Preparação e inativação de patógenos de dose dupla de Buffy produtos de plaquetas revestimento utilizando o Sistema de Sangue INTERCEPT

Neste vídeo, um concentrado de plaquetas em dose dupla será preparado a partir de um pool de sete capas leucocitárias e posteriormente tratado com o sistema Intercept. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir um concentrado de plaquetas em dose dupla com inativação de patógenos. Primeiro, apresentamos uma visão esquemática geral, seguida por uma demonstração.

As primeiras sete unidades de sangue integral doado são centrifugadas e separadas para obter sete unidades de coágulo leucocitário que atendem aos volumes e metas de hematócrito. Os coágulos leucocitários são conectados, agrupados e centrifugados. A seguir, a suspensão de plaquetas é separada dos glóbulos vermelhos residuais para produzir um concentrado de plaquetas em dose dupla, com inativação de patógenos e leucócitos.

O concentrado de plaquetas em dose dupla é tratado utilizando o sistema de interceptação, que cria ligações cruzadas com os ácidos nucleicos. Em última análise, este procedimento produz duas doses terapêuticas de plaquetas com qualidade in vitro aceitável durante sete dias de armazenamento, conforme determinado pela avaliação de pH, glicose, lactato, PO dois e PC O2 e shallot doru. Um técnico do meu centro de sangue demonstrará o procedimento, cujos requisitos de processamento descreveremos.

Primeiro, certifique-se de que o concentrado de plaquetas em dose dupla atenda às especificações de processamento de interceptação de 300 a 420 mililitros. Volume de 2,5 a sete vezes 10 à 11ª a dose de plaquetas e menos de quatro vezes 10 à sexta por mililitro. Hemácias Inicie este procedimento com sete unidades de sangue total coletadas em conjuntos de coleta tipo topo-fundo de 450 mililitros.

Coloque as unidades de sangue nos copos do centrífuga e realize uma centrifugação rápida a 4.880 RCF durante 11 minutos à temperatura ambiente com o ajuste de frenagem B cinco, conforme instruções do fabricante. Após a centrifugação, o sangue será separado em três camadas: hemácias, camada de buffy coat e plasma. Transfira o plasma para o saco satélite superior e as hemácias para o saco satélite inferior, deixando o buffy coat com aproximadamente 48 mililitros e 37% de hematócrito no recipiente de coleta.

Coloque os buffy coats em um agitador de plaquetas à temperatura ambiente durante a noite. Conecte esterilmente sete buffy coats e 300 mililitros de solução aditiva para plaquetas SSP plus em uma configuração em série, com a solução aditiva na parte superior. Prenda a linha entre a solução aditiva e o primeiro buffy coat conforme mostrado aqui. Abra as soldas entre as unidades de buffy coat e permita que elas escoem para o recipiente do último buffy coat.

Em seguida, abra o clipe e a solda entre a solução aditiva e o primeiro coágulo leucocitário, e permita que aproximadamente um terço da solução aditiva, cerca de 100 mililitros, passe por cada um dos recipientes de coágulo leucocitário sequencialmente antes de fechar o clipe; repita a lavagem mais duas vezes, utilizando cada vez aproximadamente 100 mililitros da solução aditiva. Desconecte o recipiente com o coágulo leucocitário pool dos recipientes vazios. O volume do pool de coágulo leucocitário, incluindo a solução aditiva, deve ser de aproximadamente 600 mililitros.

Coloque os buffy coats poolados em um agitador por uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, conecte um recipiente de armazenamento de plaquetas com filtro integrado de redução de leucócitos ao saco contendo o pool de buffy coats. Coloque os buffy coats poolados e o recipiente de armazenamento de plaquetas em uma centrífuga e gire a 462 RCF por nove minutos e 20 segundos.

Após a centrifugação, expresse a suspensão de plaquetas através do filtro redutor Luca até o recipiente de armazenamento de plaquetas. O resultado é um concentrado de plaquetas em dose dupla contendo aproximadamente sete vezes 10 à 11ª plaquetas em 420 mililitros, que pode passar por inativação de patógenos com o sistema Intercept. O concentrado de plaquetas em dose dupla é tratado utilizando um conjunto de processamento Intercept, que consiste em um recipiente de amido e um recipiente de iluminação e dois recipientes de armazenamento.

Conecte o recipiente com a suspensão de plaquetas ao recipiente Amin no conjunto de processamento Intercept. Em seguida, pendure as plaquetas. Quebre a cânula inferior do recipiente Amin para permitir que a solução flua para o recipiente de iluminação.

Em seguida, quebre a cânula superior no recipiente de Amin para permitir que as plaquetas fluam através do recipiente de Amin até o recipiente de iluminação. Misture suavemente a mistura de plaquetas e am tosin. Aperte levemente o recipiente de iluminação para expelir o ar do interior do recipiente de iluminação.

Selar o tubo entre a iluminação e o recipiente de amato de modo que não mais de quatro centímetros do tubo se estendam para fora do recipiente de iluminação. Remover e descartar os recipientes vazios. Colocar o conjunto de processamento no iluminador com o recipiente de iluminação no compartimento grande do lado esquerdo e o organizador no compartimento menor do lado direito.

Escaneie o ID da doação. Código do produto e processamento. Defina o número do lote no iluminador.

Feche a tampa metálica e a gaveta. Pressione iniciar para começar a iluminação. O iluminador fornece uma dose controlada de luz UVA à mistura de aminas plaquetárias no recipiente de iluminação.

A amina se liga entre os pares de bases do ácido nucleico de patógenos, que podem estar presentes na unidade de plaquetas. Após a iluminação, ligações cruzadas permanentes são formadas, mantendo o DNA ou RNA unidos, de modo que os patógenos não possam mais se replicar nem causar doenças no receptor do produto sanguíneo. Após a iluminação, remova o conjunto de processamento.

Em seguida, desembrulhe os recipientes do organizador, pendure as plaquetas e o conjunto de processamento. Quebre a cânula na saída do recipiente de iluminação e permita que as plaquetas fluam para o recipiente CAD. Dentro do recipiente CAD há uma pastilha com microesferas macroporosas de poliestireno imobilizadas que reduzem os níveis residuais de amin no produto sanguíneo.

Tendo cuidado para não dobrar a pastilha de CAD. Expulse o ar do recipiente de CAD para o recipiente de iluminação. Feche o tubo próximo à porta de entrada do recipiente de CAD.

Remova e descarte o recipiente de iluminação vazio. Coloque o recipiente CAD com os recipientes de armazenamento acoplados em um agitador de plaquetas por seis a 16 horas. Isso resultará na redução da amlin residual a uma concentração menor ou igual a dois micromolares.

Após o tratamento com CAD, remova as unidades de plaquetas do agitador, pendure as plaquetas, quebre a cânula na saída do recipiente de CAD e permita que as plaquetas fluam para os dois recipientes de armazenamento. Em seguida, expulse o ar dos recipientes de armazenamento. Selle o tubo acima da bifurcação em Y e remova o recipiente de CAD.

O resultado é dois concentrados de plaquetas com patógenos inativados para avaliar a função plaquetária in vitro. A dose de plaquetas pH PO dois PC O2 produção de lactato e consumo de glicose do intercepto. Os concentrados de plaquetas foram determinados até o sétimo dia de armazenamento.

Esta figura mostra a dose média inicial de plaquetas do concentrado de plaquetas em dose dupla antes do tratamento com intercepto, e a dose média de plaquetas em cada produto fracionado tratado até o sétimo dia de armazenamento. Como pode ser observado aqui, a perda de plaquetas durante o armazenamento foi de aproximadamente 9%. Essa redução não difere da perda esperada de plaquetas durante o armazenamento de plaquetas convencionais. De acordo com os requisitos europeus, o pH das plaquetas deve permanecer acima de 6,4 até o final da vida útil.

Durante o processamento, o pH dos concentrados de plaquetas diminui ligeiramente conforme o volume da concentração de plaquetas e a permeabilidade ao gás do recipiente de armazenamento de plaquetas. Este gráfico mostra o pH dos produtos plaquetários fracionados ao longo de sete dias de armazenamento, período durante o qual o pH se mantém estável e bem preservado dentro dos requisitos de processamento. O metabolismo aeróbico deve continuar ocorrendo nas plaquetas armazenadas e é um indicador da capacidade das plaquetas de funcionar in vivo após a transfusão em um paciente.

O consumo de O₂ e a produção de CO₂ pelas plaquetas indicam a respiração contínua das plaquetas no recipiente PL 24 10 durante sete dias de armazenamento. Da mesma forma, o metabolismo anaeróbico deve continuar nas plaquetas armazenadas. Assim, o consumo de glicose e a produção de lactato também são indicadores da capacidade das plaquetas de funcionar após a transfusão.

Essas duas figuras mostram os níveis de lactato e glicose durante sete dias de armazenamento. O consumo de glicose pelas plaquetas e a produção de lactato são consistentes entre si. Durante os sete dias de armazenamento, cinco unidades apresentaram níveis de glicose inferiores a 1,11 milimol por litro, que é o limite inferior para o ensaio de glicose.

A preparação do código Buffy e a validação do pooling produziram concentrados de plaquetas que atendem aos critérios de entrada para o tratamento com intercept, especificamente volume, contagem de plaquetas, proporção de plasma e contaminação por hemácias. As unidades finais atendem aos critérios de validação durante sete dias de armazenamento, incluindo dose de plaquetas e pH. A principal vantagem desta técnica em relação ao método convencional de preparação do código Buffy, que produz um concentrado de plaquetas de dose única, é que ela maximiza o rendimento dos componentes a partir das coletas de sangue, reduz os custos operacionais mediante o uso de uma técnica de dose dupla e melhora a segurança do paciente ao inativar patógenos transmitidos por transfusão.