Name: Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Aprenda a realizar transfecção site-specific em células aderentes usando matrizes de microeletrodos e eletroporação. Este método permite entrega precisa de siRNA com alta eficiência em neurociência e biologia celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. MEA Preparação <ol><li> MEAs para uso em experimentos de eletroporação pode ser fabricado usando a técnica de fotolitografia padrão, como descrito anteriormente 18 ou comprados diretamente de fornecedores de fabricantes MEA como Sistemas Multi Channel <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> e MED Alpha Scientific, Inc. <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Os MEAs utilizados em nossos experimentos foram fabricados em casa na instalação de sala limpa na Universidade Estadual do Arizona, que é administrado pelo Centro de Pesquisas do Estado Sólido Eletrônica (CSSER). Os MEAs utilizados em nossos experimentos teve 32 índio eletrodos de óxido de estanho em um 8 por 4 matriz com tamanhos de eletrodos de diâmetro 50-200 mM dentro de um vidro 1 cm de diâmetro interior também. O vidro bem foi colada sobre a MEA usando polidimetilsiloxano (PDMS). </li><li> Esteriliza-se o MEA em autoclave antes da célula seeding. Outros métodos de esterilização, tais como a imersão em etanol a 70%, tratamento com UV e tratamento com água quente, tal como descrito noutro local também pode ser utilizado, desde que não comprometam a integridade do MEA. </li><li> Transfira a MEA autoclavado a uma capela de fluxo laminar e colocá-lo em um estéril prato de poliestireno padrão Petri. Antes de semear as células da MEA, esterilizar a câmara de fluxo laminar, ligando a luz UV durante 20 min. Se o MEA é sensível à luz UV cobrir a placa de Petri contendo o MEA com folha de alumínio estéril enquanto o capuz de fluxo está sob iluminação UV. </li></ol> 2. As células de sementeira no MEA <ol><li> Células de colheita a partir de uma linha de células aderentes em execução de células de mamíferos utilizando tripsina / EDTA e elevá-las a uma concentração de 100-200 células / uL de 1 ml de meio de células de galvanização. Em nossas experiências, temos sido bem sucedidos em cultura de células NIH 3T3 linha de fibroblastos, células HeLa e linha primários neurônios corticais e do hipocampo no MEA. </li><li&gt; Coloque uma gota 20-30 ul dos meios de comunicação com as células da MEA. Transferir a placa de Petri com o MEA para a incubadora. É importante assegurar que o tamanho de gota de célula é suficientemente larga para abranger todos os eléctrodos do MEA. </li><li> 2 horas depois de semear as células transferir a placa de Petri com o MEA da incubadora a câmara de fluxo laminar e adicionar suavemente 400-500 ul de pré meios aquecidos (37 ° C) para o MEA bem. Verificar ao microscópio para garantir que as células que ainda estão presos e uniformemente distribuído sobre a superfície MEA. Transferir a volta MEA para a incubadora. O período de espera de 2 horas antes da adição de media garante um tempo suficiente para que as células adiram à superfície MEA. Além dos meios de comunicação celulares também logo após a semeadura das células pode lavar as células. Se as células não aderem bem no MEA, a sua superfície pode ser tratada com factores de fixação de células aspolylysine tal, fibronectina, laminina e para melhorar a adesão celular. Em nossos experimentos com células HeLa que normalmente tratam a superfície MEA com fibronectin (10 ug / ml) durante 1-2 horas. </li><li> 8-12 horas após a sementeira das células, executa 1-2 lavagens com PBS para remover as células mortas. Meio celular pode substituir cada 24-48 horas, conforme necessário. Numa experiência típica, as células são usualmente preparados para a transfecção 24-48 horas após a sementeira. Para manter a consistência na eficácia de electroporação, recomenda-se esperar que a cultura é de pelo menos 80% confluentes antes da electroporação. </li></ol> 3. Site-specific A transfecção de siRNA <ol><li> Preparar uma solução de ácido nucleico. Para a transfecção siRNA, preparar uma solução de 1-2 uM de electroporação em gelo siRNA tampão de electroporação gelado para atingir um volume final de 200-400 ul. Neste artigo de vídeo que demonstram a transfecção de células HeLa com Alexa 488 scrambled sequência conjugado de siRNA. </li><li> Transferir o MEA com as células a partir do incubador a capa de fluxo laminar estéril. Remover os meios de comunicação celular a partir da MEA e efectuar uma lavagem com PBS. Em seguida, adicione 200-400 ul do ice frio de 1 uM solução eletroporação de siRNA para o bem. </li><li> Aplicar anódicas quadrados impulsos elétricos para os eletrodos direcionados (Consulte o passo 4 para determinar os parâmetros ótimos do pulso elétrico). Em nossos experimentos utilizamos uma Instrumentos pragmáticas gerador de onda 2414A para gerar pulsos elétricos e um dual-inline-package (DIP) 16 clipe pino para fazer contato com as pastilhas de títulos MEA. O gerador de forma de onda pode ser ligado ao clipe DIP através de uma placa de circuito impresso para proporcionar demultiplexor selectividade dos eléctrodos individuais. Para o eléctrodo de referência, coloque um cátodo de aço nos meios de comunicação celular. , Baixando o eléctrodo de referência de aço nos meios de comunicação, é extremamente importante para assegurar que não entra em contacto com a superfície do MEA. Em contacto, pode provocar danos nas células e o MEA. Recomenda-se a diminuir o eléctrodo de referência para uma posição, de 1 mm acima das células. Um espaçador com uma altura de 1 mm pode ser colocada no poço para auxiliar no posicionamento da refeletrodo cia. Uma abordagem alternativa ao uso de um eletrodo de referência externo é usar eletrodos vizinhos como cátodo ânodo-pares. </li><li> Imediatamente após a aplicação dos impulsos eléctricos para os eléctrodos de alvo no MEA, transferir o MEA volta para a incubadora. Após um período de incubação de 5 min, colocar suavemente a 75% do tampão de electroporação, com pré-aquecido (37 ° C) meios de comunicação celular. Mais tarde, imagiologia fluorescente pode ser feito para confirmar a entrega de siRNA fluorescentemente marcado para as células. </li></ol> 4. Otimização de parâmetros eletroporação <ol><li> Para determinar os parâmetros óptimos de impulsos eléctricos para electroporação, as experiências de electroporação de design para um intervalo de valores de amplitude de pulso, duração do impulso, e o número de pulsos. Na nossa experiência com as células HeLa, observou-se que um impulso de tensão de amplitude única de 3 V a 9 V, e duração de 1 mseg e 10 mseg para um tamanho de 100 um eléctrodo levaram a electroporação com sucesso mimorte celular nimal. É nossa recomendação que um parâmetro ser variada de cada vez e os outros são mantidas constantes. Para quantificar a eficiência da electroporação para cada um dos parâmetros de pulso, usamos iodeto de propídio (PI), um corante impermeante celular que o material de manchas nucleico e metodologia de ensaio baseado em directo, tal como descrito nos passos de 4,2-4,5. </li><li> Estabelecer uma cultura de células sobre a MEA seguindo as instruções descritas nos passos 1 e 2. </li><li> Antes da electroporação preparar um pi 300-500, de 30 ug / ml de solução em tampão de PI electroporação frio e 400 ul de 4 uM calcien AM solução em PBS. </li><li> Transferir o MEA da incubadora para a câmara de fluxo laminar. Remover os meios de comunicação celular a partir da MEA e efectuar uma lavagem com PBS. Em seguida, adicione 300-500 ul do tampão de electroporação arrefecido em gelo com PI. </li><li> Aplicar pulsos elétricos com amplitude e duração do pulso desejado para os eletrodos direcionados (O equipamento utilizado em nossos experimentos para gerar e aplicar o elecpulso tric a MEA é descrito na etapa 3.3.) Para o eléctrodo de referência ou um eléctrodo de aço diminuir no tampão de electroporação no MEA bem ou utilizar o eléctrodo vizinho como referência. Ao aplicar selectivamente pulsos de amplitudes diferentes ou durações de eléctrodos diferentes experiências múltiplas pode ser realizada no mesmo dispositivo. Por exemplo, em um 32 eléctrodo de MEA, 8 experiências podem ser realizadas através da divisão dos 32 eléctrodos em 8 grupos, cada um consistindo de quatro eléctrodos. Cada um dos 8 grupos podem então ser estimuladas por um pulso de voltagem rectangular único de duração de 5 mseg com amplitudes variando em 3 V-6 série V em incrementos de 0,5 V e um grupo pode ser usado como um controlo. </li><li> Imediatamente após a aplicação dos impulsos de tensão transferir a MEA na incubadora durante 5 min. Depois, remover suavemente a 75% do tampão de electroporação da MEA bem e substituí-la por meio de células quentes. Transferir a volta MEA para a incubadora. </li><li> Após um período de incubação de 2-4 hrsubstituir o meio de células no MEA bem com 300-500 ul de calceína 4 mM AM solução em PBS. Transferir a volta MEA a incubadora durante mais 30 minutos. </li><li> A seguir à incubação das células com calceína AM, substituir a calceína AM solução no MEA bem com PBS, depois duas lavagens com PBS. Obtenção de imagens fluorescentes das células utilizando um microscópio óptico com com filtros para PI (excitação / emissão - 535 nm/617 nm) e calceína AM (excitação / emissão - 490 nm/520 nm). A captação de PI, devido a eletroporação, faz com que células de fluorescência vermelha ea AM Calcein faz as células que estão vivos para fluorescência verde. Três cenários possíveis que podem ser observados são: 1) celulares eletroporados e vivo fica fluorescente (vermelho e verde), 2) células vivas, mas não eletroporadas (será apenas verde fluorescente) e 3) células mortas devido a eletroporação (só fica fluorescente vermelha) . A viabilidade celular foi calculada como uma percentagem do número total de células vivas no eléctrodo e a electroporação efficiency foi calculada como uma percentagem do número total de células carregadas com PI / siRNA. </li></ol> 5. Resultados representativos A Figura 1 mostra a carga específica do local de células HeLa com PI. Pode-se observar que apenas as células do eléctrodo demonstram uma absorção de PI (Figura 1B). Um ensaio ao vivo realizada pós electroporação foi utilizado para avaliar a viabilidade das células (Figura 1A). A eficiência de electroporação e a viabilidade das células para o exemplo mostrado na Figura 1 são de 81,8% e 96,1%, respectivamente. A viabilidade celular elevada e a eficiência de electroporação pode ser conseguida através da optimização dos parâmetros de electroporação de pulso. Site-specific a transfecção de células Hela com siRNA fluorescentemente marcado para um pulso de electroporação optimizado (8 V, 1 ms) é mostrado na Figura 2. A eficiência de electroporação para o siRNA de 8 V, 1 ms foi encontrado para ser 74,4 ± 16,0% eA viabilidade celular foi encontrado para ser 87,9 ± 8,4% (todos os dados representados como a média ± desvio padrão, n = 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Figura 1. Entrega específica do local de PI em células HeLa num eléctrodo 200 uM (6 V, 5 ms). A) Calcien ensaio baseado vivo realizados dois electroporação pós hr. Células vivas são indicados por fluorescência verde. B) Vermelho de fluorescência demonstra a captação de PI por células sobre o eléctrodo. C) Uma imagem sobreposta de A e B. As setas brancas indicam células que são electroporated e viva. As setas pretas indicam que as células são mortas. O círculo branco em A, B e C indicam o contorno do eléctrodo. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Figura 2. Transfecção de células HeLa com scrambl fluorescentemente marcadoseqüência e de siRNA. A) Imagem de células HeLa sobre um eléctrodo de 100 uM transfectadas com siRNA Alexa 488 marcado (8 V, 1 ms). B) Imagem de núcleos de células coradas com DAPI. O círculo branco marca a extremidade do eléctrodo.

<ol><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).</li>
<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550(2002).</li>
<li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).</li>
<li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).</li>
<li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ%2C+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).</li>
<li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+%28ethyleneimine%29+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium%3F+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+%28MEA%29+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li>
<li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li>
<li>Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).</li>
<li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594(2005).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li>
<li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Neste artigo de vídeo que demonstram a utilização de MEA por site-specific transfecção de células HeLa com scrambled sequência de siRNA. Uma das vantagens desta tecnologia é a sua aplicabilidade a diferentes linhas de células, incluindo linhas de células primárias. O nosso laboratório tem demonstrado previamente a utilização desta tecnologia para o site-specific transfecção de cultura primária do hipocampo neuronal de rato E18 dia de idade e células NIH-3T3 com sequências de siRNA mexidos e GFP plasmídeo 18, 19.</s...

<table border="1"><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Meios celulares: Avançado MEM L-Glutamina 200 mM Penicilina / estreptomicina De soro fetal bovino </td><td> Gibco / Invitrogen HIMEDIA Laboratories / VWR Lonza Group Ltd. Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Composição celular de mídia: 2% de FBS Pennstrep, 2% de L-glutamina e 2% em Advance MEM </td></tr><tr><td> Tripsina EDTA </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 25-053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 21-040-CV </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 e rodamina marcado mexidos sequsiRNA referência </td><td> Qiagen, Inc. </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão de electroporação </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Forma de onda do gerador </td><td> Pragmático </td><td> 2414A </td><td> Qualquer forma de onda / gerador de impulsos que pode fornecer os impulsos desejados podem ser usados. </td></tr></table>

alta eficiência, transfecção site-specific de células aderentes com sirna usando matrizes de microeletrodos (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

A descoberta da via de RNAi em eucariotos e subsequente desenvolvimento de agentes de RNAi, como siRNA e shRNA, ter alcançado um método poderoso para silenciar genes específicos 1-8 para genômica funcional e terapêutica. Um dos maiores desafios envolvidos em estudos de RNAi base é a entrega de agentes de RNAi para as células-alvo. As técnicas tradicionais de entrega não virais, tais como a electroporação em massa e métodos de transfecção químicos muitas vezes não têm o necessário controlo espacial sobre a entrega e proporcionar eficiências de transfecção pobres 9-12. Avanços recentes em métodos químicos, tais como a transfecção lipidos catiónicos, polímeros catiónicos e nanopartículas têm resultado em eficiências de transfecção altamente melhorados 13. No entanto, estas técnicas ainda não oferecem o controle espacial preciso sobre entrega que pode beneficiar imensamente miniaturizado tecnologias de alta capacidade, estudos de células individuais e investigação de interações célula-célula. nt &quot;&gt; Recentes avanços tecnológicos na entrega de genes permitiram alto rendimento a transfecção de células aderentes 14-23, a maioria dos quais utilizam electroporação microescala. electroporação microescala oferece controlo espaço-temporal preciso sobre o parto (até as células individuais) e tem sido demonstrado para obter eficiências elevadas 19, 24-26. Além disso, as abordagens baseadas em electroporação não necessitam de um longo período de incubação (normalmente de 4 horas) com siRNA e complexos de ADN, conforme necessário, em métodos químicos à base de transfecção e levar à entrada directa de ADN nu, e siRNA moléculas no citoplasma celular. Como consequência a expressão de genes pode ser alcançada tão cedo quanto seis horas após a transfecção 27. nosso laboratório tem demonstrado o uso de matrizes de microeletrodos (MEA) de sítio-específica de transfecção em culturas aderentes de células de mamíferos 17-19. Na abordagem baseada MEA, a entrega de carga genética é conseguido através de micro-escala localizada electroporatina de células. Uma aplicação de impulsos eléctricos para os eléctrodos seleccionados gera campo eléctrico local que conduz a electroporação de células presentes na região dos eléctrodos estimulados. O controlo independente dos micro-eléctrodos proporciona um controlo espacial e temporal sobre a transfecção e também permite que múltiplas experiências de transfecção à base a ser executada com a mesma cultura aumentando o rendimento e reduzindo experimental de cultura para cultura de variabilidade. Aqui nós descrevemos a montagem experimental e do protocolo para transfecção alvo de células HeLa aderentes com uma seqüência de siRNA fluorescente etiquetado mexidos com eletroporação. O mesmo protocolo pode também ser utilizado para a transfecção de vectores plasmídicos. Além disso, o protocolo aqui descrito pode ser facilmente alargada a uma variedade de linhas de células de mamíferos, com pequenas modificações. Disponibilidade comercial de MEAs com padrões de eletrodos tanto pré-definidos e personalizados fazer esta t técnica acessívela maioria dos laboratórios de pesquisa Ø com equipamento básico de cultura de células.

Os detalhes do protocolo de artigo para site-specific transfecção de scrambled sequência de siRNA em uma cultura de células aderentes mamíferos usando uma rede de microeletrodos (MEA).

Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA)

A descoberta da via de RNAi em eucariotos e o subsequente desenvolvimento de agentes de RNAi, tais como siRNA e shRNA, proporcionaram um método potente para...

O objetivo geral do experimento a seguir é obter transfeção em locais específicos em células aderentes. Isso é alcançado cultivando uma monocamada de células sobre uma matriz de microeletrodos. Como segundo passo, a aplicação de um pulso elétrico em eletrodos selecionados induz a eletroporação das células-alvo aderidas na superfície dos eletrodos.Isso leva à formação de poros na membrana celular que permitem a entrada de moléculas exógenas na célula. As células-alvo podem então ser analisadas para detectar o fenótipo resultante utilizando um ensaio apropriado. A técnica de transfeção em microescala que descrevemos aqui apresenta várias vantagens importantes em comparação com técnicas convencionais de transfeção, como eletroporação em massa ou transfeção química.A, permite-nos alcançar um controle espacial refinado sobre o próprio processo de transfeção e ajuda-nos a transfectar células individuais ou grupos de células com alta eficiência, mesmo em linhagens celulares difíceis de transfectar. B, é uma abordagem que se escala facilmente e nos auxilia na realização de ensaios moleculares de alto rendimento. Uma das principais vantagens do uso de uma área microeletrodo para transfeção específica de sítios é que ela permite a avaliação funcional simultânea de células-alvo, como eletrofisiologia quantitativa e alterações morfológicas.Para iniciar o procedimento, esterilize o MEA em uma autoclave, transfira o MEA autoclavado para uma câmara de fluxo laminar e coloque-o em uma placa de Petri estéril de poliestireno padrão antes de semear as células no MEA. Esterilize a câmara de fluxo laminar ligando a luz UV por 20 minutos. Se o MEA for sensível à luz UV, cubra a placa de Petri contendo o MEA com papel alumínio estéril enquanto a câmara estiver sob iluminação UV. Em seguida, trate a superfície do MEA com 10 microgramas por mililitro de fibronectina por um a duas horas para as células helo.Realize uma lavagem com água DI e deixe a MEA secar ao ar no capuz de fluxo laminar. Em seguida, recolha as células de uma linhagem celular em crescimento de células mamíferas aderentes utilizando tripsina ETTA e ajuste-as para uma concentração de 100 a 200 células por microlitro em um mililitro de meio celular para semeadura. Depois, coloque uma gota de 20 a 30 microlitros de meio contendo células sobre a MEA.Certifique-se de que seja grande o suficiente para cobrir todos os eletrodos na MEA. Em seguida, transfira a placa de Petri com a MEA para um incubador umidificado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. De duas a quatro horas.Após semear as células, transfira a placa de Petri com a EAM do incubador para a cabine de fluxo laminar. Em seguida, adicione cuidadosamente 400 a 500 microlitros de meio pré-aquecido a 37 graus Celsius ao poço da EAM; depois, verifique ao microscópio para garantir que as células ainda estejam aderidas e uniformemente distribuídas sobre a superfície da EAM. Em seguida, transfira a EAM de volta ao incubador; de oito a 12 horas após a semeadura das células, realize uma a duas lavagens com PBS para remover quaisquer células mortas.Em um experimento típico, as células geralmente estão prontas para transfeção entre 24 e 48 horas após a semeadura. Para manter a consistência na eficiência da eletroporação, recomenda-se aguardar até que o cultivo esteja próximo à confluência antes da eletroporação. Para obter uma transfeção sarna altamente eficiente, é necessário primeiro determinar os parâmetros ideais de pulso de tensão de eletroporação para uma MEA específica.Aqui descrevemos uma sequência de etapas experimentais que envolvem o uso de iodeto de propídio para determinar os parâmetros ideais de eletroporação antes da realização da eletroporação. Prepare uma solução de 300 a 500 microlitros contendo 30 microgramas por mililitro de PI em tampão de eletroporação gelado e 400 microlitros de solução de cálcio AM quatro micromolar em PBS. Em seguida, transfira a MEA do incubador para a cabine de fluxo laminar.Remova o meio celular da MEA e realize uma lavagem com PBS. Em seguida, adicione de 300 a 500 microlitros do tampão de eletroporação gelado com pi. A seguir, coloque um espaçador de um milímetro de altura na MEA.Bem, é extremamente importante garantir que não toque nas células no centro da MEA. Em seguida, conecte a MEA ao interconector elétrico e selecione os eletrodos desejados para a eletroporação. Posteriormente, aplique os pulsos elétricos com a amplitude e duração desejadas aos eletrodos-alvo para a etapa de eletroporação.Abaixe o cátodo de aço coberto com folha de alumínio no poço da MEA até que entre em contato com o espaçador de um milímetro. Imediatamente após, aplique pulsos elétricos aos eletrodos-alvo. Em seguida, repita o passo com um conjunto diferente de eletrodos, conforme o delineamento experimental.Em nossos experimentos com células helo, observamos que um único pulso de tensão com amplitude de três volts a nove volts e duração de um milissegundo a 10 milissegundos, com um eletrodo de tamanho de 100 micrômetros, resultou em eletroporação bem-sucedida com morte celular mínima. Imediatamente após aplicar os pulsos de tensão, transfira a MEA para o incubador por cinco minutos.Após um período de incubação de cinco a 10 minutos, remova cuidadosamente o espaçador da MEA. Em seguida, remova 75% do tampão de eletroporação do poço da MEA e substitua por meio celular aquecido. Então, transfira a MEA de volta para o incubador.Após um período de incubação de duas a quatro horas, substitua o meio celular no poço do MEA por 300 a 500 microlitros de uma solução de cálcio AM a quatro micromolares em PBS. Retorne o MEA ao incubador por mais 30 minutos após a incubação das células com cálcio AM. Substitua o cálcio AM no poço por PBS após uma etapa de lavagem, em seguida obtenha as imagens fluorescentes das células utilizando um microscópio óptico com filtros para pi.A captação de PI devido à eletroporação faz com que as células fluoresçam em vermelho, e o cálcio am faz com que as células vivas fluoresçam em verde. A viabilidade celular para cada eletrodo pode ser estimada por esta equação, e a eficiência de eletroporação para cada eletrodo pode ser estimada por esta equação. Uma vez determinados os parâmetros ótimos de eletroporação, eles podem ser utilizados para a entrega específica em um local de uma molécula, e o procedimento de eletroporação para moléculas de siRNA é o mesmo que o procedimento de eletroporação para pi.É mostrada aqui a entrega específica em local de iodeto de propídio em células helo em um eletrodo de 200 micrômetros. O ensaio de viabilidade baseado em cálcio foi realizado duas horas após a eletroporação. As células viáveis são indicadas pela fluorescência verde aqui, e a fluorescência vermelha demonstra a captação de pi pelas células no eletrodo.Aqui está a imagem sobreposta. Essas células foram eletroporadas e estão vivas, enquanto essas células estão mortas. Esta figura mostra a transfeção de irna marcada com rumina em um eletrodo de diâmetro de 200 micrômetros, e esta figura mostra a transfeção de células HeLa com irna marcada com Alexa 488 em um eletrodo de diâmetro de 100 micrômetros.As setas brancas indicam as células transfectadas com irna, enquanto as setas pretas indicam as células mortas. A técnica que demonstramos aqui pode ser estendida a diferentes linhagens celulares, incluindo linhagens primárias de difícil transfeção, e para transfectá-las com moléculas maiores, como plasmídeos e proteínas.

high-efficiency-site-specific-transfection-adherent-cells-with-sirna

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Aqui usamos uma biblioteca esiRNA humanos em uma tela de high-throughput de genes envolvidos na divisão celular. Demonstramos como configurar e realizar uma esiRNA telas, bem como a forma de analisar e validar os resultados.

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

Este protocolo fornece as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas na AAM.

Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA)

Estratégia de Transfection otimizado para gravação de Expressão e eletrofisiológicos de Recombinante dos canais de íon em HEK-293T Células

O retículo endoplasmático desempenha um papel fundamental na biogênese de proteínas e na homeostase do cálcio. Nós estabelecemos um sistema experimental que nos permite abordar o papel dos canais de Ca2 + de vazamento e para caracterizar o suposto mecanismos de regulação. Este sistema envolve siRNA silenciamento gênico mediado e de células vivas Ca2 + imagem.

Imagens ao vivo de cálcio celular Combinado com siRNA silenciamento gênico mediado Identifica Ca 2 + Canais de vazamento na membrana ER e seus mecanismos de regulação

O vídeo demonstra como usar um arranjo de microeletrodos (MEA) para registrar a atividade eletrofisiológica de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). A atividade eletrofisiológica de um MEA multipoço contendo uma co-cultura neurônio-astrócitos é registrada para detectar potenciais de ação de vários neurônios na rede, confirmando a diferenciação bem-sucedida de hiPSCs em neurônios.

Medindo a atividade eletrofisiológica de redes neuronais usando matrizes de microeletrodos

Descrevemos um método para experimentos de depleção-resgate que preserva a integridade celular e a homeostase proteica. A adenofecção permite análises funcionais de proteínas dentro de processos biológicos que dependem de dinâmicas baseadas em actina finamente ajustadas, como divisão celular mitótica e miogênese, no nível de célula única.

Adenofection: Um método para estudar o papel de chaperones moleculares em Cellular Morfodinâmica por experimentos depleção de resgate

Este protocolo visa demonstrar como combinar em vitro matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronal. Análise de dados, ou seja, a detecção e caracterização de potenciais de ação, de propagação é realizada utilizando um novo avançado, ainda amigável e livremente disponível, ferramenta computacional.

Microfluídica interfaceamento com matrizes de microeletrodos para estudar comunicação Neuronal e propagação de sinal Axonal

Este protocolo descreve o transfection do plasmídeo da elevado-produção de pilhas de mamíferos em uma placa 384-well usando a tecnologia acústica da ejeção da gota. O tempo-demorado, erro-propenso a dispensar e Multiplexing do ADN, mas igualmente a dispensação do reagente do transfection, são software-driven e executado por um dispositivo do nanodispenser. As células são então semeadas nestes poços pré-preenchidos.

Multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA de alta produtividade usando tecnologia de Nanodosagem acústica

Este protocolo visa descrever uma nova metodologia para medir a taxa de disparo cardíaco intrínseco usando o registro de matriz de microeletrínda de todo o tecido do nódulo sinoatrial para identificar defeitos de marcação de ritmo em camundongos. Agentes farmacológicos também podem ser introduzidos neste método para estudar seus efeitos no ritmo intrínseco.

Microelectrode Array Gravação da Taxa de Disparo de Nó Sinoatrial para identificar defeitos intrínsecos de marcação cardíaca em camundongos

A combinação de poração a laser e matrizes de microeletrodos (MEA) permite registros semelhantes ao potencial de ação de cardiomiócitos primários cultivados e derivados de células-tronco. A forma de onda fornece uma visão superior do modo de ação dos compostos de teste do que as gravações padrão. Ele vincula patch-clamp e leitura de MEA para otimizar ainda mais a pesquisa de segurança cardiovascular no futuro.

Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança

Aprenda a realizar transfecção site-specific em células aderentes usando matrizes de microeletrodos e eletroporação. Este método permite entrega precisa de siRNA com alta eficiência em neurociência e biologia celular.

Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA)

Explorar mais vídeos