Dois registros eletrofisiológicos de sinapticamente evocadas Respostas astroglial e neuronal em fatias hipocampais agudas

Classicamente, a comunicação entre os elementos pré e pós-sinápticos envolve um potencial de ação que chega ao terminal pré-sináptico, o qual desencadeia, mediante aumento do cálcio, a liberação de glutamato que ativa receptores pós-sinápticos. No entanto, a observação de que os astrócitos contactam intimamente as sinapses e expressam receptores de neurotransmissores alterou essa visão, levando ao conceito da sinapse tripartite. Dessa forma, a transmissão glutamatérgica contínua também ativará o astrócito e desencadeará um aumento do cálcio intracelular.

A liberação de gliotransmissores, que podem então se ligar a receptores extra-sinápticos ou sinápticos, modula as atividades pré e pós-sinápticas. Além disso, os astrócitos expressam o principal sistema de captação do glutamato liberado sinapticamente. Adicionalmente, eles removem o potássio, que é liberado durante a despolarização do potencial de ação e a subsequente ativação pós-sináptica, a partir dos terminais pré e pós-sinápticos por meio de seus canais de potássio.

Esse potássio é então transportado intracelularmente para locais com níveis mais baixos de potássio extracelular, onde é liberado ou difunde através de junções comunicantes para astrócitos adjacentes. Assim, ao controlar a concentração extracelular de substâncias neuroativas, bem como pela liberação de neurotransmissores, os astrócitos desempenham papéis importantes na definição da intensidade da atividade sináptica. Meu laboratório investiga o papel das interações neurogliciais na fisiopatologia cerebral.

Assim, utilizamos e aperfeiçoamos extensivamente esta técnica para desvendar a parede de astrócitos no processo de transmissão sináptica momento a momento. De fato, esta técnica é poderosa, pois permite monitorar em tempo real e simultaneamente as respostas eletrofisiológicas dinâmicas dos neurônios. E, como parte da clínica Osteocytes Evap hoje, Ash e Jeremy Siebel, membros do laboratório, demonstrarão como realizar esta técnica e explicarão como ela nos ajuda, a nós, na compreensão de um diálogo íntimo entre neurônios e astrócitos.

Investiguei o impacto das redes de astrócitos na atividade neuronal, na transmissão sináptica e na plasticidade, realizando gravações duplas da atividade neuronal e da ocorrência do transporte de potássio e glutamato pelos astrócitos, e descobri que a rede de astrócitos facilita a remoção extracelular de potássio e glutamato durante a atividade neural. Estudei as propriedades e a plasticidade dos astrócitos em relação à neurofisiologia. Durante a gravação da atividade evocada de astrócitos e neurônios, pude identificar que a resposta dos astrócitos à ativação neuronal ocorre principalmente por meio de correntes de potássio.

Essa corrente possui sua própria plasticidade eletrofisiológica, que não regula a excitabilidade neural nem a plasticidade. Em outras palavras, a contagem regressiva dos astrócitos, o elemento mais excitado. Neuros. Apresentaremos aqui um método importante para investigar simultaneamente a atividade urinária e da astrogia em fatias hipocampais agudas, realizando gravações duplas de correntes da membrana astrocítica e potenciais de campo urinários evocados pela estimulação de fibras pré-sinápticas.

Além disso, realizaremos gravações pareadas de neurônios individuais e astrócitos adjacentes para investigar as respostas glicolíticas dos ASTO durante a atividade neuronal. Escolhemos o hipocampo porque esta região apresenta uma forte compartimentalização anatômica e funcional e é bem caracterizada em termos de circuitos neurais, bem como atividade sináptica e plasticidade. Inicie os experimentos preparando fatias cerebrais do hipocampo; para isso, prepare primeiro o oxigênio gelado.

Fluido cefalorraquidiano artificial, anestesie profundamente seus camundongos e remova rapidamente a cabeça, transferindo-a para o LCSA. Abra o crânio com três cortes, separando agora os dois hemisférios. Finalmente, transfira-os para LCSA oxigenado.

Deixe-o entrelaçar igualmente por cerca de cinco minutos. Agora, comece com um hemisfério. A dissecação do hipocampo começa pela remoção do mesencéfalo.

A dissecção detalhada do hipocampo é agora ilustrada nesta figura. Primeiro, posicione o hemisfério separado sobre sua região cortical para acessar o mesencéfalo. Com a ajuda de duas colheres, remova o mesencéfalo.

Agora o hipocampo ficará visível, conforme indicado pelas linhas tracejadas. Disseque o hipocampo com uma colher, começando pelo fílo, que é visível como uma estrutura larga. Insira uma colher abaixo do hipocampo e, com a ajuda de uma segunda colher, corte o córtex adjacente ao hipocampo.

Transfira o hipocampo para um pequeno recipiente de cultura com A CSF oxigenado e prossiga com o segundo hemisfério. Posicione ambos os hippo sobre um pequeno bloco de AGA com o lado alveo voltado para cima. Agora aspire o DS A CSF. Cole o hippo no seu dispositivo de câmara de corte.

Transfira o hipocampo para a câmara de seccionamento e corte fatias de 300 ou 400 micrômetros. Colete as fatias em uma câmara de armazenamento oxigenada e deixe repousar por pelo menos uma hora antes da gravação, à temperatura ambiente, para realizar gravações em massa de astrócitos individuais. Transfira sua fatia de hipocampo para um lamínula revestida com polilisina.

Seque o excesso de LCR A para permitir a adesão do fragmento de hipocampo à lamínula revestida com poli e, em seguida, adicione novamente o LCR A sobre o fragmento. Transfira o fragmento para a câmara de registro, que é constantemente perfundida com LCR A oxigenado a uma velocidade de perfusão de um a dois mililitros por minuto. Para identificar astrócitos, podem ser utilizados camundongos que expressam EGFP sob o promotor específico de astrogliócitos GFAP para gravações de patch clamp.

Preencha uma pipeta de vidro com uma resistência de quatro a seis mega ohms com solução intracelular fria filtrada utilizando solução intracelular contendo rodda dron; assim, você pode visualizar em vermelho o astrócito emparelhado em verde. Veja os astrócitos vizinhos expressando EGFP. Sob o promotor GFAP, os astrócitos podem ser identificados pelo tamanho pequeno de seu corpo celular, em torno de 10 micrômetros, e pelo ramificação de seus principais prolongamentos, incluindo geralmente de três a quatro ramificações.

Uma seringa conectada por meio de tubos ao pipeto permite a aplicação de pressão positiva enquanto se desce no tecido na janela de comando, acionar um pulso de teste de 10 milivolts e reajustar a corrente de retenção. Em seguida, mova o pipeto com a ajuda do micromanipulador para dentro do tecido, aproximando-se da célula. Quando alcançamos a superfície da célula, avançamos mais até observar um encurvamento visível como uma deflexão da luz, indicando que estamos deformando ligeiramente a superfície celular.

Devido à aplicação de pressão positiva, a membrana celular do astrócito agora se selará firmemente na abertura da ponta da pipeta de vidro, o que pode ser observado por um aumento na resistência quando um selo gigaseal é alcançado. Realize a compensação de capacitância e passe para a configuração de granel mediante aplicação suave de pressão negativa, observando as partes do teste na janela de comandos. A penetração na célula será visível pela passagem de corrente através da membrana.

A aplicação de uma série de degraus de voltagem hiperpolarizantes e despolarizantes permite a caracterização das propriedades da membrana celular que os astrócitos normalmente exibem, os quais apresentam apenas respostas de corrente passiva. A injeção de corrente no modo de fixação de corrente não resulta em potencial de ação, o que constitui uma confirmação adicional de que, de fato, você realizou o patch em um astrócito. A adição de um marcador, como enxofre ou domine B, ao seu pipeto de patch permite a visualização do astrócito submetido ao patch.

Além disso, a difusão passiva do marcador durante 20 minutos no modo de fixação de corrente permite visualizar os astrócitos vizinhos conectados por junções comunicantes para realizar gravações duplas da transmissão excitatória neuronal e das correntes astrócitas subsequentemente desencadeadas. Primeiramente, bloqueamos a transmissão inibitória com precor toin para prevenir hiperexcitabilidade, que ocorre na ausência de transmissão GABAérgica. Cortamos as conexões mediadas por colaterais associadas entre CS três e C um com uma pequena faca de íris.

Em seguida, posicionamos um eletrodo de estimulação de campo CSF, um eletrodo de gravação de campo e o eletrodo de patch clamp astrocitário. No corte de hipocampo, escolhemos um astrócito e posicionamos o eletrodo de campo a 5, 200 micrômetros de distância dele para garantir que, de fato, o astrócito integre a atividade registrada com a estimulação de campo. A estimulação dos colaterais de Shafer evocará um potencial de campo excitatório. Esse potencial de campo consiste na parede da fibra, refletindo o número de axônios estimulados, e na subsequente despolarização pós-sináptica, para realizar gravações simultâneas de potenciais neuronais e respostas de corrente em célula inteira da astróglia.

Primeiro, posicione seu eletrodo de registro de campo a aproximadamente 50 micrômetros de distância do astrócito escolhido. Em seguida, mova o eletrodo de patch até o soma astrocitário e realize o patch clamp, verificando a célula escolhida por meio de suas propriedades passivas da membrana, que confirmam tratar-se de um astrócito. Agora, ao estimular Shaer Cs, podemos registrar simultaneamente a atividade neural e uma corrente astrocitária subsequente, que consiste em uma resposta de longa duração até 50 picômetros devido à conectividade de sua rede e ao fato de um único astrócito fazer contato com sinapses de até 100 neurônios.

Essas células integram a atividade de um grande número de sinapses simultaneamente ativadas para realizar gravações duais em célula inteira de neurônios individuais e astrócitos adjacentes, descendo com dois eletrodos de patch na região do estrato do corte do hipocampo. Identifique na região C um neurônio de interesse e, na mesma profundidade, a cerca de 20 a 60 micrômetros de distância, um astrócito; em seguida, posicione ambas as pipetas a aproximadamente 10 micrômetros acima de cada célula, aplicando pressão positiva. A pipeta de gravação astrócita deve ser posicionada o mais próximo possível do astrócito alvo para evitar movimentos mecânicos adicionais.

Primeiro, obtenha o selo gga no neurônio. Agora prossiga com o registro no astrócito, que geralmente selo mais lentamente do que os neurônios. Para resumir os passos importantes para realizar gravações duplas em escala total, abaixe primeiro os dois tubos de registro na fatia.

Aproxime-se do corpo celular do astrócito, então realize o selamento gga no neurônio e finalize realizando o selamento gga no astrócito. Normalmente, os neurônios possuem uma resistência da membrana muito mais alta do que os astrócitos, sendo nos neurônios piramidais em torno de 200 a 500 mega. Tendo ambas as células agora no modo de fixação de voltagem T e hiperpolarizando a membrana, ativam-se correntes transientes de sódio no neurônio e respostas passivas de potássio no astrócito. Aqui mostramos que a indução de potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo rápidos, mediante a estimulação de colaterais shaa, evoca uma resposta de corrente subsequente de longa duração.

A inibição adjacente de astrócitos dos receptores ionotrópicos de glutamato com ácido remico revela que a maior parte da corrente glicial astrocítica é devida à ativação pós-sináptica excitatória. A resposta restante de B AIC consiste na ocorrência rápida e transitória de transporte de glutamato sensível à TBOA e numa pequena corrente de longa duração, provavelmente devida à liberação pré-sináptica de potássio durante o potencial de ação. O disparo do potencial de ação monitora de forma muito confiável a atividade pós-sináptica, já que ambas aumentam linearmente com o aumento da atividade pré-sináptica.

Além disso, as correntes astrocitárias exibem, assim como as respostas neuronais, facilitação de pulso emparelhado. Uma estimulação única moderada das colaterais comissurais induz uma corrente astrocitária evocada sinapticamente relativamente grande em comparação com a pequena despolarização evocada registrada na mesma célula no modo de fixação de corrente. Isso se deve à baixa resistência da membrana dos astrócitos.

A gravação da dinâmica do potencial da membrana TTO glicídica evocada sinapticamente é uma medida direta dos níveis locais de potássio extracelular; ao realizar gravações pareadas de um neurônio e de um astrócito adjacente, não observamos resposta de corrente astrócita enquanto o neurônio gerava potenciais de ação, indicando que eles não estavam acoplados eletricamente. Potenciais pós-sinápticos excitatórios evocados na região CS três também provocaram respostas de corrente astrócita. Além disso, uma estimulação hercina potencializou fortemente a resposta neuronal na região CS três, mas aumentou apenas moderadamente a corrente astrócita.

Após assistir a este vídeo, deveremos ter uma compreensão melhor de como configurar e realizar gravações eletrofisiológicas duplas bem-sucedidas de neurônios e cítos. Usando esta técnica, é possível estudar in loco a sinalização dinâmica entre neurônios e astrócitos para a resposta eletrofisiológica de interesse. Em particular, pode-se investigar se novas interações GL envolvendo funções e modulações de canais iônicos contribuem para definir situações fisiológicas ou patológicas.

Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.