Name: Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Aprenda a realizar análise quantitativa FRET para determinar parâmetros cinéticos da protease SENP1 usando pre-SUMO1 marcado. Este método permite medir KM e kcat em tempo real com alta precisão.

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Estamos muito gratos a Victor GJ Rodgers para o conselho valioso. Agradecemos a todos os membros do grupo de Liao de muito perto o trabalho colaborativo e para ajudar com este estudo. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant AI076504 a JL).

1. Construções de plasmídeos <ol><li> Amplificar os quadros de leitura abertos de genes por PCR, e clonar os produtos de PCR em pCRII-TOPO vector. </li><li> Confirmar os produtos de sequenciação e clonagem do cDNA que codifica CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domínios catalíticos de SENP1 para o vector pET28 (b) com um etiqueta de hexa-histidina N-terminal. </li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Transformar células de Escherichia coli da estirpe BL21 (DE3) com pET28 (b) vectores que codificam CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e os domínios catalíticos de SENP1. </li><li> Cultivadas as bactérias transformadas em meio 2xYT durante 3 horas a 37 ° C (com agitação a 250 rpm) para atingir uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm. </li><li> Adicione 100 ^ M isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) (concentração final) para induzir a expressão da proteína e agitar durante 16 horas a 25 ° C a 200 rpm. </li><li> Colheita das bactérias por centrifugção a 10.000 rpm a 4 ° C durante 5 min e ressuspender os em um tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM e 5 mM de imidazole. </li><li> Sonicar as células durante 10 minutos em intervalos de 5 s com um ajuste de potência de 25 W, utilizando MiSonics sonicador 4000 e recolhê-las por meio de centrifugação a 35.000 xg, a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Defina-se a coluna com 500 ml de pérolas de Ni-NTA de uma cultura de L e transferir o sobrenadante para a coluna. </li><li> Lava-se a resina com tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, imidazol 10 mM e duas vezes. </li><li> Proteína elui-se com tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, e 500 mM de imidazole e diálise num tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM e 1 mM de ditiotreitol (DTT) a 4 ° C durante a noite. </li><li> Determinar as concentrações das proteínas purificadas pelo ensaio de Bradford. Método alternativo para a medição da concentração de proteína será SDS-PAGE electroforese em gel e, em seguida, coradas com azul de Coomassie seguido de imagiologiaquantitativo. </li></ol> 3. Quantitativa FRET Análise de Espectro <ol><li> A estratégia geral para o ensaio foi baseado em FRET de sinalização (Figura 1). O par FRET, CyPet e YPet, foi etiquetada com o N-e C-terminais, respectivamente, da pré-SUMO1. SENP1 cliva a proteína de fusão CyPet (pré-SUMO1) YPet-no local Gly-Gly, em SUMO1 do C-terminal e, deste modo, liberta a cauda SUMO com YPet. O sinal FRET é interrompido, resultando num aumento da emissão de CyPet e uma diminuição dramática das emissões de YPet no comprimento de onda de excitação CyPet. </li><li> Quando excitado por luz de comprimento de onda de 414 nm, a emissão total de fluorescência de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a 530 nm pode ser obtido a partir de três fontes: emissões absoluto FRET induzida YPet, a CyPet directo emissão e YPet directa de emissão (figura 2). </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> onde FL 530/414 &lt;/ Sub&gt; é o total de emissões de fluorescência a 530 nm quando excitado a 414 nm, FL FRET é o absoluto FRET sinal, FL CyPet (cont) é a emissão direta CyPet quando excitado a 414 nm, e FL YPet (cont) é o YPet dirigir emissão quando excitado a 414 nm. O índice de (cont) representa contribuição. <ol start="3"><li> A emissão directa de CyPet a 530 nm foi proporcional à sua emissão a 475 nm quando excitado a 414 nm, com uma proporção constante de α. CyPet-SUMO1 foi preparada em concentrações de 50, 100, 200, 500, e 750 nM e 1 mM , e as emissões de 475 e 530 nm foi medida após a excitação a 414 nm para determinar α (Figura 3-1). </li><li> A emissão directa de YPet a 530 nm sob excitação em 414 nm foi proporcional à sua emissão a 530 nm quando excitado a 475 nm, com uma proporção constante de β. YPet foi preparada em concentrações de 50, 100, 200, 500, 750 And 1000 nM, e a emissão a 530 nm foi medida em que as amostras foram excitados por comprimentos de onda de 414 e 475 nm para determinar β (Figura 3-2). </li><li> Quando CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi digerido por SENP1, a clivagem libertado CyPet-SUMO1 ea cauda SUMO1 com YPet. Quando o composto foi excitada a 414 nm, a emissão de fluorescência a 530 nm (FL &#39;530/414) foi reduzida, mas ainda podem ser divididas em três partes como: </li></ol><img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> onde FL &#39;530/414 é a emissão total de fluorescência a 530 nm após a digestão, quando excitado a 414 nm, FL&#39; FRET é o restante sinal FRET absoluto, CyPet FL &#39;(475/414) é a emissão a 475 nm CyPet após a digestão quando excitada a 414 nm (a emissão CyPet aqui é a partir de duas partes: CyPet não digerido (pré-SUMO1)-YPet e digerido CyPet-SUMO1) e FL YPet(530/475) é a emissão YPet quando excitado a 475 nm, que é constante se CyPet (pré-SUMO1)-YPet é digerido ou não. <ol start="6"><li> Após a digestão por SENP1, o restante FRET emissão (FL &#39;FRET) é a seguinte: </li></ol><img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> em que C é a concentração total de CyPet (pré-SUMO1)-YPet e x é a concentração de digerido CyPet (pré-SUMO1)-YPet. <ol start="7"><li> Através da combinação de todos os elementos, a emissão de fluorescência detectada a 530 nm sob excitação de 414 nm (530 FL &#39;/ 414) é o seguinte: </li></ol><img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. FRET baseada Protease Assay para Estudo Cinético Enzyme <ol><li> CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi incubada com o domínio catalítico de SENP1 a 37 ° C num tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM, 0,1% (v /v) de Tween-20 e 1 mM de DTT a um volume total de 80 ml e transferidas para placas de 384 poços. </li><li> Ensaios foram realizados através da medição da emissão de fluorescência a 475 e 530 nm, após uma excitação a 414 nm num leitor de fluorescência de placas com múltiplas cavidades, durante 5 min com intervalos de 15 seg. </li><li> A velocidade da reacção (v) foi correlacionado com a alteração da quantidade de substrato (S), como: </li></ol><img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> A concentração do produto aumentou exponencialmente a partir de 0, tal como [S] 0 (concentração de substrato original) quando t = 0: </li></ol><img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> Quando t = 0, a velocidade inicial (V 0) é a seguinte: </li></ol><img alt="Equação 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> O concentration de SENP1 foi fixado, e a concentração de CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi aumentada de 100 vezes mais do que a concentração de enzima, o que é exigido por equação de Michaelis-Menten. </li><li> Todas as leituras de fluorescência foram analisados ​​pelo método de análise quantitativa FRET e representado no GraphPad Software Prism V para ajustar a equação de Michaelis Menten. A análise de regressão não-linear também pode ser realizada com o auxílio de pacotes de software mais comuns, tais como programas de folha de cálculo (tais como o Microsoft Excel). </li></ol> 5. Resultados representativos Maturação de pré-SUMO1 por SENP1 pode ser determinada por monitorização das alterações do sinal de fluorescência a 475 e 530 nm durante o processo. O resultado mostrou que a velocidade de pré-SUMO1 digestão por SENP1 de um modo de substrato dependente da dose (Figura 4). Isto sugere que o domínio catalítico de SENP1 exibe uma actividade excelente para a maturação de pré-SUMO1. A reação inicialção velocidades foram calculadas através da análise acima, com diferentes concentrações de substrato (Tabela 1). O k cat / K M é geralmente usado para comparar a eficiência de enzimas diferentes com um substrato de uma enzima específica ou com diferentes substratos. K M e V max pode ser obtido a partir da equação de Michaelis-Menten, traçando as velocidades iniciais diferentes, correspondentes para as diferentes concentrações de CyPet (pré-SUMO1)-YPet (Figura 5) k cat foi obtido como.: <img alt="Equação 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> De acordo com a análise acima, o K calculado M foi de 0,21 ± 0,04 mM, o gato k foi 6,90 ± 0,28 s -1, e razão k cat / K M foi de (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> Figura 1. Gráfico de FRET ensaio baseado em protease para a maturação de pré-SENP sumos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> Figura 2. Análise quantitativa de sinal fluorescente como contribuições pelo dador-aceitador e FRET. Dissecação de espectros de emissão a partir de CyPet (pré-SUMO1) YPet sob excitação a 414 nm. CyPet FL (530/414) é emissão CyPet de a 530 nm, com excitação de 414 nm, FL FRET é a FRET induzida emissão YPet a 530 nm sob excitação de 414 nm, e FL YPet (530/414) é a emissão YPet de a 530 nm, com excitação de 414 nm. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Cálculo de direção α fator de emissão e β. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> Figura 4. Análise quantitativa de CyPet (pré-SUMO1) YPet digerido por razões diferentes do domínio catalítico de SENP1. As reações foram monitoradas dentro primeiros 5 min. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> Figura 5. Michaelis-Menten análise gráfica de digestão CyPet (pré-SUMO1)-YPet do por SENP1. Os dados foram traçados e analisados ​​por GraphPad Prism V e de regressão não-linear. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (uM) </td><td> V 0 (^ M / s) </td></tr><tr><td> 0,115 </td><td> 0,0023 ± 0,00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0,214 </td><td> 0,0028 ± 0,00004 </td></tr><tr><td> 0,407 </td><td> 0,0033 ± 0,00007 </td></tr><tr><td> 0,594 </td><td> 0,0037 ± 0,00013 </td></tr><tr><td> 0,725 </td><td> 0,0043 ± 0,00012 </td></tr><tr><td> 1,471 </td><td> 0,0051 ± 0,00036 </td></tr><tr><td> 1,899 </td><td> 0,0050 ± 0,00031 </td></tr><tr><td> 2,300 </td><td> 0,0050 ± 0,00062 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Determinação velocidades iniciais de maturação de pré-SUMO1 por SENP1. Em cada concentração de substrato, quatro amostras foram utilizadas para medir a digestão. O desvio padrão foi de variações destas quatro amostras. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (| iM) </td><td> k cat (s-1) </td><td> k cat / K m (M -1 • s-1) </td></tr><tr><td> 0,21 ± 0,04 </td><td> 6,90 ± 0,28 </td><td> 3,2 ± 0,55 x 10 7 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Parâmetros cinéticos de maturação de pré-SUMO1 por SENP1 por análise quantitativa FRET. O desvio padrão foi de quatro amostras de cada concentração de substrato.

<ol><li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+modification+By+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li>
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<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
<li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li>
<li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+%28SENPs%29+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461(2008).</li>
<li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li>
<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

FRET tecnologia tem sido utilizada para estudar a maturação de pré-SUMO1 por SENP1 9. CFP-YFP foi utilizado como o par de FRET e análise raciométrica, que é a relação entre as emissões de aceitador de doadores, foi utilizada para caracterizar as propriedades cinéticas. No entanto, não há qualquer consideração de dador e aceitador de auto-fluorescência na raciométrica tradicional FRET análise. A relação não é directamente correlacionada com a quantidade de substrato digerido. Relat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PCR II Kit TOPO </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Pesquisa de Produtos Internationa.l Corp </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agrose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie plus (Bradford) Regent Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384-bem placa (fundo de vidro) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 leitor de placas </td><td> Dispositivo Molecular </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitativa fret (förster resonance energy transfer) análise para senp1 determinação cinética protease

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversíveis modificações pós-tradução de proteínas com proteínas ubiquitina ou ubiquitina-like (Ubls) são amplamente usados ​​para regular a actividade da proteína de forma dinâmica e têm diversos papéis em diversos processos biológicos. Por exemplo, SUMO covalentemente modifica um grande número de proteínas ou com papéis importantes em muitos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, sobrevivência e morte celular, resposta a danos no ADN, e resposta ao estresse 1-5. SENP, como SUMO-protease específico, funciona como uma endopeptidase na maturação dos precursores SUMO ou como uma isopeptidase para remover SUMO de proteínas-alvo e refrescar o ciclo SUMOilação 1,3,6,7. A eficiência catalítica ou especificidade de uma enzima é melhor caracterizada por a razão entre as constantes cinéticas, k cat / K M. Em diversos estudos, os parâmetros cinéticos da SUMO-SENP pares foram determinadas por vários métodos, incluindo em gel de poliacrilamida-based western-blot, radIOActive marcado com composto de substrato, fluorescente ou proteína marcada substrato 8-13. No entanto, as técnicas de gel de poliacrilamida-base, que utilizaram os &quot;nativos&quot; proteínas, mas são trabalhosos e tecnicamente exigente, que não se prestam facilmente à análise quantitativa detalhada. A obtido k cat / K M a partir de estudos que utilizam tetrapéptidos ou proteínas com um ACC (ácido 7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo ou eram até duas ordens de grandeza mais baixa do que os substratos naturais ou não pode diferenciar claramente as iso-endopeptidase e atividades de SENPs. Os ensaios de protease recentemente, FRET base foram utilizados para estudar as enzimas deubiquitinating (Dubs) ou SENPs com o par FRET de proteína fluorescente ciano (PCP) e proteína fluorescente amarela (YFP) 9,10,14,15. A proporção de emissão de aceitador para emissão de dador foi utilizado como parâmetro quantitativo para FRET monitor de sinal para a protease acdade determinação. No entanto, este método ignorado sinal contaminações cruzadas, no comprimento de onda de emissão de aceitador e dador de aceitador e dador de auto-fluorescência e, portanto, não era correcto. Desenvolveu-se um novo ensaio altamente sensível e quantitativo da protease FRET com base para a determinação dos parâmetros cinéticos de uma pré-maturação por SUMO1 SENP1. Um par de engenharia FRET CyPet e YPet melhorou significativamente a eficiência com FRET e rendimento quântico de fluorescência, foram utilizadas para gerar o CyPet (pré-SUMO1)-substrato YPet 16. Nós diferenciados e quantificados absolutos sinais de fluorescência contribuídos pelo dador e aceitador FRET e nos comprimentos de onda de emissão e de aceitador, respectivamente. O valor de k cat / K M foi obtido como (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 de SENP1 para pré-SUMO1, o que está de acordo com os parâmetros cinéticos enzimáticos gerais. Assim, este método é válido e pode ser utilizado umsa geral aproximar para caracterizar outras proteases bem.

Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; E<em&gt; K<sub&gt; Gato</sub</em&gt; Foram obtidos por hidrólise do domínio catalítico de SENP1 (SUMO / Sentrin protease específica 1) para pré-SUMO1 (modificador ubiquitina-like Pequeno). Os princípios gerais deste estudo cinético quantitativo-FRET baseada protease pode ser aplicado a outras proteases.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

Modificações pós-traducionais reversíveis de proteínas com ubiquitina ou proteínas semelhantes à ubiquitina (Ubls) são amplamente utilizadas para regular dinamicamente a proteína...

Este vídeo demonstra um novo ensaio de fret em um único passo para análise quantitativa da cinética de proteases. A estratégia geral para o ensaio a seguir baseia-se na análise do sinal de fret. Aqui, o par de fret, CYPE e YPE, está ligado às extremidades N e C do pré-SUMO um no substrato intacto e CYPE e YPE estão em proximidade fechada.Quando esta molécula é excitada em 414 nanômetros, a maior parte do sinal de emissão está em 530 nanômetros. No entanto, quando a protease SENP1 é adicionada, o substrato é clivado no resíduo Gly-Gly na extremidade C-terminal da SUMO1, separando CIPA e wpa. Agora, quando excitado em 414 nanômetros, a maior parte do signal de emissão observado está em 475 nanômetros.Para avaliar a cinética dessa reação, as emissões de fluorescência são determinadas a cada 15 segundos durante um período de cinco minutos. A análise dos dados de fluorescência resultantes revela a taxa na qual o substrato cype pre sumo one ype é digerido pela protease SENP one. A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como um ensaio de massa com substrato peptídico fluorescente ou análise radiométrica ou western blot, é que esta técnica pode determinar o

quantitative-fret-frster-resonance-energy-transfer-analysis-for-senp1

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Bioengenharia

Este vídeo descreve a transferência de energia de ressonância de Förster resolvida no tempo ou ensaio TR-FRET para determinar a fosforilação de proteínas endógenas com a ajuda de fluoróforos doadores e aceptores marcados em anticorpos específicos para uma proteína de teste. Esta técnica é projetada para medir a fosforilação de proteínas de teste em lisados celulares.

Transferência de energia de ressonância de Forster resolvida no tempo para monitorar a fosforilação de proteínas em células

Descrevemos aqui um método melhorado de transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) onde é considerado um local de clivagem da protease entre os locais fluoróforo doador e receptor. Esta modificação permite a obtenção de sinais lRet específicas decorrentes de proteínas de membrana de interesse, permitindo o estudo de proteínas de membrana, sem purificação de proteínas.

Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

Interações da proteína-proteína são essenciais para sistemas biológicos, e estudos sobre a cinética de ligação fornecem insights sobre a dinâmica e a função dos complexos da proteína. Nós descrevemos um método que quantifica os parâmetros cinéticos de uma proteína complexa usando transferência de energia de ressonância de fluorescência e a técnica de fluxo parou.

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

A Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre duas moléculas de fluoróforo pode ser usada para estudar as interações proteicas na célula viva. Aqui, um protocolo é fornecido sobre como medir o FRET em células vivas, detectando a emissão sensibilizada do aceptor e a têmpera da molécula doadora usando microscopia confocal de varredura a laser.

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

O estudo detalha a metodologia do mapeamento da FRET, incluindo a seleção de sites de rotulagem, escolha de corantes, aquisição e análise de dados. Essa metodologia é eficaz na determinação de locais de ligação, alterações conformais e movimentos dinâmicos em sistemas proteicos e é mais útil se realizada em conjunto com as informações estruturais 3D existentes.

Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

A espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons oferece um acesso não destrutivo e livre de rótulos à dinâmica ps-ns de proteínas e sua água de hidratação. O fluxo de trabalho é apresentado com dois estudos sobre proteínas amiloides: sobre a dinâmica resolvida no tempo da lisozima durante a agregação e sobre a dinâmica da água de hidratação da tau após a formação de fibras.

Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

Este estudo apresenta um ensaio FRET raciométrico simples e fácil de usar para a detecção e avaliação quantitativa da atividade da DNase e demonstra sua aplicação na análise de uma nuclease fraca.

Avaliação da atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica

Micropadrões adesivo que normalize arquitetura celular pode ser usado para aumentar a sensibilidade na detecção de efeitos de drogas, melhorar a reprodutibilidade e simplificar a aquisição de imagem e análise automatizada. Essa tecnologia irá beneficiar os ensaios de drogas / siRNA triagem, realizada em apoia a cultura convencional de células e, conseqüentemente, sofrendo de variabilidade célula a célula-excessiva.

Visualização melhorada e Análise Quantitativa dos Efeitos de Drogas Usando Células micropatterned

Aprenda a realizar análise quantitativa FRET para determinar parâmetros cinéticos da protease SENP1 usando pre-SUMO1 marcado. Este método permite medir KM e kcat em tempo real com alta precisão.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

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