryu, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Caenorhabditis+elegans+locomotion+in+a+structured+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced Caenorhabditis elegans locomotion in a structured microfluidic environment.</a> PLOS One. 3, e2550(2008).</li>
<li>Keller, H. E. Objective Lenses for Confocal Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeller%2C+HE+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd edition, Springer. 145-161 (2006).</li>
<li>Conrad, J. Depth of Field in Depth. , Large Format Page. Available from: 
 
 <a target="_blank" href="http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf">http://www.largeformatphotography.info/articles/DoFinDepth.pdf</a> (2011).</li>
<li>Martin, L. C. TECHNICAL OPTICS. II, Pitman Publishing Corporation. (1950).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós desenvolvemos uma nova abordagem para a medição em tempo real, de circulação e de comportamentos simples locomotor em organismos microscópicos como nemátodos que não requer a utilização de microscópios. 8 Esta abordagem metodológica também poderiam ser utilizados para o estudo de vários organismos microscópicos como protistas. Este método só é limitada pelo comprimento de onda da luz utilizada. O organismo não deve ser menor do que o comprimento de onda da luz. Além da economia de custos e a portabilidade do equipamento necessário, uma vantagem desta abordagem é a possibilidade de medir o comportamento em tempo real e em três dimensões, sem as limitações estreitas de planos de imagem sob um microscópio. É também possível com esta técnica para examinar influências das forças gravitacionais ou numerosas outras condições de comportamento que não podem ser estudados utilizando as abordagens baseadas em microscópio. 9 Assim, pode-se obter uma melhor compreensão do microorganismo natural, locomotora comportaviors libertados a partir dos limites de gotículas de lâmina de microscópio ou câmaras especializadas microfluídicos (Park et al, 2008). 10 A falta de informação de fase num modelo de difracção não permite a recuperação directa de a imagem correspondente ao objeto difração desde que o padrão de difracção de campo distante é proporcional ao quadrado do valor absoluto da transformada de Fourier. Estamos portanto calcular padrões de difracção a partir de imagens de vermes de modo que possam ser comparados com os padrões de difracção de nemátodos livremente natação (Figura 6). Este método produziu resultados para realmente nadar livremente C. elegans e pode ser aplicado a qualquer espécie microscópicos que manobras em um ambiente opticamente transparente como a água ou diversas soluções iónicas. Microscópios convencionais só permitem estudos com uma profundidade focal da ordem de micrômetros. 11 Isto é devido à limitadaprofundidade de campo quando o foco de luz: <img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412eq1.jpg" /> em que o número f-N tem uma relação de reciprocidade com o círculo de confusão (c) de modo que uma distância focal curta está associado a uma grande c. 12,13 Embora este método de difracção não é certamente um substituto para microscopia convencional, é capaz para fornecer resultados quantitativos rapidamente, de modo que mesmo as espécies podem ser manipulados em tempo real a baixo custo. Os padrões de difracção pode ser obtida com qualquer ponteiro laser. Os padrões de difração pode ser filmado em uma resolução reduzida temporal utilizando uma câmera digital comum. Enquanto o usuário não pode ter um microscópio ou um fotodiodo prontamente disponíveis, as peças-chave deste experimento, como medir freqüências debulhando e avaliar os padrões de difração pode ser concluída a um custo extremamente baixo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> 543 nm Laser HeNe </td><td> Melles Griot </td><td> LGX1 </td><td> Qualquer laser na gama do visível, com menos do que 5 mW pode ser usado. </td></tr><tr><td> 2 Os espelhos de alumínio superfície frontal </td><td> Thorlabs </td><td> PF10-03-F01 </td><td></td></tr><tr><td> High Speed ​​Exilim Câmara </td><td> Casio </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Quartzo Cuvette </td><td> Células Starna </td><td> 21/G/5 </td><td></td></tr><tr><td> LoggerPro (Software) </td><td> Vernônio </td><td></td><td> <a href="http://www.vernier.com/products/software/lp/" target="_blank">http://www.vernier.com/products/software/lp/</a> </td></tr><tr><td> Mathematica 8 </td><td> Volfrâmio </td><td></td><td&gt; <a href="http://www.wolfram.com/" target="_blank">http://www.wolfram.com/</a> </td></tr></tbody></table>

estudo quantitativo de locomoção livremente natação micro-organismos usando difração laser

Quantitative Locomotion Study of Freely Swimming Micro-organisms Using Laser Diffraction

Solo e organismos microscópicos aquáticos vivem e se comportam em um ambiente tridimensional complexa. A maioria dos estudos de comportamento organismo microscópico, pelo contrário, foram realizados utilizando microscópio abordagens, que limitam o movimento e comportamento de um estreito campo quase bidimensional focal. Uma Apresentamos uma nova abordagem analítica que fornece em tempo real A análise de livremente nadar C. elegans num cuvete sem dependência de equipamento microscópio baseada. Esta abordagem consiste em acompanhar a periodicidade temporal de padrões de difração gerados por direcionar a luz de laser através da cuvete. Medimos freqüências de oscilação para os nematóides livremente natação. Análise dos padrões de difracção de campo distante revela pistas sobre as formas de onda dos nematóides. Difração é o processo de dobragem de luz em torno de um objecto. Neste caso, a luz é difratada pelos organismos. As ondas de luz interferem e podem formar anúncioiffraction padrão. Um campo distante, ou de Fraunhofer, o padrão de difração é formado se a distância tela-objeto é muito maior do que o objeto difração. Neste caso, o padrão de difracção podem ser calculadas (modelada) utilizando uma transformada de Fourier. Dois C. elegans são de vida livre do solo-moradia nematóides que navegam em três dimensões. Eles se movem ambos em uma matriz sólida como o solo ou ágar em um padrão sinusoidal locomotora chamado rastreamento e no líquido em um padrão diferente, chamado de natação. Três os papéis desempenhados por informações sensoriais fornecidas pelo mecanosensorial, chemosensory, e as células thermosensory que governam mudanças plásticas em locomotora padrões e interruptores em padrões estão apenas começando a ser elucidado. 4 Nós descrevemos uma abordagem óptica para medir a locomoção de nematóides em três dimensões que não requerem um microscópio e vai nos permitir começar a explorar as complexidades de locomoção do nematóide, em co diferentenditions.

<html> Como um exemplo, estudamos C. elegans em um quartzo cubeta 1 cm de largura, 5 mm de espessura e 4 cm de altura cuvete. Amostragem de um sem-fim único, utilizando a análise de vídeo, a frequência de natação médio obtido a partir da análise de vídeo numa cuvete de 5 mm de espessura é de cerca de 2,5 Hz (Figura 4). Do mesmo modo, a amostragem de um sem-fim único, utilizando o método de aquisição em tempo real de dados, obtém-se uma frequência de natação de cerca de 2,7 Hz (Figura 5), utilizando o osciloscópio digital (PicoScope). Este procedimento pode ser repetido para muitos vermes. Um estudo detalhado de vermes que nadam livremente revelou uma frequência média de natação de 2,37 Hz a uma cuvette de 5 mm. 6 Tal como esperado, a frequência de natação é maior do que para um verme rastejante (~ 0,8 Hz). 3 Usando este método de difracção, o média freqüências de natação de um C. elegans, que se limita a uma lâmina de microscópio, verificou-se coincidir com o valor publicado anteriormente de 2 Hz. 1,7 ve_content &quot;&gt; Seguindo procedimentos 3.) e, em seguida, 6.) permite a modelagem de natação padrões de difracção, com a ajuda do sem-fim imagens obtidas com um microscópio convencional. Os padrões de difracção modelados são usados ​​para simular um ciclo de mergulho da C. elegans ( Figura 6). Um modelo de sucesso consiste fisicamente realizáveis ​​padrões nadar sucessivas correspondentes as frequências de natação. O sem-fim deve ser a mesma forma que no final de um ciclo de mergulho como foi no início de um ciclo de mergulho. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig1.jpg" /> Figura 1. Um verde laser HeNe foi usado para criar um padrão de difracção dinâmica usando vivo C. elegans. Este padrão de difração foi filmado a 240 fps. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig2.jpg" /> Figura 2. Dra<html> asa de um ponto preto aumenta a absorção do feixe transmitido. Saturação da câmara devido a luz dispersa é reduzida e o padrão de difracção se torna visível. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig3.jpg" /> Figura 3. Captura de tela do software de análise de vídeo (Logger Pro), com um padrão de difração worm que está sendo monitorado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4412/4412fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig4.jpg" /> Figura 4. Os dados de vídeo que correspondem ao ciclo de mergulho de um nemátodo numa cuvete de 5 mm. O ajuste da curva revela uma frequência de natação Hz ~ 2,5. &quot;/&gt; Figura 5. Dados em tempo real que correspondem ao ciclo de mergulho de um nemátodo numa cuvete de 5 mm. O ajuste da curva revela uma frequência de natação Hz ~ 2,7. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4412/4412fig6.jpg" /> Figura 6. A linha superior representa os padrões de difração de reais e é comparado com os padrões de difração modelados na linha de fundo. Os padrões de difracção modeladas foram produzidas usando vermes sobre uma lâmina de microscópio (linha do meio).

Organismos microscópicos, como o nematóide de natação livre<em&gt; C. elegans</em&gt;, Viver e se comportar em um ambiente tridimensional complexa. Nós relatamos uma nova abordagem que prevê a análise de<em&gt; C. elegans</em&gt; Usando os padrões de difração. Esta abordagem consiste em acompanhar a periodicidade temporal de padrões de difração gerados por direcionar a luz de laser através de uma cuvete.

Estudo quantitativo de locomoção livremente Natação Micro-organismos Usando Difração Laser

Organismos microscópicos do solo e aquáticos vivem e se comportam em um ambiente tridimensional complexo. A maioria dos estudos sobre o comportamento de organismos microscópicos, em ...

O objetivo geral deste procedimento é medir as frequências de movimento oscilatório de organismos microscópicos nadando livremente. Isso é realizado primeiramente preparando uma amostra de vermes microscópicos. Em seguida, o arranjo óptico é preparado.Então, o padrão de difração introduzido pelos organismos vivos é registrado. Por fim, os dados registrados são analisados para determinar as frequências de natação. Em última instância, a análise de difração é utilizada para mostrar alterações nos padrões de locomoção de vermes sem restrições.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a microscopia tradicional, é que os padrões de natação podem ser observados enquanto a espécie se move livremente em um espaço tridimensional. Embora este método possa fornecer informações sobre a natação livre de C. elegans, ele também pode ser aplicado a outros organismos transparentes, pequenos e microscópicos expostos a condições variadas. Para preparar C. elegans para análise de vídeo, comece usando uma alça de fio de platina achatada para transferir de 10 a 20 nematoides adultos GR para um meio NGM fresco.Placas de Petri com ágar contendo pequenas manchas circulares de e coli. Deixe os nematoides depositarem ovos por três a cinco horas e, em seguida, remova os adultos. Assim, estabelece-se uma pequena cultura com desenvolvimento sincronizado de 50 a 150 nematoides; para cultivar os nematoides até a fase inicial da idade adulta, incube as placas de Petri a 20 graus Celsius por quatro a cinco dias.No dia da análise em vídeo, use um mililitro de água destilada desionizada para lavar uma placa de nematoides jovens adultos, coletando assim 50 a 150 vermes da cultura sincronizada. Use uma microcentrífuga para sedimentar os vermes no fundo do tubo ou deixe-os sedimentar por gravidade por cerca de 15 minutos. Remova a maior parte da água do tubo e substitua por um mililitro de água destilada desionizada para remover eventuais bactérias aderidas aos nematoides.Usando uma micropipeta, transfira de cinco a dez nematoides em água para um vete de quartzo. Monte a configuração óptica conforme mostrado aqui, utilizando um laser de hélio-neônio de 543 nanômetros para superamostragem, dois espelhos de superfície frontal de alumínio usados para direcionar o feixe do laser através do vete, um suporte para vete, uma tela de projeção e uma câmera de alta velocidade capaz de filmar a aproximadamente 240 quadros por segundo. Em seguida, use um pedaço de paraforma para cobrir a parte superior do vete e inverta-o para misturar os nematoides na coluna de água.Coloque o tubo em um suporte para tubo de modo que os vermes fiquem inicialmente próximos ao topo do tubo. Usando os espelhos, direcione o feixe do laser através do centro do tubo. Como os nematoides são mais densos que a água, eles cairão lentamente para o fundo do tubo enquanto nadam na coluna de água; na tela de projeção, pinte de preto a região correspondente ao feixe de laser transmitido para reduzir a dispersão quando o feixe transmitido atingir a tela de projeção.Eliminar ou reduzir o espalhamento do feixe transmitido manterá a matriz CCD da câmera sem saturação devido ao feixe transmitido. Para capturar uma medida do tamanho do padrão de difração, trace uma linha de cerca de cinco centímetros na tela de projeção ao lado do ponto do feixe de laser transmitido, sem interferir na imagem da luz difratada. Desligue a luz do ambiente e registre as imagens de difração na tela enquanto os vermes passam pelo feixe de laser.Para preparar os dados do vídeo, instale o seguinte programa de análise de vídeo e importe o vídeo para o programa. Defina a origem para coincidir com o ponto do laser transmitido usando o software. Acompanhe o deslocamento angular da imagem de difração formada por cada nematódeo.Copie e cole os dados em uma planilha e adicione 180 graus ou PI para todos os ângulos negativos, a fim de produzir um gráfico contínuo. Usando a configuração de análise de vídeo, posicione um fotodiodo com uma pequena área descentralizada no padrão de difração diretamente em frente à tela de projeção por meio de uma porta USB.Conecte o fotodiodo ao osciloscópio digital que está conectado ao computador. Observe os padrões de movimento na tela do computador. Salve os conjuntos de dados em formato ASCI ou texto para analisar os dados.Use o vídeo ou a foto para importar os dados para um programa de análise de dados capaz de ajustar formas de onda. Utilizando o método de minimização qui-quadrado, ajuste uma curva senoidal para determinar a frequência de contorção. Calcule a média das frequências de natação de várias amostras e determine a variância.Para este estudo, os dados foram analisados estatisticamente utilizando um fator único Inova, seguido pelo Bon Ferran. O teste de comparações múltiplas considerou um valor de P inferior a 0,05 como estatisticamente significativo para modelar padrões de difração. Comece usando um microscópio para capturar imagens a fim de dimensionar uma imagem.Arraste-o para o Mathematica. Use o comando binary eyes para convertê-lo em preto e branco. Alternativamente, use o comando edge detect para criar uma imagem em preto e branco, em que os dois números finais controlam a grossura das bordas resultantes.Em seguida, utilizando o comando de dados da imagem, converta a imagem em uma matriz de zeros e uns. Use o comando forer para transformar a matriz, eleve ao quadrado o valor absoluto da matriz e visualize a imagem resultante, que é o padrão de difração correspondente à imagem original. Além disso, utilize a função logarítmica para ajustar o contraste da imagem.Por fim, compare os padrões de difração do modelo com os padrões de difração obtidos de vermes nadando livremente. Neste exemplo, foram estudados exemplares de sea elegance em uma cubeta de quartzo Q, com um centímetro de largura, cinco milímetros de espessura e quatro centímetros de altura. Análise de vídeo para amostrar um único verme.A frequência média de natação obtida a partir da análise de vídeo em um meio com espessura de cinco milímetros foi de aproximadamente 2,5 hertz. De forma semelhante, a amostragem de um único verme utilizando o método de aquisição de dados em tempo real e um osciloscópio digital resultou em uma frequência de natação de cerca de 2,7 hertz. Este procedimento pode ser repetido para muitos vermes.Um estudo detalhado de vermes nadando livremente revelou uma frequência média de natação de 2,37 hertz em um vete de cinco milímetros. Como esperado, a frequência de natação é maior do que aquela de um verme rastejando. Utilizando este método de difração, descobriu-se que as frequências médias de natação de uma *elegância marinha*, confinada a uma lâmina de microscópio, correspondem ao valor previamente publicado de dois hertz.Após o vídeo. A preparação de dados e a modelagem de padrões de difração demonstradas neste vídeo permitem a modelagem de padrões de difração de natação. Com a ajuda de imagens de vermes obtidas com um microscópio convencional, os padrões de difração modelados são utilizados para simular um ciclo de nado do sea elegance.Um modelo bem-sucedido consiste em padrões de natação fisicamente viáveis, compatíveis com as frequências de natação. O verme deve apresentar a mesma forma ao final do ciclo de natação que tinha no início do ciclo. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em menos de um minuto para cada verme, utilizando a dieta fotográfica rápida enquanto se observam os ciclos de natação na tela do computador.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar nematoides nadando livremente.

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Research

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