Captura óptica de nanopartículas

O objetivo geral deste procedimento é criar uma configuração de aprisionamento óptico por abertura para prender partículas de cerca de 20 nanômetros de tamanho. Para isso, um detector é adicionado a uma configuração existente de aprisionamento a laser óptico para permitir a medição. Em seguida, a solução de nanopartículas a ser medida é dispensada em uma câmara microfluídica com a armadilha de duplo nano orifício, e a câmara é carregada na configuração de aprisionamento óptico.

Quando uma partícula entra na abertura iluminada, a transmissão de luz aumenta drasticamente devido à carga dielétrica. Se a partícula tenta sair da abertura, a transmissão reduzida provoca uma mudança no momento para fora do orifício, e, pela terceira lei de Newton, resulta em uma força que puxa a partícula de volta para dentro do orifício, aprisionando-a. A partícula provoca um deslocamento para o vermelho da curva de transmissão, o qual pode ser monitorado.

Assim, a armadilha pode se tornar um sensor. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram eventos de aprisionamento de nanopartículas, incluindo a desnaturalização de proteínas aprisionadas, indicada por alterações na intensidade do laser ao passar pelo duplo nano-orifício. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o aprisionamento óptico por força de gradiente, é a capacidade de aprisionar nanopartículas menores com intensidades de laser mais baixas.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na bioquímica, como como as proteínas individuais se dobram e interagem, e como as partículas virais infectam células vivas? Geralmente, os indivíduos que utilizam este método enfrentarão dificuldades porque é difícil integrar o duplo orifício nana em um sistema de aprisionamento a laser já existente. A configuração de aprisionamento óptico baseia-se em um kit de pinças ópticas da Thor Lab, equipado com um módulo de medição de força.

Um fotodiodo de avalanche é utilizado para substituir o detector de quadrantes no módulo de medição de força. Ao configurar o sistema de aprisionamento óptico, deve-se usar proteção ocular sempre que o laser estiver ligado. Certifique-se de que o feixe permanecerá confinado em uma área segura operando em uma sala fechada e restringindo o feixe ao máximo dentro da montagem de aprisionamento; deve-se evitar joias reflexivas.

Usam-se luvas de látex. Para garantir a limpeza da óptica, monte o kit de pinça óptica e o módulo de medição de força. De acordo com as instruções do fabricante, o kit de pinça óptica montado possui um design de microscópio invertido e é composto pelos seguintes elementos: um laser de aprisionamento, um objetivo de imersão em óleo de 100x, uma platina de posicionamento de amostra com três eixos e uma câmera CCD.

Observe que é aconselhável proteção contra descarga eletrostática ao manipular diodos a laser. O módulo de medição de força permite a calibração das pinças ópticas por meio da detecção posicional do plano focal traseiro do condensador. Um fotodiodo de avalanche à base de silicone ou um PD é usado em vez dos módulos de medição de força.

O detector de posição de quadrante também insere um filtro resistor-capacitor ou filtro RC usando um resistor de 200 kilo ohms e um capacitor de 100 picofarads. Isso é usado para reduzir o ruído de alta frequência e facilitar a visualização de eventos de aprisionamento no osciloscópio. Use um cabo coaxial para conectar o filtro RC após o APD. Em seguida, use cabos coaxiais e um adaptador em T para conectar o osciloscópio e o módulo de aquisição de dados ao filtro RC.

O sistema agora está pronto para o carregamento da amostra. A abertura com duplo nano orifício é composta por dois nano orifícios usinados em uma película de ouro por meio de um feixe de íons focado. A película tem 100 nanômetros de espessura e é suportada por um substrato de vidro.

Os nano orifícios se sobrepõem para produzir duas pontas afiadas. As nanopartículas serão aprisionadas no espaço entre essas pontas pela luz laser que incide sobre o duplo nano orifício.

Recursos de registro grandes também devem ser usinados no filme metálico para ajudar a identificar a localização do orifício duplo em nanoescala no microscópio óptico. Esses recursos devem ser posicionados a cerca de 100 micrômetros de distância do orifício duplo em nanoescala. Despeje 10 gramas de poli(dimetilsiloxano) ou base de PDMS e um grama de agente de cura em um copo descartável e misture por alguns minutos.

Em seguida, coloque a mistura em uma câmara de vácuo até que todas as bolhas desapareçam. Depois, despeje 1,5 gramas de PDMS em uma placa de Petri com diâmetro de nove centímetros. Aplique o PDMS no fundo da placa de Petri por meio de spin coating a 950 RPM durante 65 segundos, seguindo o procedimento de centrifugação.

A espessura não é crítica, desde que seja inferior a 80 micrômetros. Coloque suavemente três a cinco lamínulas número 1,5 sobre o PDMS de modo que não se sobreponham e faça a evacuação por 30 minutos.

Se durante a evacuação as lamínulas se moverem e ficarem empilhadas umas sobre as outras, mova-as suavemente para separá-las. Certifique-se de manter a camada de PDMS sob as lamínulas fina e uniforme. Em seguida, evacue a placa de Petri novamente por 30 minutos.

Retire a placa de Petri da câmara de vácuo e aqueça-a em uma placa aquecedora por 20 minutos a 85 graus Celsius para curar o PDMS. Uma vez que o PDMS esteja solidificado, use uma lâmina de barbear para cortar ao longo das bordas de uma das lamínulas. Em seguida, com pinça de ponta fina ou uma lâmina, levante cuidadosamente a lamínula; uma fina camada de PDMS aderirá à lamínula.

Coloque a lamínula com PDMS em um novo recipiente de Petri. Em seguida, utilizando uma lâmina de barbear, recorte uma janela de três milímetros por três milímetros no PDMS. Esta janela formará a câmara onde a solução de nanopartículas será mantida.

Use um cortador a laser para fabricar um suporte de lâmina de microscópio de acrílico com um orifício de três quartos de polegada de diâmetro no centro. Fixe a circunferência do orifício com fita adesiva dupla face. Use uma lâmina de barbear para cortar qualquer excesso de fita.

Coloque a lâmina de microscópio fabricada sobre uma das lamínulas revestidas com PDMS preparadas, de modo que o PDMS fique sanduichado entre o vidro e o acrílico. Usando uma pipeta microliterada, adicione algumas gotas de uma solução de nanoesferas de poliestireno a 0,05% em peso por volume à janela de PDMS.

Adicione uma gota sobre a película de ouro onde estão localizados os nano orifícios. Coloque a amostra de ouro sobre lamínulas, com os nano orifícios dentro da janela de PDMS. Certifique-se de que não haja bolhas na câmara.

Em seguida, pressione a amostra dourada contra a lamínula. Remova com cuidado qualquer solução em excesso, pois será utilizado um objetivo de imersão em óleo. Adicione uma gota de óleo no outro lado da lamínula, sobre a janela de PDMS.

Observe atentamente a localização dos nano orifícios. Insira o microscópio. Deslize a lâmina no porta-lâmina com o óleo voltado para baixo e, em seguida, abaixe o porta-lâmina até que o óleo de imersão entre em contato com o microscópio.

Com o objetivo, alinhe aproximadamente a platina de modo que as marcas de registro gravadas no filme de ouro fiquem sob o objetivo. Utilizando um software de aquisição de imagens, como o Thor site, que é fornecido como parte do kit de aprisionamento, localize as marcas de registro no filme de ouro e siga as linhas indicadoras até os nanoorifícios.

Posicione a lâmina de modo que as marcas indicadoras e outras áreas abertas sejam removidas do centro da tela. A transmissão excessiva de luz pode danificar o A PD ligado ao laser. Como o espelho dicróico não é perfeito, deve aparecer um ponto próximo ao centro da tela proveniente do feixe do laser.

Usando o software de controle do estágio piezoelétrico, refine ainda mais o alinhamento nos três eixos. Quando o alinhamento estiver correto, observar-se-á a tensão máxima em um fotodiodo, indicando a maior transmissão através da nanoabertura.

Agora que o sistema está configurado e a amostra foi carregada, podem-se adquirir dados de aprisionamento óptico. Com a ajuda das marcas indicadoras, posicione o ponto próximo a uma localização conhecida de nano furo. Os duplos nano furos serão pequenos demais para serem resolvidos com clareza e aparecerão como pequenos pontos na tela.

A transmissão de luz através da amostra é indicada pelo nível do sinal no osciloscópio. Alinhe ainda mais a amostra para maximizar a transmissão de luz. Tenha cuidado com marcas indicadoras e arranhões visíveis e não visíveis, pois a transmissão de luz será alta nessas áreas; nano orifícios mostrarão saltos súbitos na transmissão de luz, enquanto arranhões não.

Exiba mudanças mais graduais utilizando a placa de onda. Ajuste a polarização da luz para obter a máxima transmissão de luz quando a estrutura de duplo nano orifício estiver polarizada. Para adquirir dados, amostra a tensão dos APDs usando o módulo de aquisição de dados durante o tempo desejado.

Os tempos de aquisição geralmente estão na faixa de centenas de segundos. Nesse caso, utiliza-se um software personalizado para a aquisição de dados e a tensão é amostrada a 2000 vezes por segundo. Utilizando o MATLAB, filtre os dados adquiridos com um filtro KY Gole e plote-os em função do tempo em um gráfico para demonstrar a captura de nanopartículas de poliestireno de 20 nanômetros; a transmissão através do duplo nano-orifício foi medida como uma função do tempo.

Utilizando a transmissão óptica de PD, foi então traçado um gráfico. Ao longo do tempo, o evento de aprisionamento é caracteristicamente súbito, com uma borda acentuada que mostra uma comutação clara entre dois níveis de potência de transmissão, como ilustrado neste exemplo; frequentemente ocorre um aumento no ruído do sinal no estado aprisionado. Esse aumento do ruído decorre do movimento browniano da partícula aprisionada.

Note que, sem a partícula aprisionada, essa fonte de ruído não está presente. Alguns artefatos podem aparecer nos resultados e não indicam eventos de aprisionamento. Resultados que mostram deriva, observada como mudanças lentas na transmissão ao longo de um período de minutos, como mostrado aqui, devem ser descartados. Após este procedimento, outros métodos, como espectroscopia Raman e espectroscopia de fluorescência, podem ser realizados para responder perguntas adicionais sobre a natureza da nanopartícula que está aprisionada após seu desenvolvimento.

Essa técnica abriu caminho para que pesquisadores estudem nanopartículas biologicamente relevantes no nível de molécula única. Por exemplo, para detectar ligação proteica e estudar infecção viral, ambos no nível de molécula única. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como integrar uma armadilha óptica dupla nho a um sistema a laser de microscópio invertido para aprisionar nanopartículas individuais.