Name: Preparação e inativação de patógenos de dose dupla de Buffy produtos de plaquetas revestimento utilizando o Sistema de Sangue INTERCEPT (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: Aprenda a preparar concentrados plaquetários de dose dupla a partir de buffy coats com inativação de patógenos pelo Sistema INTERCEPT. Este método garante qualidade in vitro por sete dias de armazenamento.

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O financiamento para a publicação é fornecida por Cerus Corp, fabricante do Sistema de Sangue INTERCEPT.

1. Sangue Total <ol><li> Coletar sangue total de doadores voluntários em 450 ml coleção topo / fundo define de acordo com a diretrizes de coleta de sangue locais. </li><li> O sangue total é armazenado durante um período mínimo de 2 horas em uma placa de arrefecimento antes da centrifugação e separação. </li></ol> 2. Buffy Preparação Brasão <ol><li> Centrifuga-se o sangue total utilizando uma rotação difícil separar o sangue em três camadas: as células vermelhas do sangue, buffy coat e plasma. Parâmetros de centrífuga foram utilizados 4880 RCF durante 11 minutos à temperatura de 22 ± 2 ° C. </li><li> Utilizar um separador de sangue automatizado para expressar o plasma para dentro do saco de satélite superior e as células vermelhas do sangue (RBC) na bolsa de satélite inferior, deixando a cobertura amarelada no recipiente de recolha. Alvo significam as faixas de volume e hematócrito para casacos buffy são aproximadamente 48 ml e 37%, respectivamente. </li><li> Os buffy-revestimentos são armazenadas durante a noite num agitador de plaquetas a 22 ± 2 ° C. </li></ol><ol><li> Estéril de conexão 7 flogística e 300 ml de solução de aditivo SSP + plaquetas (PAS), em uma configuração comboio com linhas paralelas para reduzir o comprimento do comboio, o PAS deve estar no topo do trem. Prenda a linha entre o PAS eo revestimento buffy primeiro. </li><li> Abrir as ligações entre as unidades estéreis buffy coat e permitir que o revestimento buffy escorrer para o recipiente anterior. </li><li> Abrir a solda e o grampo entre a PAS e a crosta inflamatória primeiro. Permitir que um terço da solução de aditivo de lavar por meio de cada um dos recipientes de camada leuco-plaquetária sequencialmente. Repita duas vezes mais de cada vez utilizando metade da PAS restante. </li><li> A média buffy coat volume da piscina deve ser aproximadamente 600 ml. Se o volume do alvo e do hematócrito dos revestimentos individuais buffy forem satisfeitas, o rácio de plasma será de 32 - 47%, conforme necessário para o tratamento de inactivação INTERCEPT patógeno mais tarde no processo. </li><li> Descarte o vazio SSP + e buffyrecipientes casaco. </li><li> Para a recuperação de plaquetas ideal, mantenha a piscina do agitador durante 1 hora antes da centrifugação. </li><li> Estéril ligar um recipiente de armazenagem de plaquetas com filtro leucorredução integrada para a piscina buffy coat. </li><li> Executar um &quot;spin suave&quot; do conjunto de buffy coat para separar as células vermelhas do sangue a partir das plaquetas na suspensão (462 RCF durante 9 min, 20 seg.) Expressar a suspensão de plaquetas usando um separador de sangue automatizado através do filtro leucorredução no recipiente de armazenagem de plaquetas. </li><li> Os requisitos de processamento descritas anteriormente assegurar que a suspensão de plaquetas satisfaz as especificações de processamento INTERCEPT de 300 ml - 420 ml de volume, 2,5-7,0 x 10 11 dose de plaquetas, e ≤ a 4 x 10 6 / ml de glóbulos vermelhos. </li></ol> 4. INTERCEPTAR Tratamento <ol><li> Realizar o tratamento INTERCEPT antes do final do 1 º dia após a coleta (dia 0 é o dia da coleta). </li><li> Desembrulhe o Conjunto de Processamento INTERCEPTcom recipientes de armazenamento dupla da bolsa de plástico transparente. </li><li> Conectar o recipiente estéril suspensão de plaquetas aos tubos do recipiente amotosalen sobre o conjunto de processamento INTERCEPT. </li><li> Rotular a interceptação de processamento de recipientes de armazenamento conjunto com a identificação adequada de sangue produto seguindo as exigências locais. </li><li> Pendurar as plaquetas e quebrar primeiro a cânula inferior no recipiente amotosalen, permitindo que a solução amotosalen flua para o recipiente de iluminação. Quebrar a cânula de topo no recipiente amotosalen permitindo que as plaquetas a fluir através do recipiente para o recipiente amotosalen iluminação. </li><li> Misturar cuidadosamente a mistura de plaquetas e amotosalen e expressar o ar a partir do recipiente para o recipiente de iluminação amotosalen. </li><li> Expressam uma pequena quantidade da mistura de plaquetas à tubagem, enchendo cerca de 4 cm da tubagem. Isto assegura plaquetas em ambos os tubos e submeter-se ao recipiente de iluminação inactivati ​​patógenoem tratamento. </li><li> Selar o tubo entre o recipiente de iluminação e do recipiente amotosalen. Deixar não mais do que cerca de 4 cm de tubo que se prolongam a partir do recipiente de iluminação. Retire e descarte a plaquetas e recipientes vazios amotosalen e fechar os grampos nas bolsas de amostragem. </li><li> Colocar o conjunto de processamento para o iluminador com o recipiente de iluminação no compartimento grande no lado esquerdo e do organizador no compartimento mais pequeno, no lado direito. </li><li> Use o dispositivo de código de barras de mão para inserir a ID doação, código do produto, número de lote e processamento conjunto para o iluminador. Feche a tampa de metal e, quando solicitado na interface gráfica iluminador, fechar a gaveta. Pressione o botão &quot;Iniciar&quot; para iniciar a Iluminação. </li><li> Depois de iluminação, retirar o conjunto de processamento a partir do iluminador. O iluminador imprime automaticamente o relatório para a unidade de tratamento tratados com plaquetas (s). </li><li> Desembrulhar os recipientes do organizador e pendurar a platelets e conjunto de processamento, quebrar a cânula na saída do recipiente de iluminação, e permitir que as plaquetas a fluir para dentro do dispositivo composto de adsorção (CAD) do recipiente. </li><li> Tomando cuidado para não dobrar o wafer CAD, expressar o ar a partir do recipiente para o recipiente CAD iluminação utilizando um extractor de plasma. </li><li> Selar o tubo, próximo da abertura de entrada do recipiente de CAD. Retire e descarte o recipiente vazio iluminação. </li><li> Colocar o recipiente de CAD com os recipientes de armazenamento conectados em um agitador de plaquetas, pelo menos, 6 horas, mas não mais de 16 horas. Isto irá resultar na redução da amotosalen residual a uma concentração de ≤ 2 uM. </li><li> Após o tratamento da DAC, remover as unidades de plaquetas a partir do agitador. Pendure as plaquetas. Quebrar a cânula e permitir que as plaquetas a fluir para os recipientes de armazenamento. </li><li> Exprime-se o ar a partir dos recipientes de armazenamento para o recipiente de CAD. Deixe que a parte de trás do fluxo residual concentrado de plaquetas nos recipientes de armazenamento,gravidade. Selar o tubo acima da Y-encaixe e remova o recipiente vazio CAD. </li><li> Volume de redistribuir entre os recipientes de armazenamento, conforme necessário. Os ajustes de volume são feitas através da pesagem dos recipientes de armazenamento. Selar o tubo em cada recipiente de armazenamento de alguns centímetros acima da entrada do recipiente de armazenamento, o que facilita a obtenção de uma amostra estéril do produto final, tal como descrito em 5.2. </li></ol> 5. Amostragem produto <ol><li> Para os testes de rotina QC, os recipientes de armazenamento final pode ser amostrada uma vez, utilizando o saco de amostragem nos recipientes de armazenamento. Para fazer isso, assegurar que a unidade de plaquetas é bem misturada e, em seguida abrir o grampo para a bolsa e apertar várias vezes. Selar o tubo após a bolsa ter enchido com as plaquetas. Transfira a amostra das plaquetas para um tubo de laboratório adequado e realizar ensaios de imediato. </li><li> Para obter amostras em múltiplos pontos temporais ao longo de armazenamento, tal como um estudo de validação, conectar estérilum recipiente de amostragem de novo para o tubo do recipiente de armazenagem de plaquetas. Certifique-se de que as plaquetas são bem misturados antes de serem transferidos para o recipiente de recolha. </li></ol> 6. Avaliação in vitro da função <ol><li> Para este estudo de validação, a avaliação in vitro foi realizada após CAD tratamento (Dia 1 ou Dia 2, dependendo da duração CAD) e novamente no Dia 4 (ou 5 º dia) e no dia 7. Em medições in vitro incluiu volume, a contagem de plaquetas, pH, gás de sangue (PO 2, PCO 2), glicose, lactato, e rodando. </li><li> O volume foi determinado pelo peso, utilizando 1,01 g / ml, tal como a gravidade específica de plaquetas na solução de aditivo. </li><li> Contaminação da hemoglobina foi avaliado visualmente por comparação com uma escala de cores. </li><li> Roda foi determinada visualmente. </li><li> Consulte &quot;Tabela de equipamentos&quot; para a metodologia de outros ensaios. </li></ol> 7. Resultados representativos O processo de produção de double dose de buffy coat plaquetas inicia-se com a produção de revestimentos individuais buffy que satisfazem as especificações de destino para o volume e o hematócrito. Como não é prático para medir o hematócrito do indivíduo flogística durante o processo de validação final, começou a realizar um esforço separado para otimizar a nossa buffy casacos para garantir que poderiam atender de forma consistente volume alvo e hematócrito. Como mostrado na Tabela 1, os casacos optimizado buffy comparados favoravelmente com os valores alvo para o volume e hematócrito a 46 ± 2 mL e 37 ± 3%, respectivamente. Depois de partilha, o volume do hematócrito e da piscina buffy coat deve ser de aproximadamente 600 ml e 20%, respectivamente, antes da centrifugação, rotação suave. Como ilustrado na Tabela 2, os conjuntos de buffy coat em média 615 ± 5 ml, o hematócrito em média de 19 ± 1%. Os resultados de spin suaves centrifugação em um conc dose dupla de plaquetasEntrate que preencham os requisitos de entrada para a inativação de patógenos que utilizam o Sistema de Sangue INTERCEPT DS conjunto de processamento. Parâmetros de entrada chave para o tratamento INTERCEPT incluem contagem, volume de plaquetas, plasma relação e conteúdo RBC. Além disso, pretende-se recuperar ≥ 75% das plaquetas no concentrado de plaquetas, em comparação com o pool de buffy coat. Por exigências locais, a contaminação de glóbulos brancos (WBC) deve ser &lt;1x10 6 / unidade. O concentrado de plaquetas na nossa validação preencheram os parâmetros chave para o tratamento INTERCEPT, bem como os alvos de WBC contaminação e recuperação das plaquetas, como mostrado na Tabela 3. O processo de inactivação de agentes patogénicos INTERCEPT é executada no concentrado de dose dupla de plaquetas utilizando um conjunto único de processamento INTERCEPT. O conjunto de processamento contém dois recipientes de armazenamento integrado que permitem que a unidade tratada para ser dividida em duas doses individuais terapêuticas de plaquetas após a conclusão do caminhoOgen processo de inativação. Orientações europeias exigem que 75% das unidades testadas contêm ≥ 200x10 9 plaquetas por terapêutica dose1; requisitos locais na Suécia exigem que 75% das unidades testadas contêm&gt; 240x10 9 plaquetas por dose. Após o tratamento INTERCEPT, o teor médio de plaquetas foi de 265 ± 22 x10 9 (n = 24). Além disso, 88% das unidades alcançado ou ultrapassado 240x10 9 plaquetas por dose terapêutica, o que está bem dentro de ambas as diretrizes e regulamentos europeus suecos. Veja as Figuras 1 e 2 para uma ilustração da dupla preparação casaco dose de Buffy e processos INTERCEPT tratamento, respectivamente. Para esta validação, medimos o em características in vitro do concentrado de plaquetas após o tratamento INTERCEPT (isto é, após a separação entre os recipientes de armazenamento individuais); parâmetros foram medidos ao longo de 7 dias de armazenamento. A média eo desvio-padrão foram coletadas paradosagem de plaquetas, pH, PO 2, PCO 2, a produção de lactato e consumo de glicose. A Figura 3 mostra a média de uma dose inicial de plaquetas do concentrado de plaquetas dose dupla antes do tratamento INTERCEPT e a dose média de plaquetas em cada um dos produtos da divisão após tratamento INTERCEPT ao longo de 7 dias de armazenamento. Perda de plaquetas durante a armazenagem foi de aproximadamente 9%. Essa redução não é diferente da esperada perda de plaquetas durante a armazenagem de plaquetas convencionais. 2 A Tabela 4 resume as características in vitro em plaquetas dos INTERCEPT após o tratamento e dividindo-se em unidades individuais. Por requisitos europeus, o pH de plaquetas deve ser superior a 6,4 através do fim da vida útil de prateleira. Durante o processamento, o pH do concentrado de plaquetas cai um pouco dependendo da concentração de plaquetas, volume, e a permeabilidade ao gás do sto plaquetáriarecipiente raiva. Figura 4 ilustra o pH dos produtos da divisão de plaquetas ao longo de 7 dias de armazenamento. Durante o armazenamento, o pH é mantido estável e bem dentro das exigências de processamento. Como mostrado nas Figuras 5A e 5B, o consumo de O2 de plaquetas e produção de CO 2 indicam a respiração continuada pelas plaquetas intercepto no recipiente PL2410 durante 7 dias de armazenamento. Figuras 6A e 6B mostram os níveis de lactato e de glucose, ao longo de 7 dias de armazenamento . O consumo de glucose e produção de lactato de plaquetas são consistentes com o outro, durante os 7 dias de armazenamento. 5 unidades tinham níveis de glicose inferior a 1,11 mmol / l (o limite inferior para o doseamento de glucose). A preparação buffy coat e plaquetas validação agrupamento produzido concentrados que preencheram os critérios de entrada para tratamento INTERCEPT, especificamente, volume, contagem de plaquetas, plasma relação, e vermelho blood contaminação celular. As unidades finais preencheram os critérios de validação ao longo de 7 dias de armazenamento, incluindo a dose de plaquetas e pH. <table border="1"><tbody><tr><td> Parâmetro </td><td> Target Range </td><td> Resultados A média ± DP </td></tr><tr><td> Volume (ml) </td><td> ~ 48 </td><td> 46 ± 2 </td></tr><tr><td> Hematócrito (%) </td><td> ~ 37 </td><td> 37 ± 3 </td></tr><tr><td> Tempo de espera antes de partilha </td><td> Pernoite em agitador </td><td> Pernoite em agitador </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Características do indivíduo Buffy Coats (n = 19). <table border="1"><tbody><tr><td> Parâmetro </td><td> Target Range </td><td> Resultados A média ± DP </td></tr><tr><td> Volume (ml) </td><td> ~ 600 </td><td> 615 ± 5 </td></tr><tr><td> Hematocrit (%) </td><td> ~ 20 </td><td> 19 ± 1 </td></tr><tr><td> Tempo de espera antes da centrifugação </td><td> 1 hora em agitador </td><td> 1 hora em agitador </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Características das Piscinas Buffy Coat (n = 12). <table border="1"><tbody><tr><td> Parâmetro </td><td> Alvo </td><td> Resultados A média ± DP </td></tr><tr><td> Volume (ml) </td><td> 370-420 </td><td> 404 ± 8 </td></tr><tr><td> A contagem de plaquetas (x10 9 / unidade) </td><td> 250-700 </td><td> 577 ± 62 </td></tr><tr><td> A média de recuperação de plaquetas (%) </td><td> ≥ 75 </td><td> 75 ± 4 </td></tr><tr><td> Plasma proporção (%) </td><td> 32-47 </td><td> 38 ± 1 </td></tr><tr><td> RBC (x10 6 / ml) </td><td> ≤ 4 </td><td> 1,2 ± 0,4 </td></tr><tr><td> WBC (x10 6 </saté&gt; Unidade /) </td><td> ≤ 1 </td><td> 0,11 ± 0,1 </td></tr><tr><td> Tempo de espera antes da Interceptação (hr) </td><td> ≤ final do dia 1 </td><td> ≤ final do dia 1 </td></tr></tbody></table> Tabela 3. Características da Plaquetas Double-Dose Concentrados (n = 12). <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Média ± DP </td><td> Min </td><td> Max </td></tr><tr><td> Volume (ml) </td><td> 199 ± 16 </td><td> 182 </td><td> 236 </td></tr><tr><td> A contagem de plaquetas (x10 9 / unidade) </td><td> 265 ± 22 </td><td> 225 </td><td> 292 </td></tr><tr><td> pH (22 ° C) </td><td> 6,9 ± 0,1 </td><td> 6,8 </td><td> 7 </td></tr><tr><td> pO 2 (kPa) </td><td> 21,4 ± 4,8 </td><td> 12,8 </td><td> 27,3 </td></tr><tr><td> pCO 2 (kPa) </td><td> 4,3 e plusmn, 0,4 </td><td> 3,3 </td><td> 4,9 </td></tr><tr><td> De lactato (mmol / l) </td><td> 9,1 ± 1,7 </td><td> 6,8 </td><td> 12,4 </td></tr><tr><td> Glucose (mmol / l) </td><td> 5,3 ± 0,9 </td><td> 3,7 </td><td> 6,5 </td></tr></tbody></table> Tabela 4. Características do INTERCEPT Dia plaquetas tratadas 1/2 (em unidades individuais, n = 24). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4414/4414fig1.jpg" /> Figura 1. Produção de um concentrado duas vezes a dose de plaquetas a partir de um pool de 7 flogística. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4414/4414fig2.jpg" /> Figura 2. Inativação de patógenos de um concentrado de plaquetas dose dupla com o Sistema de Sangue INTERCEPT. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4414/4414fig3.jpg" /> Figura 3. A dose média de plaquetas antes e durante7 dias após o tratamento INTERCEPT (n = 12 antes INTERCEPT, n = 24 depois INTERCEPT). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4414/4414fig4.jpg" /> Figura 4. A média ± DP de pH de plaquetas após INTERCEPT tratamento (n = 24). <img alt="Figura 5A" src="/files/ftp_upload/4414/4414fig5a.jpg" /> Figura 5A. Média ± SD pO 2 INTERCEPT após tratamento (n = 24). <img alt="A Figura 5B" src="/files/ftp_upload/4414/4414fig5b.jpg" /> Figura 5B. Média ± SD pO 2 INTERCEPT após tratamento (n = 24). <img alt="Figura 6A" src="/files/ftp_upload/4414/4414fig6a.jpg" /> Figura 6a. Níveis médios de lactato ± DP depois da interceptação de tratamento (n = 24). <img alt="Figura 6B" src="/files/ftp_upload/4414/4414fig6b.jpg" /> Figura 6B. Os níveis médios de glicose &amp;plusmn; SD após o tratamento INTERCEPT (n = 24).

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</ol>

Produção e livre acesso a este artigo é patrocinado pela Cerus.

Plaquetas Buffy Coat exigem várias etapas de processamento que resultam em pós de coleta de custos, incluindo o pessoal de tempo, materiais de consumo, equipamentos e resíduos, que deve ser tido em conta o custo total de produção das unidades de plaquetas. Melhorar a produção de plaquetas a partir de cada buffy coat (via optimização do volume de buffy coat e hematócrito) permite a produção de uma unidade de revestimento duplo de dose buffy plaquetas a partir de um conjunto de sete camadas leuco-plaquetária. Quando esta optimização é realizada, o número de flogística requerida para produzir um determinado número de doses de plaquetas pode ser reduzida, desse modo melhorando a utilização geral de buffy casacos e permitindo a produção de plaquetas adicionais concentrados (PCs). Pessoal tempo, bem como os custos de consumíveis e equipamentos, tais como aparelhos de agrupamento, a solução de aditivo de plaquetas, plaquetas de conexão estéreis, conjuntos de filtros, e os procedimentos de centrifugação são reduzidos em até 50%. Além de otimizar a produção de plaquetas e reduzindo os custos associados, thio método pode gerar uma pool de concentrado de plaquetas (PC), que satisfaz os requisitos de entrada para utilização com o conjunto de armazenamento de duplo processamento INTERCEPT recipiente, permitindo-nos fornecer uma maior protecção aos receptores de transfusão nossos também. O Sistema de Sangue INTERCEPT para inactivação patógeno utiliza amotosalen e luz ultravioleta A (UVA), a ligação cruzada de ADN covalentemente e RNA, prevenindo a replicação do ácido nucleico e de agentes patogénicos de processamento incapazes de causar doença. 3 É inactivar eficazmente um amplo espectro de agentes patogénicos, incluindo os vírus, bactérias , parasitas e contaminantes doadores células brancas do sangue. 4-6 INTERCEPT fornece uma alternativa ao paradigma atual de testes para patógenos emergentes, que historicamente envolve um atraso substancial, enquanto um novo teste é desenvolvido e, finalmente, requer um investimento financeiro significativo para implementar quando um teste torna-se disponível. 7,8 Ele também pode fornecer uma alternativa para a segurança redundante medires, como a detecção de bactérias 9 e radiação gama. 10-12 Além disso, INTERCEPT nos permite tratar unidades de plaquetas duplas dose que beneficia a nossa eficiência de produção e nos ajuda a aderir a nossos orçamentos. INTERCEPT ea dose dupla método buffy coat pode ser adaptado a uma variedade de fluxos de trabalho do centro de sangue. Como exemplos, os conjuntos de sangue total pode ser aumentado para 500 ml; coleções também pode ser armazenado durante a noite a 22 ° C antes da separação. Além disso, um método alternativo buffy coat agrupamento é possível (por exemplo, um método polvo, em vez de um método de comboio) e / ou um dispositivo automático (por exemplo, tacsi) pode ser utilizada para a segunda centrifugação e separação da suspensão de plaquetas a partir de células vermelhas restantes . Se o conteúdo de plaquetas aumentada se necessário, várias técnicas disponíveis incluindo a pré-selecção de dadores com base na contagem de plaquetas, a incubação durante a noite do sangue total, adjustamento de configurações de centrifugação, ou a utilização de uma piscina de 8 de buffy coats em vez de 7. Devido à limitação de pooling define actualmente disponíveis e a capacidade dos recipientes de centrífuga, o volume total do conjunto de buffy coat deve ser aproximadamente 600 ml. O processo de centrifugação e configurações descritas neste protocolo foram otimizadas para obter o produto que atenda aos parâmetros de interceptação para uma piscina de 7 casacos de Buffy. As configurações de centrifugação deve ser modificada, se o número de flogística na piscina é modificado. Em alguns países, a dose mínima de plaquetas é maior e os requisitos de CQ são mais rigorosos do que na Suécia. Como tal, os nossos resultados podem não ser universalmente aplicável. Nesses países, o PC dose dupla antes do tratamento INTERCEPT terá de conter um número maior de plaquetas, a fim de atender às exigências locais após o tratamento interceptar e divisão. Uma vez que o teor máximo de plaquetas e volume de tratamento de for INTERCEPT são 7x10 11 plaquetas e 420 ml, respectivamente, o percentual de unidades que excedem os requisitos de processamento interceptar ou ter conteúdo de plaquetas suficiente para ser dividida em duas doses terapêuticas, variam de acordo com fatores como os requisitos locais para a dose de plaquetas, os critérios de CQ, buffy coat resultados de otimização e estabilidade de produção. Se um PC dose dupla excede os requisitos de processamento INTERCEPT, pode ser ajustado manualmente para satisfazer os requisitos e subsequentemente tratada. Em poucas ocasiões onde a piscina casaco 7-buffy rende plaquetas insuficientes para um produto dose dupla depois da interceptação, que optar por não realizar o tratamento interceptar. Alternativamente, outros centros de sangue pode optar por tratar o PC com um único conjunto de processamento de doses INTERCEPT (ou seja, o conjunto de grande volume) e armazenar o PC como uma maior dose única terapêutica, assim, a realização inativação de patógenos em todas as unidades. A fim de garantir o cumprimento nossoCQ e requisitos para inativar patógenos como muitos de nossas unidades de plaquetas quanto possível, nós selecionamos casacos buffy com base nas contagens de plaquetas do doador, que, quando reunidos, resultarão em um conteúdo mínimo de plaquetas de 5.6x10 11 plaquetas na piscina. Isso garante conteúdo de plaquetas suficiente para produzir duas doses terapêuticas após o tratamento interceptar. Nosso validação demonstra que 7 unidades de sangue total do revestimento buffy derivados podem com sucesso ser reunidas e tratadas com o processo de INTERCEPT para plaquetas, que resulta em dois produtos de plaquetas inactivados patógenos que satisfazem os critérios de aceitação para a fabricação de (requisitos suecas e orientações europeias), para o apoio dos pacientes necessidade de transfusão de plaquetas de acordo com a diretrizes de prática clínica e padrão de métodos de infusão de plaquetas na Suécia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Doação de sangue total, separação primária e produção de plaquetas</td></tr><tr><td>Pacote para coleta de sangue</td><td>Fenwal</td><td>R6485</td><td>Conjunto superior/inferior</td></tr><tr><td>Extrator automático de componentes</td><td>Fenwal</td><td>Optipress-II</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de sangue e sistema de balança</td><td>Baxter</td><td>Easymix V3</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto de filtração de plaquetas e leucócitos</td><td>Fenwal</td><td>K4R7042</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugar</td><td>Hettich</td><td>Roto Silenta 63 RS</td><td>Versão 5.5</td></tr><tr><td>Solução aditiva para plaquetas - SSP+</td><td>MacoPharma</td><td>SSP2030U</td><td>300 ml</td></tr><tr><td>Soldador estéril de tubos</td><td>Terumo</td><td>T-SCD</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tratamento INTERCEPT &amp;amp; armazenamento</td></tr><tr><td>conjunto de processamento INTERCEPT</td><td><a href="http://www.interceptbloodsystem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Cerus</a></td><td>INT2503</td><td>Conjunto de Armazenamento Duplo (DS)</td></tr><tr><td>INTERCEPT Illuminator</td><td><a href="http://www.interceptbloodsystem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Cerus</a></td><td>INT100</td><td></td></tr><tr><td>Pacote de amostra de PC</td><td>Fenwal</td><td>FTX 1122</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Helmer</td><td>PC2200/PC3200</td><td></td></tr><tr><td>Agitador</td><td>Helmer</td><td>PF48H/PF96H</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Avaliação de &lt;em&gt;in vitro&lt;/em&gt; Função Plaquetária</td></tr><tr><td>Analisador de gases sanguíneos</td><td>Radiômetro</td><td>ABL 735</td><td>Utilizado para medição de pH, gases sanguíneos e lactato</td></tr><tr><td>Sistema de química</td><td>Ortho Clinical Diagnostics</td><td>Vitros 5.1</td><td>Utilizado para a medição de glicose</td></tr><tr><td>Analisador hematológico</td><td>Boule Medical AB</td><td>Medonic CA620-Cellguard</td><td>Utilizado para a medição da contagem de plaquetas</td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD</td><td>FACSCanto</td><td>Utilizado para a medição de glóbulos brancos</td></tr></tbody></table>

preparação e inativação de patógenos de dose dupla de buffy produtos de plaquetas revestimento utilizando o sistema de sangue intercept

Preparation and Pathogen Inactivation of Double Dose Buffy Coat Platelet Products using the INTERCEPT Blood System

Centros de sangue são confrontados com muitos desafios, incluindo rendimento de produção maximização das doações de sangue de produtos que recebem, bem como assegurar o mais elevado nível de segurança para os pacientes de transfusão, incluindo a proteção de doenças transmissíveis de transfusão. Isso deve ser feito de uma forma fiscalmente responsável, que minimiza as despesas operacionais, incluindo consumíveis, equipamentos, resíduos e custos de pessoal, entre outros. Vários métodos estão disponíveis para a produção de concentrados de plaquetas à transfusão. Uma das mais comuns é o método buffy coat em que uma unidade única terapêutica de plaquetas (≥ 2,0 x10 11 plaquetas por unidade ou por regulamentação local) é preparada através da conjugação da camada buffy coat de até seis doações de sangue total. Um procedimento para a produção de &quot;duplo&quot; de dose de plaquetas derivadas de sangue total foi recentemente desenvolvido. Aqui apresentado é um novo método para a preparaçãodose dupla de plaquetas derivadas de sangue total concentrados de piscinas de 7 casacos Buffy e posteriormente tratar as unidades de dose dupla com o Sistema de Sangue INTERCEPT para inativação de patógenos. INTERCEPÇÃO foi desenvolvido para inactivar os vírus, bactérias, parasitas, e as células brancas de doadores contaminantes que podem estar presentes no sangue doado. Emparelhamento interceptar com o dobro da dose buffy coat método, utilizando o processamento de intercepção definido com recipientes de armazenamento Duplas (o &quot;set DS&quot;), permite aos centros de sangue para tratar cada uma de suas unidades de dose dupla em um conjunto de processamento patógeno inativação único, maximizando assim a segurança do paciente minimizando os custos. A dose dupla método buffy coat, requer menos camadas Buffy e reduz o uso de materiais de consumo em até 50% (por exemplo, conjuntos de pooling, conjuntos de filtros, a solução de aditivo de plaquetas, e wafers de conexão estéreis) em relação ao preparo e tratamento de dose única unidades buffy coat de plaquetas . Outras economias de custos incluem menos resíduos, menos equipamentos manutence, baixo consumo de energia, redução do tempo de pessoal, e menor custo de cobrança, em comparação com a técnica de aférese.

Este artigo descreve o processo utilizado por Örebro University Hospital para produzir dose dupla de plaquetas buffy coat concentra preparados a partir de doações de sangue total e tratados com o Sistema de Sangue INTERCEPT para inativação de patógenos. O<em&gt; In vitro</em&gt; Qualidade das unidades de plaquetas finais são avaliados ao longo de 7 dias de armazenamento.

Preparação e inativação de patógenos de dose dupla de Buffy produtos de plaquetas revestimento utilizando o Sistema de Sangue INTERCEPT

Os centros de hemoterapia enfrentam diversos desafios, incluindo a maximização do rendimento de produção a partir das doações de produtos sanguíneos que recebem, bem como a garantia da ...

Neste vídeo, um concentrado de plaquetas em dose dupla será preparado a partir de uma piscina de sete capas leucocitárias e posteriormente tratado com o sistema Intercept. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir um concentrado de plaquetas em dose dupla com inativação de patógenos. Primeiramente, apresentamos uma visão esquemática geral, seguida por uma demonstração.As primeiras sete unidades de sangue integral doado são centrifugadas e separadas para obter sete unidades de coágulo leucocitário que atendem aos volumes e valores de hematócrito desejados. Os coágulos leucocitários são conectados, agrupados e centrifugados. A seguir, a suspensão de plaquetas é separada dos glóbulos vermelhos residuais para produzir um concentrado de plaquetas em dose dupla, com inativação de patógenos e leucócitos.O concentrado de plaquetas em dose dupla é tratado utilizando o sistema de interceptação, que cria ligações cruzadas com os ácidos nucleicos. Em última análise, este procedimento produz duas doses terapêuticas de plaquetas com qualidade in vitro aceitável durante sete dias de armazenamento, conforme determinado pela avaliação de pH, glicose, lactato, PO₂ e PCO₂, e Shallot Doru. Um técnico do meu centro de sangue demonstrará o procedimento, cujos requisitos de processamento descreveremos.Primeiro, certifique-se de que o concentrado de plaquetas em dose dupla atenda às especificações de processamento de interceptação de 300 a 420 mililitros. Volume de 2,5 a sete vezes 10 à 11ª a dose de plaquetas e menos de quatro vezes 10 à sexta por mililitro. Hemácias Inicie este procedimento com sete unidades de sangue total coletadas em conjuntos de coleta tipo topo-fundo de 450 mililitros.Coloque as unidades de sangue nos copos do centrífuga e realize uma centrifugação rápida a 4.880 RCF durante 11 minutos à temperatura ambiente com o ajuste de frenagem B cinco, conforme instruções do fabricante. Após a centrifugação, o sangue será separado em três camadas: hemácias, camada leucocitária (buffy coat) e plasma. Transfira o plasma para o saco satélite superior e as hemácias para o saco satélite inferior, deixando o buffy coat com aproximadamente 48 mililitros e 37% de hematócrito no recipiente de coleta.Coloque os buffy coats em um agitador de plaquetas à temperatura ambiente durante a noite. Conecte esterilmente sete buffy coats e 300 mililitros da solução aditiva para plaquetas SSP plus em uma configuração em série, com a solução aditiva na parte superior. Prenda a linha entre a solução aditiva e o primeiro buffy coat conforme mostrado aqui. Abra as soldas entre as unidades de buffy coat e permita que elas escoem para o recipiente do último buffy coat.Em seguida, abra o clipe e a solda entre a solução aditiva e o primeiro coágulo leucocitário (buffy coat) e permita que aproximadamente um terço da solução aditiva, cerca de 100 mililitros, passe por cada um dos recipientes de coágulo leucocitário sequencialmente antes de fechar o clipe. Repita a lavagem mais duas vezes, utilizando cada vez aproximadamente 100 mililitros da solução aditiva. Desconecte o recipiente com o coágulo leucocitário pool dos recipientes vazios. O volume do pool de coágulo leucocitário, incluindo a solução aditiva, deve ser de aproximadamente 600 mililitros.Coloque os concentrados de buffy coat em um agitador durante uma hora, à temperatura ambiente. Em seguida, conecte um recipiente de armazenamento de plaquetas com filtro integrado de redução de leucócitos ao saco contendo o pool de buffy coat. Posicione o pool de buffy coat e o recipiente de armazenamento de plaquetas em uma centrífuga e gire a 462 RCF por nove minutos e 20 segundos.Após a centrifugação, expresse a suspensão de plaquetas através do filtro redutor Luca até o recipiente de armazenamento de plaquetas. O resultado é um concentrado de plaquetas em dose dupla contendo aproximadamente sete vezes 10 à 11ª plaquetas em 420 mililitros, que pode passar por inativação de patógenos com o sistema Intercept. O concentrado de plaquetas em dose dupla é tratado utilizando um conjunto de processamento Intercept, que consiste em um recipiente de amilo, um recipiente de iluminação e dois recipientes de armazenamento.Conecte o recipiente com a suspensão de plaquetas ao recipiente Amin no conjunto de processamento Intercept. Em seguida, pendure as plaquetas. Quebre a cânula inferior do recipiente Amin para permitir que a solução flua para o recipiente de iluminação.Em seguida, quebre a cânula superior no recipiente de Amin para permitir que as plaquetas fluam através do recipiente de Amin até o recipiente de iluminação. Misture suavemente a mistura de plaquetas e am tosin. Aperte levemente o recipiente de iluminação para expelir o ar do interior do recipiente de iluminação.Selar o tubo entre a iluminação e o recipiente de amato de modo que não mais de quatro centímetros do tubo se estendam para fora do recipiente de iluminação. Remover e descartar os recipientes vazios. Colocar o conjunto de processamento no iluminador com o recipiente de iluminação no compartimento grande do lado esquerdo e o organizador no compartimento menor do lado direito.Digitalize o ID da doação. Código do produto e processamento. Defina o número do lote no iluminador.Feche a tampa metálica e a gaveta. Pressione iniciar para começar a iluminação. O iluminador fornece uma dose controlada de luz UVA à mistura de aminas plaquetárias no recipiente de iluminação.A amina se liga entre os pares de bases do ácido nucleico de patógenos, que podem estar presentes na unidade de plaquetas. Após a iluminação, ligações cruzadas permanentes são formadas, mantendo o DNA ou RNA unidos, de modo que os patógenos não podem mais se replicar nem causar doenças no receptor do produto sanguíneo. Após a iluminação, remova o conjunto de processamento.Em seguida, desembrulhe os recipientes do organizador, pendure as plaquetas e o conjunto de processamento. Quebre a cânula na saída do recipiente de iluminação e permita que as plaquetas fluam para o recipiente CAD. Dentro do recipiente CAD há uma pastilha com microesferas macroporosas de poliestireno imobilizadas que reduzem os níveis residuais de amina no produto sanguíneo.Tendo cuidado para não dobrar a pastilha de CAD. Expulse o ar do recipiente de CAD para o recipiente de iluminação. Feche o tubo próximo à porta de entrada do recipiente de CAD.Remova e descarte o recipiente de iluminação vazio. Coloque o recipiente CAD com os recipientes de armazenamento acoplados em um agitador de plaquetas por seis a 16 horas. Isso resultará na redução da amilina residual a uma concentração menor ou igual a dois micromolares.Após o tratamento com CAD, retire as unidades de plaquetas do agitador, pendure as plaquetas, quebre a cânula na saída do recipiente de CAD e permita que as plaquetas fluam para os dois recipientes de armazenamento. Em seguida, expulse o ar dos recipientes de armazenamento. Selle o tubo acima da bifurcação em Y e remova o recipiente de CAD.O resultado são dois concentrados de plaquetas inativados para patógenos para avaliação da função plaquetária in vitro. A dose de plaquetas, pH, pO₂, produção de lactato e consumo de glicose do intercepto foram determinados. Os concentrados de plaquetas foram analisados até o sétimo dia de armazenamento.Esta figura mostra a dose média inicial de plaquetas do concentrado de plaquetas em dose dupla antes do tratamento com intercepto e a dose média de plaquetas em cada produto fracionado tratado até o sétimo dia de armazenamento. Como pode ser observado aqui, a perda de plaquetas durante o armazenamento foi de aproximadamente 9%. Essa redução não difere da perda esperada de plaquetas durante o armazenamento de plaquetas convencionais. De acordo com os requisitos europeus, o pH das plaquetas deve permanecer acima de 6,4 até o final da vida útil.Durante o processamento, o pH dos concentrados de plaquetas diminui ligeiramente conforme o volume da concentração de plaquetas e a permeabilidade ao gás do recipiente de armazenamento de plaquetas. Este gráfico mostra o pH dos produtos plaquetários fracionados ao longo de sete dias de armazenamento, em que o pH se mantém estável e bem preservado dentro dos requisitos de processamento. O metabolismo aeróbico deve continuar ocorrendo nas plaquetas armazenadas e é um indicador da capacidade das plaquetas de funcionar in vivo após a transfusão em um paciente.O consumo de O₂ e a produção de CO₂ indicam a respiração contínua das plaquetas interceptadas no recipiente PL 24 10 durante sete dias de armazenamento. Da mesma forma, o metabolismo anaeróbio deve continuar nas plaquetas armazenadas. Assim, o consumo de glicose e a produção de lactato também são indicadores da capacidade das plaquetas de funcionar após a transfusão.Essas duas figuras mostram os níveis de lactato e glicose durante sete dias de armazenamento. O consumo de glicose pelas plaquetas e a produção de lactato são consistentes entre si. Durante os sete dias de armazenamento, cinco unidades apresentaram níveis de glicose inferiores a 1,11 milimol por litro, que é o limite inferior para o ensaio de glicose.A preparação do código Buffy e a validação do pooling produziram concentrados de plaquetas que atendem aos critérios de entrada para o tratamento com intercept, especificamente volume, contagem de plaquetas, proporção de plasma e contaminação por hemácias. As unidades finais atendem aos critérios de validação durante sete dias de armazenamento, incluindo dose de plaquetas e pH. A principal vantagem desta técnica em relação ao método convencional de preparação do código buffer, que produz um concentrado de plaquetas de dose única, é que ela maximiza o rendimento dos componentes a partir das coletas de sangue, reduz despesas operacionais ao utilizar uma técnica de dose dupla e melhora a segurança do paciente ao inativar patógenos transmitidos por transfusão.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Neste vídeo, demonstramos o isolamento de células mononucleares do sangue periférico, PBMCs, contendo monócitos e linfócitos de um revestimento leucocitário humano por centrifugação com gradiente de densidade. Os PBMCs isolados podem ser usados para análise posterior.

Isolamento de células mononucleares do sangue periférico de revestimentos de buffy humanos

Este vídeo demonstra o processo de redução de patógenos à base de riboflavina e luz UV contra a contaminação bacteriana de alto título em produtos plaquetários humanos. Esse processo pode ajudar a diminuir o risco de eventos adversos graves de transfusão associados à contaminação bacteriana.

Um tratamento com riboflavina e luz ultravioleta de produtos plaquetários para eliminar bactérias

As condições de armazenamento dos produtos plaquetários criam um ambiente ideal para que os contaminantes bacterianos se multipliquem a níveis perigosos.  O objetivo deste estudo foi usar um ensaio de formação de colônias para avaliar um processo de redução de patógenos à base de riboflavina contra contaminação bacteriana de alto título em produtos plaquetários humanos.

Tratamento de produtos de plaquetas com riboflavina e luz UV: Eficácia Contra alta Titer contaminação bacteriana

A transfusão de plaquetas e hemostasia foi modelada usando reconstituição sanguínea e câmaras de fluxo microfluídico para investigar a função dos bancos de plaquetas de sangue. Os dados demonstram as consequências da lesão de armazenamento plaquetário na hemostasia, in vitro.

Microfluídico Fluxo Chambers utilizando sangue reconstituído ao Modelo Hemostasia e transfusão de plaquetas<em&gt; In Vitro</em

Este trabalho descreve um modelo experimental de hemostasia que mede simultaneamente a função plaquetária e coagulação. Plaquetas e fibrina de fluorescência é medida em tempo real, e taxa de adesão de plaquetas, taxa de coagulação, e o início da coagulação são determinados. O modelo é usado para determinar as propriedades pró-coagulantes de plaquetas sob fluxo em concentrados para transfusão.

Um Modelo de Câmara Microfluidic Fluxo de transfusão de plaquetas e Hemostasia Medidas deposição de plaquetas e formação de fibrina em tempo real

Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

Gestão de inventário de plaquetas com base no conteúdo de micropartículas em concentrados de plaquetas de rastreio é uma nova iniciativa de melhoria de qualidade em bancos de sangue do hospital. O objetivo é diferenciar registrados de plaquetas não está ativado para otimizar o uso de plaquetas. Fornecimento de plaquetas não está ativado para pacientes de Hematologia-Oncologia pode reduzir seu risco elevado para se tornar refratários.

Método de triagem para micropartículas em transfusões de plaquetas de rotina

Este protocolo apresenta um guia acessível para coletar, armazenar e descongelar células mononucleares do sangue periférico adequado para análises e fluxos de trabalho a jusante, como citometria de fluxo e sequenciamento de RNA. Coleções de plasma e pelagem leucocitária também são demonstradas.

Isolamento e criopreservação de células mononucleares de sangue periférico humano altamente viáveis de sangue total: um guia para iniciantes

Este protocolo detalha um método compatível com automação de alto rendimento para isolar células mononucleares do sangue periférico humano para biobancos e outros fins.

Isolando células mononucleares do sangue periférico humano de Buffy Coats por meio de separação de esferas imunomagnéticas de alto rendimento

A função plaquetária sob fluxo pode ser avaliada e a ressuscitação hemostática simulada pode ser modelada usando um dispositivo microfluídico, que tem aplicações em trauma e medicina transfusional.

Microfluídica na avaliação da função plaquetária

O metabolismo plaquetário é de interesse, particularmente no que se refere ao papel da hiper e hipoatividade plaquetária no sangramento e distúrbios trombóticos. O isolamento de plaquetas do plasma é necessário para alguns ensaios metabólicos; Apresentamos aqui um método para isolamento de metabólitos intracelulares de plaquetas lavadas.

Preparação de plaquetas humanas lavadas para estudos quantitativos de fluxo metabólico

Aprenda a preparar concentrados plaquetários de dose dupla a partir de buffy coats com inativação de patógenos pelo Sistema INTERCEPT. Este método garante qualidade in vitro por sete dias de armazenamento.

Preparação e inativação de patógenos de dose dupla de Buffy produtos de plaquetas revestimento utilizando o Sistema de Sangue INTERCEPT (Vídeo) | JoVE Journal

Preparação e inativação de patógenos de dose dupla de Buffy produtos de plaquetas revestimento utilizando o Sistema de Sangue INTERCEPT

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