Name: Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Aprenda a realizar análise quantitativa FRET para determinar parâmetros cinéticos da protease SENP1 usando pre-SUMO1 marcado. Este método permite medir KM e kcat em tempo real com alta precisão.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Estamos muito gratos a Victor GJ Rodgers para o conselho valioso. Agradecemos a todos os membros do grupo de Liao de muito perto o trabalho colaborativo e para ajudar com este estudo. Este estudo foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (Grant AI076504 a JL).

1. Construções de plasmídeos <ol><li> Amplificar os quadros de leitura abertos de genes por PCR, e clonar os produtos de PCR em pCRII-TOPO vector. </li><li> Confirmar os produtos de sequenciação e clonagem do cDNA que codifica CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e domínios catalíticos de SENP1 para o vector pET28 (b) com um etiqueta de hexa-histidina N-terminal. </li></ol> 2. Protein Expression and Purification <ol><li> Transformar células de Escherichia coli da estirpe BL21 (DE3) com pET28 (b) vectores que codificam CyPet (pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet e os domínios catalíticos de SENP1. </li><li> Cultivadas as bactérias transformadas em meio 2xYT durante 3 horas a 37 ° C (com agitação a 250 rpm) para atingir uma densidade óptica de 0,5 a 600 nm. </li><li> Adicione 100 ^ M isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) (concentração final) para induzir a expressão da proteína e agitar durante 16 horas a 25 ° C a 200 rpm. </li><li> Colheita das bactérias por centrifugção a 10.000 rpm a 4 ° C durante 5 min e ressuspender os em um tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM e 5 mM de imidazole. </li><li> Sonicar as células durante 10 minutos em intervalos de 5 s com um ajuste de potência de 25 W, utilizando MiSonics sonicador 4000 e recolhê-las por meio de centrifugação a 35.000 xg, a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Defina-se a coluna com 500 ml de pérolas de Ni-NTA de uma cultura de L e transferir o sobrenadante para a coluna. </li><li> Lava-se a resina com tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, imidazol 10 mM e duas vezes. </li><li> Proteína elui-se com tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, e 500 mM de imidazole e diálise num tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM e 1 mM de ditiotreitol (DTT) a 4 ° C durante a noite. </li><li> Determinar as concentrações das proteínas purificadas pelo ensaio de Bradford. Método alternativo para a medição da concentração de proteína será SDS-PAGE electroforese em gel e, em seguida, coradas com azul de Coomassie seguido de imagiologiaquantitativo. </li></ol> 3. Quantitativa FRET Análise de Espectro <ol><li> A estratégia geral para o ensaio foi baseado em FRET de sinalização (Figura 1). O par FRET, CyPet e YPet, foi etiquetada com o N-e C-terminais, respectivamente, da pré-SUMO1. SENP1 cliva a proteína de fusão CyPet (pré-SUMO1) YPet-no local Gly-Gly, em SUMO1 do C-terminal e, deste modo, liberta a cauda SUMO com YPet. O sinal FRET é interrompido, resultando num aumento da emissão de CyPet e uma diminuição dramática das emissões de YPet no comprimento de onda de excitação CyPet. </li><li> Quando excitado por luz de comprimento de onda de 414 nm, a emissão total de fluorescência de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a 530 nm pode ser obtido a partir de três fontes: emissões absoluto FRET induzida YPet, a CyPet directo emissão e YPet directa de emissão (figura 2). </li></ol><img alt="Equação 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> onde FL 530/414 &lt;/ Sub&gt; é o total de emissões de fluorescência a 530 nm quando excitado a 414 nm, FL FRET é o absoluto FRET sinal, FL CyPet (cont) é a emissão direta CyPet quando excitado a 414 nm, e FL YPet (cont) é o YPet dirigir emissão quando excitado a 414 nm. O índice de (cont) representa contribuição. <ol start="3"><li> A emissão directa de CyPet a 530 nm foi proporcional à sua emissão a 475 nm quando excitado a 414 nm, com uma proporção constante de α. CyPet-SUMO1 foi preparada em concentrações de 50, 100, 200, 500, e 750 nM e 1 mM , e as emissões de 475 e 530 nm foi medida após a excitação a 414 nm para determinar α (Figura 3-1). </li><li> A emissão directa de YPet a 530 nm sob excitação em 414 nm foi proporcional à sua emissão a 530 nm quando excitado a 475 nm, com uma proporção constante de β. YPet foi preparada em concentrações de 50, 100, 200, 500, 750 And 1000 nM, e a emissão a 530 nm foi medida em que as amostras foram excitados por comprimentos de onda de 414 e 475 nm para determinar β (Figura 3-2). </li><li> Quando CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi digerido por SENP1, a clivagem libertado CyPet-SUMO1 ea cauda SUMO1 com YPet. Quando o composto foi excitada a 414 nm, a emissão de fluorescência a 530 nm (FL &#39;530/414) foi reduzida, mas ainda podem ser divididas em três partes como: </li></ol><img alt="Equação 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> onde FL &#39;530/414 é a emissão total de fluorescência a 530 nm após a digestão, quando excitado a 414 nm, FL&#39; FRET é o restante sinal FRET absoluto, CyPet FL &#39;(475/414) é a emissão a 475 nm CyPet após a digestão quando excitada a 414 nm (a emissão CyPet aqui é a partir de duas partes: CyPet não digerido (pré-SUMO1)-YPet e digerido CyPet-SUMO1) e FL YPet(530/475) é a emissão YPet quando excitado a 475 nm, que é constante se CyPet (pré-SUMO1)-YPet é digerido ou não. <ol start="6"><li> Após a digestão por SENP1, o restante FRET emissão (FL &#39;FRET) é a seguinte: </li></ol><img alt="Equação 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> em que C é a concentração total de CyPet (pré-SUMO1)-YPet e x é a concentração de digerido CyPet (pré-SUMO1)-YPet. <ol start="7"><li> Através da combinação de todos os elementos, a emissão de fluorescência detectada a 530 nm sob excitação de 414 nm (530 FL &#39;/ 414) é o seguinte: </li></ol><img alt="Equação 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. FRET baseada Protease Assay para Estudo Cinético Enzyme <ol><li> CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi incubada com o domínio catalítico de SENP1 a 37 ° C num tampão de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM, 0,1% (v /v) de Tween-20 e 1 mM de DTT a um volume total de 80 ml e transferidas para placas de 384 poços. </li><li> Ensaios foram realizados através da medição da emissão de fluorescência a 475 e 530 nm, após uma excitação a 414 nm num leitor de fluorescência de placas com múltiplas cavidades, durante 5 min com intervalos de 15 seg. </li><li> A velocidade da reacção (v) foi correlacionado com a alteração da quantidade de substrato (S), como: </li></ol><img alt="Equação 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> A concentração do produto aumentou exponencialmente a partir de 0, tal como [S] 0 (concentração de substrato original) quando t = 0: </li></ol><img alt="Equação 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> Quando t = 0, a velocidade inicial (V 0) é a seguinte: </li></ol><img alt="Equação 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> O concentration de SENP1 foi fixado, e a concentração de CyPet (pré-SUMO1)-YPet foi aumentada de 100 vezes mais do que a concentração de enzima, o que é exigido por equação de Michaelis-Menten. </li><li> Todas as leituras de fluorescência foram analisados ​​pelo método de análise quantitativa FRET e representado no GraphPad Software Prism V para ajustar a equação de Michaelis Menten. A análise de regressão não-linear também pode ser realizada com o auxílio de pacotes de software mais comuns, tais como programas de folha de cálculo (tais como o Microsoft Excel). </li></ol> 5. Resultados representativos Maturação de pré-SUMO1 por SENP1 pode ser determinada por monitorização das alterações do sinal de fluorescência a 475 e 530 nm durante o processo. O resultado mostrou que a velocidade de pré-SUMO1 digestão por SENP1 de um modo de substrato dependente da dose (Figura 4). Isto sugere que o domínio catalítico de SENP1 exibe uma actividade excelente para a maturação de pré-SUMO1. A reação inicialção velocidades foram calculadas através da análise acima, com diferentes concentrações de substrato (Tabela 1). O k cat / K M é geralmente usado para comparar a eficiência de enzimas diferentes com um substrato de uma enzima específica ou com diferentes substratos. K M e V max pode ser obtido a partir da equação de Michaelis-Menten, traçando as velocidades iniciais diferentes, correspondentes para as diferentes concentrações de CyPet (pré-SUMO1)-YPet (Figura 5) k cat foi obtido como.: <img alt="Equação 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> De acordo com a análise acima, o K calculado M foi de 0,21 ± 0,04 mM, o gato k foi 6,90 ± 0,28 s -1, e razão k cat / K M foi de (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> Figura 1. Gráfico de FRET ensaio baseado em protease para a maturação de pré-SENP sumos. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> Figura 2. Análise quantitativa de sinal fluorescente como contribuições pelo dador-aceitador e FRET. Dissecação de espectros de emissão a partir de CyPet (pré-SUMO1) YPet sob excitação a 414 nm. CyPet FL (530/414) é emissão CyPet de a 530 nm, com excitação de 414 nm, FL FRET é a FRET induzida emissão YPet a 530 nm sob excitação de 414 nm, e FL YPet (530/414) é a emissão YPet de a 530 nm, com excitação de 414 nm. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Cálculo de direção α fator de emissão e β. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> Figura 4. Análise quantitativa de CyPet (pré-SUMO1) YPet digerido por razões diferentes do domínio catalítico de SENP1. As reações foram monitoradas dentro primeiros 5 min. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> Figura 5. Michaelis-Menten análise gráfica de digestão CyPet (pré-SUMO1)-YPet do por SENP1. Os dados foram traçados e analisados ​​por GraphPad Prism V e de regressão não-linear. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (uM) </td><td> V 0 (^ M / s) </td></tr><tr><td> 0,115 </td><td> 0,0023 ± 0,00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0,214 </td><td> 0,0028 ± 0,00004 </td></tr><tr><td> 0,407 </td><td> 0,0033 ± 0,00007 </td></tr><tr><td> 0,594 </td><td> 0,0037 ± 0,00013 </td></tr><tr><td> 0,725 </td><td> 0,0043 ± 0,00012 </td></tr><tr><td> 1,471 </td><td> 0,0051 ± 0,00036 </td></tr><tr><td> 1,899 </td><td> 0,0050 ± 0,00031 </td></tr><tr><td> 2,300 </td><td> 0,0050 ± 0,00062 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Determinação velocidades iniciais de maturação de pré-SUMO1 por SENP1. Em cada concentração de substrato, quatro amostras foram utilizadas para medir a digestão. O desvio padrão foi de variações destas quatro amostras. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (| iM) </td><td> k cat (s-1) </td><td> k cat / K m (M -1 • s-1) </td></tr><tr><td> 0,21 ± 0,04 </td><td> 6,90 ± 0,28 </td><td> 3,2 ± 0,55 x 10 7 </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Parâmetros cinéticos de maturação de pré-SUMO1 por SENP1 por análise quantitativa FRET. O desvio padrão foi de quatro amostras de cada concentração de substrato.

<ol><li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+modification+By+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li>
<li>Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%2C+ubiquitin%27s+mysterious+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li>
<li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SP-RING+for+SUMO%3A+new+functions+bloom+for+a+ubiquitin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SP-RING for SUMO: new functions bloom for a ubiquitin-like protein.</a> Cell. , 5-8 (2001).</li>
<li>Drag, M., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeSUMOylating+enzymes-SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">DeSUMOylating enzymes-SENPs.</a> IUBMB Life. 60, 734-742 (2008).</li>
<li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+in+reverse%3A+the+SUMO+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li>
<li>Reverter, D., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+SENP2+protease+interactions+with+SUMO+precursors+and+conjugated+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for SENP2 protease interactions with SUMO precursors and conjugated substrates.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1060-1068 (2006).</li>
<li>Shen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+protease+SENP1+induces+isomerization+of+the+scissile+peptide+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">SUMO protease SENP1 induces isomerization of the scissile peptide bond.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 13, 1069-1077 (2006).</li>
<li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
<li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li>
<li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+%28SENPs%29+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461(2008).</li>
<li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li>
<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

FRET tecnologia tem sido utilizada para estudar a maturação de pré-SUMO1 por SENP1 9. CFP-YFP foi utilizado como o par de FRET e análise raciométrica, que é a relação entre as emissões de aceitador de doadores, foi utilizada para caracterizar as propriedades cinéticas. No entanto, não há qualquer consideração de dador e aceitador de auto-fluorescência na raciométrica tradicional FRET análise. A relação não é directamente correlacionada com a quantidade de substrato digerido. Relat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PCR II Kit TOPO </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Pesquisa de Produtos Internationa.l Corp </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA Agrose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie plus (Bradford) Regent Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> 384-bem placa (fundo de vidro) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 leitor de placas </td><td> Dispositivo Molecular </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitativa fret (förster resonance energy transfer) análise para senp1 determinação cinética protease

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Reversíveis modificações pós-tradução de proteínas com proteínas ubiquitina ou ubiquitina-like (Ubls) são amplamente usados ​​para regular a actividade da proteína de forma dinâmica e têm diversos papéis em diversos processos biológicos. Por exemplo, SUMO covalentemente modifica um grande número de proteínas ou com papéis importantes em muitos processos celulares, incluindo a regulação do ciclo celular, sobrevivência e morte celular, resposta a danos no ADN, e resposta ao estresse 1-5. SENP, como SUMO-protease específico, funciona como uma endopeptidase na maturação dos precursores SUMO ou como uma isopeptidase para remover SUMO de proteínas-alvo e refrescar o ciclo SUMOilação 1,3,6,7. A eficiência catalítica ou especificidade de uma enzima é melhor caracterizada por a razão entre as constantes cinéticas, k cat / K M. Em diversos estudos, os parâmetros cinéticos da SUMO-SENP pares foram determinadas por vários métodos, incluindo em gel de poliacrilamida-based western-blot, radIOActive marcado com composto de substrato, fluorescente ou proteína marcada substrato 8-13. No entanto, as técnicas de gel de poliacrilamida-base, que utilizaram os &quot;nativos&quot; proteínas, mas são trabalhosos e tecnicamente exigente, que não se prestam facilmente à análise quantitativa detalhada. A obtido k cat / K M a partir de estudos que utilizam tetrapéptidos ou proteínas com um ACC (ácido 7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo ou eram até duas ordens de grandeza mais baixa do que os substratos naturais ou não pode diferenciar claramente as iso-endopeptidase e atividades de SENPs. Os ensaios de protease recentemente, FRET base foram utilizados para estudar as enzimas deubiquitinating (Dubs) ou SENPs com o par FRET de proteína fluorescente ciano (PCP) e proteína fluorescente amarela (YFP) 9,10,14,15. A proporção de emissão de aceitador para emissão de dador foi utilizado como parâmetro quantitativo para FRET monitor de sinal para a protease acdade determinação. No entanto, este método ignorado sinal contaminações cruzadas, no comprimento de onda de emissão de aceitador e dador de aceitador e dador de auto-fluorescência e, portanto, não era correcto. Desenvolveu-se um novo ensaio altamente sensível e quantitativo da protease FRET com base para a determinação dos parâmetros cinéticos de uma pré-maturação por SUMO1 SENP1. Um par de engenharia FRET CyPet e YPet melhorou significativamente a eficiência com FRET e rendimento quântico de fluorescência, foram utilizadas para gerar o CyPet (pré-SUMO1)-substrato YPet 16. Nós diferenciados e quantificados absolutos sinais de fluorescência contribuídos pelo dador e aceitador FRET e nos comprimentos de onda de emissão e de aceitador, respectivamente. O valor de k cat / K M foi obtido como (3,2 ± 0,55) x10 7 M -1 s -1 de SENP1 para pré-SUMO1, o que está de acordo com os parâmetros cinéticos enzimáticos gerais. Assim, este método é válido e pode ser utilizado umsa geral aproximar para caracterizar outras proteases bem.

Um novo método que envolve a análise quantitativa de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) sinais é descrito para o estudo de cinética enzimática.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; E<em&gt; K<sub&gt; Gato</sub</em&gt; Foram obtidos por hidrólise do domínio catalítico de SENP1 (SUMO / Sentrin protease específica 1) para pré-SUMO1 (modificador ubiquitina-like Pequeno). Os princípios gerais deste estudo cinético quantitativo-FRET baseada protease pode ser aplicado a outras proteases.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

Modificações pós-traducionais reversíveis de proteínas com ubiquitina ou proteínas semelhantes à ubiquitina (Ubls) são amplamente utilizadas para regular dinamicamente a proteína...

Este vídeo demonstra um novo ensaio de fret em um único passo para análise quantitativa da cinética de proteases. A estratégia geral para o ensaio a seguir baseia-se na análise do sinal de fret. Aqui, o par de fret, CYPE e YPE, está ligado às extremidades N e C do pré-SUMO um no substrato intacto e CYPE e YPE estão em proximidade fechada.Quando esta molécula é excitada em 414 nanômetros, a maior parte do sinal de emissão está em 530 nanômetros. No entanto, quando a protease SENP1 é adicionada, o substrato é clivado no resíduo Gly-Gly na extremidade C-terminal da SUMO1, separando CIPA e wpa. Agora, quando excitado em 414 nanômetros, a maior parte do signal de emissão observado está em 475 nanômetros.Para avaliar a cinética dessa reação, as emissões de fluorescência são determinadas a cada 15 segundos durante um período de cinco minutos. A análise dos dados de fluorescência resultantes revela a taxa na qual o substrato cype pre sumo one ype é digerido pela protease SENP one. A principal vantagem dessa técnica em comparação com métodos existentes, como um ensaio de massa com substrato peptídico fluorescente ou análise radiométrica ou western blot, é que esta técnica pode determinar o parâmetro cinético em tempo real em um único ensaio em etapa única e em tempo real.As implicações dessa técnica estendem-se ao tratamento e ao diagnóstico de doenças envolvendo proteínas, tais como cânceres e doenças metabólicas. Porque esta técnica pode fornecer ensaios precisos e de alto rendimento para diversos alvos proteicos, bem como para a descoberta de seus inibidores e caracterizações, o procedimento ilustrativo da doença será realizado por um estudante de doutorado da minha equipe, que foi a primeira pessoa a desenvolver este método e procedimento. Inicie este procedimento amplificando, por PCR, os quadros de leitura aberta das proteínas Cype ype pre sumo um, sumo um madura e o domínio catalítico da SENP um.Clone os produtos resultantes no vetor topo PCR dois. Em seguida, confirme que as sequências dos genes estão corretas por meio de sequenciamento. Depois, clone o CD NA que codifica CYPE pre sumo um ype cype sumo, um ype e o domínio catalítico de SENP um no vetor PET 28 B com uma etiqueta Polyhis no terminal N.Após os genes terem sido clonados no vetor, transforme-os em Esia coli, BBL 21 DE três por eletroporação. Após o plaqueamento das bactérias transformadas em meio sólido, escolha colônias isoladas e cultive-as durante a noite. Em seguida, inocule frascos de dois litros de meio dois XYT com as bactérias transformadas na proporção de um para 100.Incube as culturas por três horas a 37 graus Celsius, sob agitação a 250 RPM, até atingir uma densidade óptica de 0,5 a 600 nanômetros. Para induzir a expressão proteica, adicione IPTG até uma concentração final de 100 micromolar e agite por 16 horas a 25 graus Celsius a 200 RPM. Em seguida, transfira as bactérias para frascos de centrífuga de 250 mililitros.Em seguida, recolha as bactérias por centrifugação a 8.000 G a quatro graus Celsius durante cinco minutos. Após a centrifugação, descarte o sobrenadante e re-suspenda as células bacterianas em um tampão de lise contendo tris HCl, cloreto de sódio e ole, transferindo as culturas para tubos c&ocirc;nicos de 50 mililitros. Em seguida, sonique as células com uma amplitude de 70 durante 10 minutos, com intervalos de cinco segundos, para romper as células bacterianas.Em seguida, para separar as proteínas de fusão dos detritos celulares, centrifugue os tubos a 35.000 RCF a quatro graus Celsius por 30 minutos. Durante a centrifugação, prepare uma coluna BioRad de 10 mililitros com 500 microlitros de esferas de níquel NTI para cada litro de células cultivadas. Deixe a solução gotejar pela coluna após a centrifugação.Transfira o sobrenatante para um novo tubo cônico de 50 mililitros. Despeje a solução do sobrenatante na coluna. Após todo o sobrenatante ter penetrado na resina, lave a coluna duas vezes com 10 mililitros de um tampão de cloreto de sódio tris-hidroclorídrico.Para eluir. Adicione 500 microlitros do mesmo tampão, desta vez contendo 500 milimolares de ole. Colete o fluxo passante em um tubo de microcentrífuga.Em seguida, transfira a solução para um tubo de diálise com corte molecular de 10 kilodaltons e realize a diálise da amostra durante a noite em um litro de tampão contendo tris 20 milimolar, HCl 50 milimolar, cloreto de sódio e DTT 1 milimolar, a quatro graus Celsius. Após a diálise, transfira as proteínas purificadas para um tubo de microcentrífuga e determine as concentrações das proteínas purificadas por ensaio de Bradford. Em seguida, as proteínas purificadas são utilizadas para avaliar a taxa na qual o pré-SUMO1 é clivado pelo SENP1, utilizando um ensaio FRET quantitativo.Em tubos de microcentrífuga, prepare 60 mililitros de Spet Sumo um e YA em concentrações de 5100, 200, 500, 750 e 1000 nanomolar. Essas amostras controle serão usadas para caracterizar a razão constante da emissão direta de cype e YA no mesmo tampão. Prepare cype pré-sumo um y PET em 12 concentrações variando de 0,03 micromolar a 0,9 micromolar e uma diluição de 0,3 nanomolar do domínio catalítico de SENP um.Configure o leitor de placas multipoços com fluorescência para medir a emissão fluorescente em 475 e 530 nanômetros após uma excitação em 414 nanômetros e emissão em 530 nanômetros após uma excitação em 475 nanômetros, com intervalos de 32 segundos durante dois minutos a 37 graus Celsius. Para obter a autofluorescência da placa, coloque uma placa de 384 poços vazia no fluorímetro e realize as medições. Uma vez determinada a autofluorescência da placa, ajuste as configurações do fluorímetro de modo que, para Cype Sumo, uma excitação será em 414 nanômetros e as medições serão feitas em 475 nanômetros e 530 nanômetros; para ype, a excitação será em 414 nanômetros e 475 nanômetros, e as medições serão feitas em 530 nanômetros.Em seguida, adicione 75 microlitros de cype Sumo um ype ou cype sumo um ype aos poços apropriados da placa de 384 poços em triplicata, conforme mostrado neste diagrama. Em seguida, adicione cinco microlitros da SENP um preparada a cada poço, atingindo um volume final de 80 microlitros; coloque imediatamente a placa no fluorímetro e inicie as medições de fluorescência após a execução. Analise as leituras de fluorescência utilizando o método quantitativo de análise FRET demonstrado na próxima seção.A ideia geral desta tecnologia é correlacionar o sinal absoluto de transferência com a digestão. Deseja obter o sinal absoluto de transferência? Precisamos excluir as contribuições diretas do doador e do aceptor da emissão fluorescente total nos comprimentos de onda de emissão do aceptor.As contribuições diretas do doador e do aceptor são calculadas a partir dos fatores de coeficiente de correlação alfa e beta do doador e dos aceitores, respectivamente. Nesta seção do vídeo, será detalhado como os cálculos são realizados. Para analisar a cinética da digestão do substrato pela SENP1, utilize o software GraphPad Prism 5; comece abrindo o arquivo txt exportado no Excel após subtrair a fluorescência de fundo da placa.A concentração do substrato digerido em diferentes pontos de tempo é calculada pelas formulações do PrepU quando excitadas por luz de comprimento de onda de 414 nanômetros; a emissão total de fluorescência do spet pre sumo one ype em 530 nanômetros pode ser derivada de três fontes: a emissão absoluta de Y pets induzida por FRET, a emissão direta de cype e a emissão direta de wpe. Nesta equação, FL 530/414 é a emissão total de fluorescência em 530 nanômetros quando excitada a 414 nanômetros, e FL fret é o sinal absoluto de FRET.FL Spet Con é a emissão direta de Spet. Quando excitado a 414 nanômetros e FL Ype Con é a emissão direta de Ype. Quando excitado a 414 nanômetros, a emissão direta de spet a 530 nanômetros é proporcional à sua emissão a 475 nanômetros.Quando excitado a 414 nanômetros com uma proporção constante de alfa, a emissão direta de YA a 530 nanômetros sob excitação a 414 nanômetros é proporcional à sua emissão a 530 nanômetros. Quando excitado a 475 nanômetros com uma proporção constante de beta, quando o peptídeo sumo um tipo é digerido pela SENP um e excitado a 414 nanômetros, a emissão fluorescente a 530 nanômetros é reduzida, mas ainda pode ser dividida em três partes como aqui.FL Prime cinco 30 sobre quatro 14 é a emissão total de fluorescência em 530 nanômetros após a digestão. Quando excitado em 414, FL Prime fret é o sinal absoluto restante de fret e FL prime SPET 4 75 sobre quatro 14 é a emissão SPET em 475 nanômetros após a digestão quando excitado em 414 nanômetros. A emissão provém de duas partes: cype não digerida, pre sumo, uma ype e cype Sumo uma digerida.Um FL Y PET cinco 30 barra 4 75 é a emissão ype quando excitado a 475 nanômetros, que é constante independentemente de cype pre sumo um ype ser digerido ou não após a digestão por SENP um. A emissão fret remanescente é mostrada nesta equação, onde C é a concentração total de cype. Pre sumo um ype, e X é a concentração de cype. Pre sumo um YA. Combinando todos os itens, a emissão de fluorescência detectada a 530 nanômetros sob excitação de 414 nanômetros é mostrada por esta equação para o ensaio de protease baseado em fret para estudo cinético enzimático, sendo a taxa de reação correlacionada com a alteração na quantidade de substrato à medida que a concentração do produto aumenta exponencialmente a partir de zero.Quando T é igual a zero, como visto aqui, S subzero indica a concentração inicial do substrato quando T é igual a zero. A velocidade inicial é a maturação da pré-sumo. Um por SENP.Pode-se determinar monitorando as alterações no sinal fluorescente em 475 e 530 nanômetros durante o processo. Como mostrado aqui, a velocidade da maturação da pré-sumo um foi dependente da dose do substrato, o que sugere que o domínio catalítico da SENP um apresenta excelente atividade para a maturação da pré-sumo um. As velocidades iniciais das reações foram calculadas utilizando a mesma análise com diferentes concentrações de substrato.A razão entre KCAT e KM é geralmente utilizada para comparar as eficiências de diferentes enzimas com um único substrato ou de uma enzima específica com diferentes substratos. KM e Vmax podem ser obtidos a partir da equação de McKayla Cementin, traçando as diversas velocidades iniciais correspondentes às diferentes concentrações de cype. Presume-se que o valor de kcat foi obtido utilizando esta equação.De acordo com a análise acima, a KM calculada foi de 0,21 mais ou menos 0,4 micromolar. A kcat foi de 6,90 mais ou menos 0,28 por segundo, e a razão kcat/KM foi de 3,2 mais ou menos 0,55 vezes 10 à sétima por molar. Segundo, após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como determinar o parâmetro de conexão da protease utilizando um novo ensaio quantitativo de gordura em uma única etapa de medição em tempo real seguindo este procedimento.Outro método, como a inibição do produto ou a caracterização de inibidores, pode ser realizado para responder perguntas adicionais, como a KM aparente real ou a constante de inibidor K. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de proteínas explorarem a genética precisa e a compreensão das proteínas envolvidas nos processos fisiológicos e patológicos em sensores ópticos. Diagnóstico imediato e descoberta de fármacos.

quantitative-fret-frster-resonance-energy-transfer-analysis-for-senp1

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Este vídeo descreve a transferência de energia de ressonância de Förster resolvida no tempo ou ensaio TR-FRET para determinar a fosforilação de proteínas endógenas com a ajuda de fluoróforos doadores e aceptores marcados em anticorpos específicos para uma proteína de teste. Esta técnica é projetada para medir a fosforilação de proteínas de teste em lisados celulares.

Transferência de energia de ressonância de Forster resolvida no tempo para monitorar a fosforilação de proteínas em células

Descrevemos aqui um método melhorado de transferência de luminescência Ressonância Energia (lRet) onde é considerado um local de clivagem da protease entre os locais fluoróforo doador e receptor. Esta modificação permite a obtenção de sinais lRet específicas decorrentes de proteínas de membrana de interesse, permitindo o estudo de proteínas de membrana, sem purificação de proteínas.

Luminescência Ressonância transferência de energia para estudar mudanças conformacionais na membrana proteínas expressas em células de mamíferos

Vários biossensores de força baseados em FRET foram desenvolvidos recentemente, permitindo a resolução específica da proteína da força intracelular. Neste protocolo, demonstramos como um desses sensores, projetado para o ligante da proteína do complexo nucleoesqueleto-citoesqueleto (LINC) Nesprin-2G, pode ser usado para medir as forças de actomiosina no complexo nuclear LINC.

Um protocolo para usar a transferência de Förster Ressonância Energia (FRET) Biossensores -force medir forças mecânicas em todo o Complexo LINC Nuclear

Um protocolo para experiências FRET de alta precisão no nível de molécula única é apresentado aqui. Adicionalmente, esta metodologia pode ser utilizada para identificar três estados conformacionais no domínio de ligação ao ligando do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar distâncias precisas é o primeiro passo para construir modelos estruturais baseados em experimentos FRET.

FRET de alta precisão em nível de molécula única para determinação de estrutura de biomoléculas

Interações da proteína-proteína são essenciais para sistemas biológicos, e estudos sobre a cinética de ligação fornecem insights sobre a dinâmica e a função dos complexos da proteína. Nós descrevemos um método que quantifica os parâmetros cinéticos de uma proteína complexa usando transferência de energia de ressonância de fluorescência e a técnica de fluxo parou.

Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Os protocolos aqui descritos fornecem um guia para visualizar e quantificar a atividade de proteases neutrófilos na escarro humana. As aplicações dessa análise abrangem desde a avaliação de tratamentos anti-inflamatórios, até validação de biomarcadores, triagem de medicamentos e grandes estudos clínicos de coorte.

Monitoramento de Elastase e Cathepsin G Atividade em Amostras de Espiuma Humana

A Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) entre duas moléculas de fluoróforo pode ser usada para estudar as interações proteicas na célula viva. Aqui, um protocolo é fornecido sobre como medir o FRET em células vivas, detectando a emissão sensibilizada do aceptor e a têmpera da molécula doadora usando microscopia confocal de varredura a laser.

Avaliando interações proteicas em células vivas com emissão sensibilizada por FRET

O estudo detalha a metodologia do mapeamento da FRET, incluindo a seleção de sites de rotulagem, escolha de corantes, aquisição e análise de dados. Essa metodologia é eficaz na determinação de locais de ligação, alterações conformais e movimentos dinâmicos em sistemas proteicos e é mais útil se realizada em conjunto com as informações estruturais 3D existentes.

Mapeamento da transferência de energia de ressonância förster: uma nova metodologia para elucidar características estruturais globais

A espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons oferece um acesso não destrutivo e livre de rótulos à dinâmica ps-ns de proteínas e sua água de hidratação. O fluxo de trabalho é apresentado com dois estudos sobre proteínas amiloides: sobre a dinâmica resolvida no tempo da lisozima durante a agregação e sobre a dinâmica da água de hidratação da tau após a formação de fibras.

Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

Este estudo apresenta um ensaio FRET raciométrico simples e fácil de usar para a detecção e avaliação quantitativa da atividade da DNase e demonstra sua aplicação na análise de uma nuclease fraca.

Avaliação da atividade da DNase por transferência de energia de ressonância de fluorescência raciométrica

Aprenda a realizar análise quantitativa FRET para determinar parâmetros cinéticos da protease SENP1 usando pre-SUMO1 marcado. Este método permite medir KM e kcat em tempo real com alta precisão.

Quantitativa FRET (Förster Resonance Energy Transfer) Análise para SENP1 Determinação Cinética Protease

Explorar mais vídeos