Péptido: Enriquecimento tetrâmero com base MHC das células T específicas para epitopos

O objetivo geral do experimento a seguir é identificar células T específicas de epítopos raros do repertório de células T endógenas de camundongos. Isso é obtido pela primeira coloração das células linfóides colhidas com reagentes de tetrâmero do peptídeo MHC, que marcarão fluorescentemente as células T específicas do epítopo relevante. Essas células marcadas com tetrâmero são então coradas com microesferas magnéticas conjugadas a anticorpos específicos para a etiqueta fluorescente no tetrâmero.

Em seguida, as células marcadas magneticamente são passadas através de uma coluna magnetizada para enriquecer a amostra para células T específicas de epítopos ligados a tetrâmeros. Finalmente, as células são coradas para os marcadores celulares experimentais desejados e a citometria de fluxo multiparâmetro é realizada para detectar e quantificar as raras populações de células T específicas de epítopos enriquecidos com tetrâmero. A principal vantagem de usar essa técnica em relação a outros métodos existentes, como o sistema de transferência adotiva de células T transgênicas TCR, é que os estudos são realizados em populações policlonais reais de células T específicas de epítopos que se desenvolvem naturalmente no sistema imunológico.

Além disso, a alta sensibilidade de detecção proporcionada por essa técnica permite estudos dessas populações quando elas estão presentes em frequências extremamente baixas. Este método pode ajudar a responder a muitas questões-chave no campo da imunologia, como quantas células T virgens podem reconhecer um determinado antígeno de um micróbio patogênico e como a composição clonal de uma população de células T específicas de epítopo muda ao longo de uma resposta imune. Antes de iniciar a dissecação, adicione um mililitro de meio EHAA completo a uma placa de cultura de 60 milímetros contendo um pequeno quadrado de malha de náilon de 100 mícrons e coloque a placa no gelo.

Em seguida, remova o baço de um camundongo sacrificado e o maior número possível de linfonodos de fácil acesso. Coloque os lenços em cima da malha de náilon na placa de cultura. Use a parte superior plana de um tubo de microfuga fechado de 1,5 milímetro para esmagar suavemente os tecidos linfóides na malha de náilon.

Para liberar os linfócitos, adicione outro mililitro de meio ao prato e, em seguida, pipete a solução para cima e para baixo para trabalhar as células em uma suspensão. Agora, coloque uma nova malha de náilon em cima de um novo tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mililitros e, em seguida, transfira as células através da nova malha. Lave o prato e a malha com outro mililitro de mídia fria e puxe os volumes através do novo pedaço de malha para o tubo de 15 mililitros.

Repita o enxágue mais uma vez. Depois de adicionar o tampão classificador a frio até um volume final de 15 mililitros, centrifugue o tubo por cinco minutos a 300 vezes G e quatro graus Celsius. Em seguida, aspire cuidadosamente o snat resus.

Suspenda o pellet celular no bloco FC até um volume final igual a aproximadamente duas vezes o do próprio pellet. Se ocorreu um grande grau de aglomeração celular. Remova cuidadosamente o aglomerado de células com uma ponta de pipeta para corar Para células T específicas do antígeno.

Adicione o tetrâmero MHC do peptídeo marcado com fluorescência ao pellet de célula ressuspensa na concentração otimizada. Em seguida, misture a suspensão celular e incubada no tempo e temperatura otimizados para a ligação do tetrâmero. Em seguida, adicione tampão classificador de frio para aumentar o volume para 15 mililitros e centrifugue mantendo as células a quatro graus Celsius.

De agora em diante, aspire cuidadosamente o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet de célula no tampão do classificador até um volume final de 200 microlitros. Agora adicione 50 microlitros de microesferas conjugadas com anticorpos milévoros que se ligarão especificamente à etiqueta fluorescente da mistura de tetrâmero e, em seguida, incube as células e grânulos ligados ao tetrâmero a quatro graus Celsius.

Após 20 minutos, lave as células no tampão classificador enquanto as células estiverem na centrífuga. Coloque uma coluna magnética milani LS em um ímã quadro max e posicione um novo tubo centrífugo de polipropileno de 15 mililitros. Diretamente abaixo da coluna, adicione três mililitros de tampão classificador no topo da coluna, permitindo que ele escorra para o tubo de 15 mililitros.

Em seguida, coloque um quadrado de malha de náilon de 100 mícrons no topo da coluna. Quando as células terminarem de girar, aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em três mililitros de tampão classificador, transfira a suspensão da célula através da malha de náilon para o topo da coluna. Quando a suspensão da célula tiver drenado completamente para a coluna, enxágue o tubo original com mais três mililitros de tampão classificador e transfira através da malha para a coluna.

Acumulando a lavagem no tubo de coleta, descarte a malha de náilon. Então, quando o tampão tiver sido completamente drenado para o tubo, lave a coluna mais duas vezes com três mililitros de tampão classificador de cada vez. Em seguida, remova a coluna do ímã e coloque a coluna sobre um novo tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mililitros.

Agora adicione mais cinco mililitros de buffer do classificador à coluna. Insira imediatamente o êmbolo no topo da coluna e, em um movimento contínuo, empurre o êmbolo totalmente para baixo, forçando o amortecedor para fora da coluna para dentro do tubo. Depois de girar o tubo que contém a fração ligada iludida e o tubo que contém o fluxo através da fração não ligada, aspirar cuidadosamente o sobrenadante da fração ligada e ressuspender o pellet celular no tampão classificador até um volume final de exatamente 95 microlitros, aspirar e ressuspender a fração não ligada até um volume final de dois mililitros antes de corar ainda mais as frações celulares, Adicione 200 microlitros de contas de contagem em um tubo de fax de cinco mililitros e transfira cinco microlitros de células para este tubo.

Deixe esses tubos de lado a quatro graus Celsius para análise. Mais tarde, combine uma mistura mestre de anticorpos para corar marcadores de superfície nas células de acordo com a tabela. Para a fração ligada, adicione uma dose de coquetel de anticorpos diretamente nas células para a fração não ligada.

Transfira 90 microlitros das células para um tubo de fax de cinco mililitros e adicione uma dose de coquetel de anticorpos à amostra transferida para cada fluorocromo a ser usado. Misture 50 microlitros da fração não ligada restante de células em um tubo de fax de cinco mililitros com um microlitro de anticorpo anti-CD quatro conjugado ao fluorocromo apropriado. Separe um controle não corado também no próximo vórtice e, em seguida, incube todas as amostras a quatro graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, depois de lavar cada tubo em cinco mililitros de tampão classificador, aspire cuidadosamente o sobrenadante das amostras de fração ligada e ressuspenda as células em 200 microlitros de tampão classificador. Transfira as células para microtubos de 1,2 mililitro, fax e, em seguida, enxágue os tubos anteriores com mais 200 microlitros de tampão classificador, agrupando os enxágues nos microtubos correspondentes. Se os aglomerados forem aparentes, passar as células através de um filtro de 50 mícrons para a fracção não ligada e os controlos de compensação, decantar o sobrenadante e ressuspender os pellets num mililitro de tampão classificador.

Analise as amostras coradas usando uma sequência de portas de inclusão sucessivas para identificar células T CD quatro positivas ou oito células T positivas para CD, conforme ilustrado aqui para as amostras de fração ligada. Colete o maior número possível de células até um máximo de 2 milhões de eventos totais para as amostras de fração não ligada. Colete 1 milhão de eventos no total.

Finalmente, usando as mesmas configurações da máquina, colete 10.000 eventos das amostras de contas de contagem. Esta primeira figura MOSTRA gráficos representativos de citometria de fluxo do peptídeo MHC, duas amostras de baço e linfonodos enriquecidos com tetrâmero de camundongos virgens para frações celulares ligadas e não ligadas. Uma sucessão de portas foi definida para selecionar dispersão linfóide, dispersão lateral positiva com baixo despejo, CD negativo, três eventos positivos desses CD, quatro eventos positivos ou CD oito eventos positivos foram fechados para a análise de células T específicas de epítopos ou coloração de fundo.

Alíquotas de células não coradas das frações ligadas e não ligadas foram misturadas com contas de contagem fluorescentes e analisadas separadamente. Esses gráficos de densidade representam dados representativos para camundongos previamente imunizados com o peptídeo relevante mais adjuvante completo. A mesma estratégia de bloqueio serial do experimento anterior foi usada para remover qualquer autofluorescência e outros eventos indesejados.

A partir da análise das populações de células T positivas para quatro CDs, a população de células T positivas para a coloração de quatro células T positivas para o peptídeo MHC dois tetrâmeros de células T positivas para quatro CDs. Os números absolutos de células T específicas de epítopos em uma amostra são calculados multiplicando o número total de todas as células na fração ligada da amostra enriquecida, conforme determinado a partir da análise de contagem de contas, pela proporção dessas células que são tetrâmero positivo, conforme determinado a partir da análise de coloração celular para os dados representativos de camundongos virgens mostrados na primeira série de gráficos de densidade, A contagem total de células foi de 4.411 e a contagem de contas foi de 5.589. A concentração de estoque de contas foi duas vezes 10 elevado a quinto por mililitro.

O volume do grânulo foi de 0,2 mililitros e o volume da célula foi de 0,005 mililitros. Assim, esses dados foram utilizados para gerar a concentração celular de 6,31 vezes 10 elevado a sexto por mililitro. A concentração de células foi então multiplicada pelo volume total da amostra para gerar o número total de células.

Esses dados, por sua vez, foram multiplicados pela porcentagem de eventos positivos de tetrâmero da análise celular para determinar que o número de células T positivas para CD específico do epítopo deste camundongo ingênuo era de 98. Para os dados representativos de camundongos imunizados na segunda série de gráficos de densidade, o número total de células T positivas para CDs específicos de epítopos foi de 1,53 vezes 10 elevado a quarto. A eficiência do enriquecimento diminui à medida que o número de células T específicas do epítopo aumenta.

Assim, as células tetrâmero positivas podem ser vistas na fração não ligada de amostras contendo frequências muito altas de células T específicas de epítopos. Nesses casos, o número de células T específicas do epítopo presentes na fração não ligada pode ser calculado separadamente e adicionado ao número encontrado na fração ligada. Por exemplo, na fração representativa de células não ligadas de camundongo imunizado, o número total de células T positivas para CDs específicos do epítopo foi de 8,97 vezes 10 elevado à terceira.

Assim, somando os números nas frações ligadas e não ligadas, havia 2,43 vezes 10 elevado ao quarto total de células T específicas do epítopo CD quatro células T positivas em toda a amostra de camundongo imunizada. De fato, se a expansão celular específica do epítopo for suficientemente robusta, o processo de enriquecimento pode ser ignorado. Após o procedimento de enriquecimento, as etapas de autofixação e permeação podem ser realizadas para permitir a coloração de proteínas intracelulares, como citocinas e fatores de transcrição.

Embora esse método tenha sido originalmente projetado para estudos de células T do baço e dos gânglios linfáticos, ele também pode ser aplicado a outros tecidos, como o timo e o intestino. A técnica também pode ser usada para estudar células T específicas do epítipo em amostras de sangue e tecido humano.