Alta eficiência, Transfecção site-specific de células aderentes com siRNA Usando matrizes de microeletrodos (MEA)
13 de setembro de 2012
Os detalhes do protocolo de artigo para site-specific transfecção de scrambled sequência de siRNA em uma cultura de células aderentes mamíferos usando uma rede de microeletrodos (MEA).
O objetivo geral do experimento a seguir é obter transfeção em locais específicos em células aderentes. Isso é alcançado cultivando uma monocamada de células sobre uma matriz de microeletrodos. Como segundo passo, a aplicação de um pulso elétrico em eletrodos selecionados induz a eletroporação das células-alvo aderidas na superfície dos eletrodos.
Isso leva à formação de poros na membrana celular que permitem a entrada de moléculas exógenas na célula. As células-alvo podem então ser analisadas para detectar o fenótipo resultante utilizando um ensaio apropriado. A técnica de transfeção em microescala que descrevemos aqui apresenta várias vantagens importantes em comparação com técnicas convencionais de transfeção, como eletroporação em massa ou transfeção química.
A, permite-nos alcançar um controle espacial refinado sobre o próprio processo de transfeção e ajuda-nos a transfectar células individuais ou grupos de células com alta eficiência, mesmo em linhagens celulares difíceis de transfectar. B, é uma abordagem que se escala facilmente e nos auxilia na realização de ensaios moleculares de alto rendimento. Uma das principais vantagens do uso de uma área microeletrodo para transfeção específica de sítios é que ela permite a avaliação funcional simultânea de células-alvo, como eletrofisiologia quantitativa e alterações morfológicas.
Para iniciar o procedimento, esterilize o MEA em uma autoclave, transfira o MEA autoclavado para uma câmara de fluxo laminar e coloque-o em uma placa de Petri estéril de poliestireno padrão antes de semear as células no MEA. Esterilize a câmara de fluxo laminar ligando a luz UV por 20 minutos. Se o MEA for sensível à luz UV, cubra a placa de Petri contendo o MEA com papel alumínio estéril enquanto a câmara estiver sob iluminação UV. Em seguida, trate a superfície do MEA com 10 microgramas por mililitro de fibronectina por um a duas horas para as células helo.
Realize uma lavagem com água DI e deixe a MEA secar ao ar no capuz de fluxo laminar. Em seguida, recolha as células de uma linhagem celular em crescimento de células mamíferas aderentes utilizando tripsina ETTA e ajuste-as para uma concentração de 100 a 200 células por microlitro em um mililitro de meio celular para semeadura. Depois, coloque uma gota de 20 a 30 microlitros de meio contendo células sobre a MEA.
Certifique-se de que seja grande o suficiente para cobrir todos os eletrodos na MEA. Em seguida, transfira a placa de Petri com a MEA para um incubador umidificado a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. De duas a quatro horas.
Após semear as células, transfira a placa de Petri com a EAM do incubador para a cabine de fluxo laminar. Em seguida, adicione cuidadosamente 400 a 500 microlitros de meio pré-aquecido a 37 graus Celsius ao poço da EAM; depois, verifique ao microscópio para garantir que as células ainda estejam aderidas e uniformemente distribuídas sobre a superfície da EAM. Em seguida, transfira a EAM de volta ao incubador; de oito a 12 horas após a semeadura das células, realize uma a duas lavagens com PBS para remover quaisquer células mortas.
Em um experimento típico, as células geralmente estão prontas para transfeção entre 24 e 48 horas após a semeadura. Para manter a consistência na eficiência da eletroporação, recomenda-se aguardar até que o cultivo esteja próximo à confluência antes da eletroporação. Para obter uma transfeção sarna altamente eficiente, é necessário primeiro determinar os parâmetros ideais de pulso de tensão de eletroporação para uma MEA específica.
Aqui descrevemos uma sequência de etapas experimentais que envolvem o uso de iodeto de propídio para determinar os parâmetros ideais de eletroporação antes da realização da eletroporação. Prepare uma solução de 300 a 500 microlitros contendo 30 microgramas por mililitro de PI em tampão de eletroporação gelado e 400 microlitros de solução de cálcio AM quatro micromolar em PBS. Em seguida, transfira a MEA do incubador para a cabine de fluxo laminar.
Remova o meio celular da MEA e realize uma lavagem com PBS. Em seguida, adicione de 300 a 500 microlitros do tampão de eletroporação gelado com pi. A seguir, coloque um espaçador de um milímetro de altura na MEA.
Bem, é extremamente importante garantir que não toque nas células no centro da MEA. Em seguida, conecte a MEA ao interconector elétrico e selecione os eletrodos desejados para a eletroporação. Posteriormente, aplique os pulsos elétricos com a amplitude e duração desejadas aos eletrodos-alvo para a etapa de eletroporação.
Abaixe o cátodo de aço coberto com folha de alumínio no poço da MEA até que entre em contato com o espaçador de um milímetro. Imediatamente após, aplique pulsos elétricos aos eletrodos-alvo. Em seguida, repita o passo com um conjunto diferente de eletrodos, conforme o delineamento experimental.
Em nossos experimentos com células helo, observamos que um único pulso de tensão com amplitude de três volts a nove volts e duração de um milissegundo a 10 milissegundos, com um eletrodo de tamanho de 100 micrômetros, resultou em eletroporação bem-sucedida com morte celular mínima. Imediatamente após aplicar os pulsos de tensão, transfira a MEA para o incubador por cinco minutos.
Após um período de incubação de cinco a 10 minutos, remova cuidadosamente o espaçador da MEA. Em seguida, remova 75% do tampão de eletroporação do poço da MEA e substitua por meio celular aquecido. Então, transfira a MEA de volta para o incubador.
Após um período de incubação de duas a quatro horas, substitua o meio celular no poço do MEA por 300 a 500 microlitros de uma solução de cálcio AM a quatro micromolares em PBS. Retorne o MEA ao incubador por mais 30 minutos após a incubação das células com cálcio AM. Substitua o cálcio AM no poço por PBS após uma etapa de lavagem, em seguida obtenha as imagens fluorescentes das células utilizando um microscópio óptico com filtros para pi.
A captação de PI devido à eletroporação faz com que as células fluoresçam em vermelho, e o cálcio am faz com que as células vivas fluoresçam em verde. A viabilidade celular para cada eletrodo pode ser estimada por esta equação, e a eficiência de eletroporação para cada eletrodo pode ser estimada por esta equação. Uma vez determinados os parâmetros ótimos de eletroporação, eles podem ser utilizados para a entrega específica em um local de uma molécula, e o procedimento de eletroporação para moléculas de siRNA é o mesmo que o procedimento de eletroporação para pi.
É mostrada aqui a entrega específica em local de iodeto de propídio em células helo em um eletrodo de 200 micrômetros. O ensaio de viabilidade baseado em cálcio foi realizado duas horas após a eletroporação. As células viáveis são indicadas pela fluorescência verde aqui, e a fluorescência vermelha demonstra a captação de pi pelas células no eletrodo.
Aqui está a imagem sobreposta. Essas células foram eletroporadas e estão vivas, enquanto essas células estão mortas. Esta figura mostra a transfeção de irna marcada com rumina em um eletrodo de diâmetro de 200 micrômetros, e esta figura mostra a transfeção de células HeLa com irna marcada com Alexa 488 em um eletrodo de diâmetro de 100 micrômetros.
As setas brancas indicam as células transfectadas com irna, enquanto as setas pretas indicam as células mortas. A técnica que demonstramos aqui pode ser estendida a diferentes linhagens celulares, incluindo linhagens primárias de difícil transfeção, e para transfectá-las com moléculas maiores, como plasmídeos e proteínas.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para realizar transfeção em sítios específicos em células aderentes de mamíferos utilizando um arranjo de microeletrodos (MEA). O método envolve eletroporação para facilitar a entrada de moléculas exógenas em células-alvo.
Principais Componentes do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Eletrfisiologia
Antecedentes
- A transfeção específica de sítio é fundamental para a entrega direcionada de genes.
- As matrizes de microeletrodos permitem um controle preciso sobre a eletroporação.
- Os métodos convencionais de transfeção podem apresentar falta de especificidade.
- Essa técnica aumenta a eficiência da introdução de siRNA nas células.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para transfeção em locais específicos.
- Melhorar a entrega de siRNA em células aderentes.
- Avaliar as alterações fenotípicas resultantes nas células-alvo.
Métodos Utilizados
- Cultivar uma monocamada de células aderentes em uma matriz de microeletrodos.
- Aplicar pulsos elétricos a eletrodos selecionados para eletroporação.
- Criar poros na membrana celular para facilitar a entrada de moléculas.
- Selecionar células com base em alterações fenotípicas utilizando ensaios apropriados.
Resultados Principais
- Transfecção com sucesso em locais específicos de células-alvo.
- Maior captação de siRNA em comparação com métodos convencionais.
- Capacidade comprovada de triagem para fenótipos resultantes.
- Vantagens destacadas das técnicas de transfeção em microescala.
Conclusões
- O método descrito oferece uma abordagem precisa para a entrega gênica.
- Ele fornece vantagens significativas em comparação com as técnicas tradicionais de transfeção.
- Essa técnica pode ser aplicada a diversas áreas de pesquisa em biologia celular.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A transfeção específica de locais usando matrizes de microeletrodos resolve um gargalo crítico na genômica funcional e na validação de alvos, permitindo um controle espacial preciso da entrega de siRNA em populações de células aderentes. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva nas fases iniciais de descoberta ao reduzir efeitos fora do alvo e melhorar a reprodutibilidade dos ensaios, apoiando diretamente a desmistificação mecanicista de hipóteses terapêuticas. A compatibilidade do método com fluxos de trabalho de alto rendimento e linhagens celulares diversas o posiciona como uma capacidade escalável para identificação de compostos líderes e confirmação pré-clínica de alvos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas por meio da entrega espacialmente restrita de siRNA, esclarecendo a função gênica em contextos celulares específicos.
- Valor Operacional: Reduz o ruído biológico ao transfectar apenas células-alvo, melhorando a relação sinal-ruído em ensaios de triagem fenotípica.
- Valor Preditivo: Apoia a redução de riscos do alvo ao associar o silenciamento gênico localizado a fenótipos celulares observáveis, fortalecendo a inferência causal na validação de vias.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Gera dados quantitativos de eficiência de transfeção específicos para cada eletrodo, permitindo comparação padronizada entre condições experimentais.
- Valor Operacional: Facilita experimentos multiplexados em uma única cultura, reduzindo a variabilidade entre poços e aumentando a produtividade em telas de biblioteca de siRNA.
- Prontidão para Ensaios: Produz leituras binárias de vida/morte por meio de iodeto de propídio e AM de cálcio, permitindo pontuação automatizada por imagem da viabilidade e da eficiência de transfeção.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite a avaliação funcional de células transfectadas por meio da eletrofisiologia ou morfologia integradas, conectando intervenção molecular ao desfecho fenotípico.
- Modelagem Pré-clínica: Apoia sistemas relevantes para doenças ao permitir a entrega de siRNA em locais específicos em células aderentes primárias ou de difícil transfeção, melhorando a fidelidade do modelo.
- Avanço Ajustado ao Risco: Fornece métricas reprodutíveis de transfeção que orientam decisões de avançar ou não em cascatas de validação de alvos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a verificação da hipótese do alvo até a identificação de compostos iniciais, onde é necessária uma perturbação molecular precisa para reduzir os riscos dos mecanismos biológicos antes da triagem de compostos.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação de alvos baseada em hipóteses ao permitir a entrega controlada de siRNA para investigar a função gênica em modelos celulares aderentes.
- Triagem: Oferece transfeção pronta para ensaio e reprodutível, com eficiência quantificável, permitindo triagens confiáveis de compostos ou perturbações genéticas.
- Análises: Fornece métricas específicas por eletrodo de transfeção e viabilidade celular, facilitando comparações baseadas em dados da eficácia do siRNA entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a perturbação molecular a leituras funcionais (por exemplo, eletrofisiologia), apoiando o ancoramento fenotípico em modelos pré-clínicos.
- Reutilização Empresarial: Representa uma plataforma padronizada e reutilizável para entrega de ácidos nucleicos em locais específicos, aplicável a múltiplos projetos e linhagens celulares.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação de alvos por meio da entrega espacialmente controlada e de alta eficiência de siRNA, com efeitos fora do alvo mínimos.
- Valor Operacional: Melhora a reprodutibilidade e escalabilidade por meio de parâmetros padronizados de eletroporação e multiplexação com múltiplos eletrodos.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao reduzir experimentos falhos devido à transfeção inadequada ou variabilidade biológica.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização de alvos ajustada ao risco com base em respostas fenotípicas reprodutíveis ao silenciamento gênico em locais específicos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em cultura de células, princípios de eletroporação e ensaios de viabilidade baseados em fluorescência.
- Depende do acesso a matrizes de microeletrodos, geradores de pulsos e microscopia de fluorescência com conjuntos de filtros apropriados.
- Necessita padronização na seleção de eletrodos, parâmetros de pulso e condições de tampão entre diferentes usuários e experimentos.
- Envolve considerações de adaptação para diferentes propriedades de adesão de linhagens celulares e condições ideais de revestimento com fibronectina.
- Limitado pela necessidade de otimização empírica de tensão e duração do pulso por MEA e tipo celular, a fim de equilibrar eficiência de transfeção e viabilidade.
