Name: Microgavage de larvas do peixe (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a técnica de microgavagem em larvas de peixe-zebra para administração oral controlada de substâncias no lúmen intestinal. Este método seguro permite estudar transporte intestinal e tecidos extraintestinais com precisão.

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Agradecemos aos membros do laboratório de Rawls pelas sugestões úteis sobre o conteúdo e ao Dr. Alan Fanning pelas valiosas discussões sobre permeabilidade de tamanho e métodos de disruptura das junções íntimas. Agradecemos também ao Dr. Michael Chua e ao Dr. Neal Kramarcy da Michael Hooker Microscopy Facility pelo apoio com o microscópio confocal. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos National Institutes of Health T32 DK007737-15 (bolsista J.L.C.), F32 DK094592 (para J.L.C.) e R01 DK081426 (para J.F.R.).

<ol><li>Kuhlman, J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+mutations+affecting+development+and+function+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system.</a> Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).</li>
<li>Pack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+zebrafish+digestive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of zebrafish digestive organs.</a> Development. 123, 321-328 (1996).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).</li>
<li>Hama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+digestive+organ+function+using+multiple+quenched+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).</li>
<li>Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-content+model+system+for+studies+of+gastrointestinal+transit%3A+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish.</a> Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).</li>
<li>Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+single+lumen+formation+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut.</a> Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).</li>
<li>Bagnat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cse1l+is+a+negative+regulator+of+CFTR-dependent+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion.</a> Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Brugman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone-induced+enterocolitis+in+zebrafish+depends+on+the+composition+of+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota.</a> Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).</li>
<li>Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+intestinal+cancer+models%3A+unraveling+gastrointestinal+homeostasis+and+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 361-376 (2009).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study.</a> Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).</li>
<li>Kanther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+colonization+induces+dynamic+temporal+and+spatial+patterns+of+NF-kappaB+activation+in+the+zebrafish+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract.</a> Gastroenterology. , (2011).</li>
<li>Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+zebrafish+reveal+evolutionarily+conserved+responses+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).</li>
<li>Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+genetic+analysis+link+bacterial+motility+and+symbiosis+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Bates, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+from+the+microbiota+promote+different+aspects+of+zebrafish+gut+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.</a> Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).</li>
<li>Cheesman, S. E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+know+you+are+in+there%3A+conversing+with+the+indigenous+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota.</a> Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).</li>
<li>Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+detoxifies+lipopolysaccharide+and+prevents+inflammation+in+zebrafish+in+response+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota.</a> Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+cis-regulatory+modules+mediate+tissue-specific+and+microbial+control+of+angptl4%2Ffiaf+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription.</a> PLoS Genetics. , In Press (2012).</li>
<li>Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+proliferation+in+the+developing+zebrafish+intestine+is+regulated+by+the+Wnt+pathway+and+microbial+signaling+via+Myd88%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+a+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Van Itallie, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+density+of+small+tight+junction+pores+varies+among+cell+types+and+is+increased+by+expression+of+claudin-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2.</a> J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).</li>
<li>Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+size-dependent+permeability+of+the+tight+junction+using+PEG+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling.</a> Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).</li>
<li>Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+of+tight+junctions+in+intestinal+cell+monolayers+using+polyethylene+glycol+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).</li>
<li>Rodgers, L. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+permeability+by+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+formation+in+cultured+epithelial+cells+%28MDCK%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK).</a> J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).</li>
<li>Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+tight-junction+permeability+and+structure+in+Necturus+gallbladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder.</a> Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).</li>
<li>Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+gut+motility+control+system+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).</li>
<li>Rich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit-like+immunoreactivity+in+the+zebrafish+gastrointestinal+tract+reveals+putative%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative.</a> 236, 903-911 (2007).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+and+TTX-insensitive+control+of+spontaneous+gut+motility+in+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae.</a> J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).</li>
<li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio.</a> J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Clifton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+dietary+lipid+absorption+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish.</a> PLoS One. 5, e12386(2010).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+offer+the+potential+for+a+primary+screen+to+identify+a+wide+variety+of+potential+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants.</a> Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Neste trabalho, descrevemos um novo protocolo para a entrega direta de materiais ao intestino de larvas de peixe-zebra por meio de microsondagem. Existem várias etapas críticas ao longo do procedimento que devem ser levadas em consideração. Primeiramente, as larvas de peixe-zebra devem estar em boas condições de saúde antes do experimento de sondagem, a fim de prevenir mortes não relacionadas ao tratamento. Outro fator importante é a qualidade da agulha de sondagem. Uma das partes mais difíceis do protocolo é cortar a ag...

<table><tbody><tr><td>Finquel (metanosulfonato de tricaina)</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>Anestesia de larvas</td></tr><tr><td>Solução de vermelho de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>0,5% em DPBS, testado para cultura celular</td></tr><tr><td>Óleo mineral, leve, branco (alta pureza)</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>Para reenchimento da agulha e teste de volume</td></tr><tr><td>Dextrano TxRed, peso molecular 10.000, fixável por lisina</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>Suspensão a 1% em PBS 1x/vermelho de fenol</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>Estoque a 5 mM em água</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Diâmetro externo 1,14 mm, diâmetro interno 0,53 mm, comprimento 3,5 polegadas</td></tr><tr><td>Forma plástica para fabricação de moldes</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de microinjeção Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas Flaming Brown, filamento largo de 3,0 mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>Fabricação de agulhas</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #5 para estudantes</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0,1 x 0,06 mm, corte de agulhas</td></tr><tr><td>Retículo ocular, 5 mm - 100 divisões</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>Corte de agulhas</td></tr><tr><td>Microforja</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Corte de agulhas e polimento a fogo</td></tr><tr><td>Agulha para seringa Tuberculin SlipTip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml, agulha 25G 5/8</td></tr><tr><td>Microesferas Fluoresbrite YG (2,0 &amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>Análise da motilidade intestinal</td></tr><tr><td>Microsscópio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>Procedimento de gavagem</td></tr><tr><td>Microsscópio estereoscópico de fluorescência</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>Ensaio de barreira com dextrano</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Imagem do dextrano na circulação</td></tr></tbody></table>

microgavage de larvas do peixe

Microgavage of Zebrafish Larvae

O peixe-zebra emergiu como um organismo modelo poderoso para o estudo do desenvolvimento intestinal1-5, da fisiologia6-11, de doenças12-16 e das interações entre hospedeiro e microrganismos17-25. Abordagens experimentais para o estudo da biologia intestinal frequentemente requerem a introdução in vivo de materiais selecionados na luz do intestino. No modelo de peixe-zebra larval, isso é tipicamente realizado imergindo os peixes em uma solução do material escolhido ou por injeção através da parede abdominal. Utilizando o método de imersão, é difícil monitorar ou controlar com precisão a rota ou o momento da entrega do material ao intestino. Por esse motivo, a exposição por imersão pode causar toxicidade indesejada e outros efeitos em tecidos extraintestinais, limitando a faixa potencial de quantidades de material que podem ser entregues ao intestino. Além disso, a quantidade de material ingerido durante a exposição por imersão pode variar significativamente entre larvas individuais26. Embora esses problemas não ocorram durante a injeção direta através da parede abdominal, a injeção adequada é difícil e causa danos teciduais que poderiam influenciar os resultados experimentais. Apresentamos um método de microsondagem em larvas de peixe-zebra. O objetivo deste método é fornecer uma maneira segura, eficaz e consistente de entregar material diretamente para a luz do intestino anterior em larvas de peixe-zebra com tempo controlado. A microsondagem utiliza equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia comuns na maioria dos laboratórios que realizam pesquisas com peixe-zebra. Uma vez que os peixes são adequadamente posicionados em metilcelulose, a sondagem pode ser realizada rapidamente a uma taxa de aproximadamente 7-10 peixes/min, e a sobrevivência pós-sondagem aproxima-se de 100%, dependendo do material administrado. Também demonstramos que a microsondagem pode permitir o carregamento da luz intestinal com altas concentrações de materiais que são letais para os peixes quando expostos por imersão. Para demonstrar a utilidade deste método, apresentamos um ensaio de microsondagem com dextrano fluorescente que pode ser usado para quantificar o trânsito da luz intestinal para espaços extraintestinais. Esse teste pode ser usado para verificar a execução correta do procedimento de microsondagem e também fornece um ensaio inovador em peixe-zebra para examinar a integridade da barreira epitelial intestinal sob diferentes condições experimentais (por exemplo, manipulação genética, tratamento com fármacos ou exposição a fatores ambientais). Além disso, mostramos como a sondagem pode ser usada para avaliar a motilidade intestinal mediante a administração de microesferas fluorescentes e o monitoramento subsequente de seu trânsito. A microsondagem pode ser aplicada para entregar diversos materiais, tais como microrganismos vivos, fatores microbianos secretados/toxinas, agentes farmacológicos e sondas fisiológicas. Com essas capacidades, o método de microsondagem em larvas de peixe-zebra tem o potencial de aprimorar uma ampla gama de áreas de pesquisa que utilizam o sistema modelo de peixe-zebra.

Quando a gavagem é realizada corretamente, o material administrado deve estar inteiramente contido no intestino anterior, com pouco ou nenhum resíduo no esôfago (Figura 3). Deve-se escolher um volume de administração que possa ser acomodado dentro do bulbo anterior e que não vaze pela cloaca ou pelo esôfago. Se o volume do material ou a pressão de administração forem excessivos, a força física da gavagem poderá causar danos ou vazamento através do epitélio. Também poderá expelir ou alterar outros compone...

Apresentamos um novo método de microgavagem de larvas de peixe-zebra utilizando equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia. Demonstramos que a microgavagem é uma técnica segura e eficiente, útil para administrar quantidades controladas de diversos materiais diretamente na luz intestinal de larvas de peixe-zebra.

Microgavage de larvas do peixe

O peixe-zebra emergiu como um organismo modelo poderoso para o estudo do desenvolvimento intestinal1-5, fisiologia6-11, doenças12-16 e da interação hospedeiro-micróbio...

O objetivo geral deste procedimento é administrar oralmente materiais para a luz intestinal de larvas de peixe-zebra. Primeiro, as larvas são anestesiadas e colocadas em um molde de injeção revestido com metilcelulose. Em seguida, as larvas são suavemente submersas no molde e alinhadas com o ângulo da agulha de gavagem e do micromanipulador.A agulha é então inserida na boca da larva e posicionada no bulbo intestinal. Uma vez no lugar, o material é liberado na luz. O passo final é extrair a larva do metilcelulose e colocá-la em meio fresco para se recuperar da anestesia.Essencialmente, este método pode ser utilizado para entregar materiais especificamente à luz intestinal de larvas de peixe-zebra, onde o transporte dentro do intestino ou em tecidos extra-intestinais pode ser estudado. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a imersão em água contendo o material de interesse, é que a quantidade de material administrado ao animal, bem como o momento e a dosagem, podem ser rigorosamente controlados. Isso reduz a variabilidade experimental e, em alguns casos, a toxicidade associada a certos materiais.Tivemos a ideia inicial deste método quando tivemos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

Fonte: Li, J., et al. Desenvolvimento de um modelo larval de infecção por peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o procedimento de microgavage, no qual uma larva de peixe-zebra anestesiada é imobilizada em agarose e injetada oralmente com uma bactéria patogênica usando uma agulha guiada por traçadores. O parto não invasivo imita infecção natural, permitindo a análise da replicação bacteriana, liberação de toxinas e danos epiteliais intestinais.

Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra usando microgavage

O uso crescente de peixe-zebra como um modelo animal requer o desenvolvimento de métodos eficazes para a entrega de quantidades conhecidas de compostos e soluções. O procedimento de gavagem descrito abaixo permite a distribuição oral de volumes precisos de solução fiável, segura e eficiente de peixe-zebra adultos.

Gavaging Zebrafish Adulto

O peixe-zebra é um excelente sistema modelo para estudos genéticos e de desenvolvimento. O implante de contas é uma técnica valiosa de manipulação de tecidos que pode ser usada para interrogar os mecanismos de desenvolvimento, introduzindo alterações nos ambientes celulares locais. Este protocolo descreve como realizar a implantação de microesferas no embrião de peixe-zebra.

Microbead Implantação no embrião de peixe-zebra

Manipulações direcionadas para causar estresse direcionado ou morte em células individuais têm sido relativamente difíceis de realizar. Aqui, uma abordagem de ablação com resolução de célula única para estressar e matar seletivamente células individuais em cultura de células e animais vivos é descrita com base em um laser UV confocal padrão.

Provocando estresse celular e morte utilizando convencional UV laser microscopia confocal

Aqui, apresentamos um protocolo para isolamento de tecido gonadal dos peixes-zebra larval, o que irá facilitar as investigações de diferenciação sexual peixe-zebra e manutenção.

Dissecção de larval Zebrafish gonadal Tissue

A ablação a laser é uma tecnologia amplamente aplicável para estudar a regeneração em sistemas biológicos. O protocolo apresentado descreve o uso de um microscópio confocal padrão de varredura a laser para ablação a laser e imagens subsequentes de lapso de tempo de células interneuromast regeneradoras na linha lateral do zebrafish.

Ablação e Regeneração a laser baseada em microscópio confocal em células interneuromast baseadas em zebrafish

A clareza óptica é uma grande vantagem para o trabalho biológico e fisiológico celular no peixe-zebra. Métodos robustos para a medição do crescimento celular em animais individuais são descritos que permitem novos insights sobre como o crescimento do músculo esquelético e dos tecidos vizinhos são integrados com o crescimento de todo o corpo.

Medição em tempo real e repetida do crescimento muscular esquelético em peixes-zebra vivos individuais submetidos a atividade elétrica alterada

Este protocolo demonstra a microinjeção de lipopolissacarídeo na região ventricular cerebral em um modelo larval de peixe-zebra para estudar a resposta neuroinflamatória e a neurotoxicidade resultantes.

Microinjeções ventriculares cerebrais de lipopolissacarídeo em peixe-zebra larval para avaliar a neuroinflamação e a neurotoxicidade

Demonstramos um método que aproveita a microscopia confocal de varredura rápida para realizar imagens ao vivo de células da microglia no tectum óptico do peixe-zebra em desenvolvimento, permitindo a análise da dinâmica dessas células in vivo.

Imagem ao vivo e caracterização da dinâmica da microglia no embrião de peixe-zebra

Este protocolo descreve um procedimento de triagem de drogas em larvas de peixe-zebra 3-7 dias após a fertilização, seguido de avaliação morfológica.

Triagem de pequenas moléculas e testes de toxicidade em larvas de peixe-zebra em estágio inicial

Aprenda a técnica de microgavagem em larvas de peixe-zebra para administração oral controlada de substâncias no lúmen intestinal. Este método seguro permite estudar transporte intestinal e tecidos extraintestinais com precisão.

Microgavage de larvas do peixe

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