Microgavage de larvas do peixe

O objetivo geral deste procedimento é administrar oralmente materiais para a luz intestinal de larvas de peixe-zebra. Primeiro, as larvas são anestesiadas e colocadas em um molde de injeção revestido com metilcelulose. Em seguida, as larvas são suavemente submersas no molde e alinhadas com o ângulo da agulha de gavagem e do micromanipulador.

A agulha é então inserida na boca da larva e posicionada no bulbo intestinal. Uma vez no lugar, o material é liberado na luz. O passo final é extrair a larva do metilcelulose e colocá-la em meio fresco para se recuperar da anestesia.

Essencialmente, este método pode ser utilizado para entregar materiais especificamente à luz intestinal de larvas de peixe-zebra, onde o transporte dentro do intestino ou em tecidos extra-intestinais pode ser estudado. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a imersão em água contendo o material de interesse, é que a quantidade de material administrado ao animal, bem como o momento e a dosagem, podem ser rigorosamente controlados. Isso reduz a variabilidade experimental e, em alguns casos, a toxicidade associada a certos materiais.

Tivemos a ideia inicial deste método quando tivemos dificuldade em aplicar certas sondas fluorescentes em concentrações suficientemente altas para serem detectáveis no epitélio intestinal por microscopia. Altas concentrações muitas vezes matam os peixes e ainda assim não geram um sinal fluorescente suficientemente intenso para a obtenção de imagens. Para começar, puxe várias agulhas de gavagem utilizando um puxador de micropipetas e use capilares de vidro de sílica.

Transfira-se para um microscópio estereoscópico para cortar as agulhas. Primeiro, alinhe a ponta da agulha com a extremidade de uma régua transparente ou escala gráfica. Após o alinhamento, utilize pinças de ponta fina de relojoeiro para cortar a agulha a cerca de um milímetro da ponta.

Examine a ponta da agulha com aumento de 100 vezes. A agulha deve ter cerca de 27 a 30 mícrons de diâmetro e ser romba. Evite agulhas pontiagudas ou irregulares para obter resultados mais consistentes.

Uma micro-fornalha pode ser usada para controlar melhor o ponto de corte da agulha e para polir a ponta da agulha com chama, removendo bordas afiadas. Em seguida, prepare a solução de gavagem.

Para a maioria das aplicações, o vermelho de fenol é adicionado para auxiliar na visualização do microinjetor e na colocação da solução de gavagem. Após o preenchimento com óleo mineral, acople a agulha de gavagem à unidade de microinjeção Nano Jet Two. Envolva uma placa de Petri plástica de 10 centímetros com filme aderente para fornecer uma superfície plana e impermeável e distribua cerca de dois microlitros da solução de gavagem sobre o filme para-afin.

O próximo passo é preencher manualmente a agulha de gavagem. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no óleo mineral. Para calibrar o volume de ejeção, injete pequenas gotas em uma pequena placa de Petri cheia de óleo mineral até que sejam consistentes em tamanho, meça o diâmetro das gotas utilizando a ferramenta gráfica e calcule o volume da gota.Volume.

A consistência entre as agulhas é representada graficamente aqui. Antes de usar a agulha para gavagem, remova todo o óleo mineral residual lavando-a em meio limpo para peixes-zebra. Após aquecer a tampa do molde de aros, cubra três ranhuras com metilcelulose a 3%. A ranhura deve ser coberta o suficiente para segurar o peixe, mas não tão pouco que a metilcelulose seque rapidamente.

Em seguida, distribua cerca de quatro mililitros de meio para peixe-zebra em poços de uma placa de seis poços e transfira larvas de peixe-zebra de cada grupo experimental para poços separados. Para anestesiar os peixes, prepare uma solução de trica três vezes concentrada no meio apropriado para peixe-zebra. Uma vez por poço.

Anestesie o peixe misturando um volume igual de solução de trica no meio e agitando suavemente. Assim que os peixes pararem de se mover, use uma pipeta de vidro larga e pastosa para colocá-los um a um sobre a metilcelulose, com as cabeças no ângulo de 45 graus do sulco e as caudas voltadas para o ângulo de 90 graus do sulco. Use uma sonda de dissecação romba para pressionar suavemente cada larva na metilcelulose, estabilizando sua posição.

Em seguida, ajuste o equipamento de microinjeção nano jet dois de modo que a agulha fique inclinada em um ângulo raso. Certifique-se de que a amplitude de extensão seja suficiente para alcançar além do fundo do poço. Para minimizar a necessidade de ajustes futuros, configure a unidade de microinjeção para liberar 4,6 nanolitros utilizando a posição de injeção lenta, usando uma das mãos para fazer pequenos ajustes na placa contendo as larvas imobilizadas e a outra para controlar o micromanipulador da unidade de microinjeção.

Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque os peixes-zebra são muito pequenos e facilmente danificados. É necessário prática para identificar a estrutura esofágica sob o microscópio estereoscópico e para determinar a quantidade apropriada de pressão a ser aplicada na agulha de gavagem para alcançar a luz intestinal. Primeiro, movimente suavemente a agulha de gavagem para dentro da boca de um peixe anestesiado.

Passe através do esôfago e deprema levemente o esfíncter esofagiano para introduzir a ponta logo no interior da parede intestinal anterior. Uma vez dentro do bulbo anterior, administre suavemente o material nessas configurações. O volume administrado deve preencher apenas o bulbo anterior do intestino, sem vazar pelo esôfago ou cloaca.

Retire a agulha rapidamente e suavemente. Tenha cuidado para não liberar quantidades significativas de material na esôfago. Após remover a agulha de gavagem, transfira o peixe para uma placa contendo meio fresco.

Reviva as larvas da anestesia e remova a metilcelulose lavando-as várias vezes em meio fresco. Transfira as larvas para uma placa de Petri ou placa de seis poços até o momento do uso. Para análises subsequentes, pode-se utilizar a microgavagem para introduzir diversos materiais no teste com peixe-zebra.

Para começar, prepare as soluções necessárias para gavagem para demonstrar este método. O dextrano de 10 kD conjugado ao Texas Red é utilizado para analisar a integridade da barreira do epitélio intestinal.

Após seguir os passos demonstrados anteriormente, realize a gavagem em grupos de 10 a 20 larvas de peixe-zebra para cada condição experimental. Repita o procedimento com grupos duplicados ou triplicados, se possível. Após a gavagem, recupere as larvas da anestesia e permita que nadem livremente em meio fresco.

Após aproximadamente 20 minutos, reanestesiar novamente as larvas conforme mostrado anteriormente. Uma vez anestesiadas, posicionar as larvas em metilcelulose a 3% sobre um bloco de agarose a 3%, observar as larvas com um microscópio estereoscópico de fluorescência e filtro Texas red, e selecionar uma ampliação que exiba as larvas desde o focinho até imediatamente posterior ao final do cloácre. A fluorescência deve ser intensa na luz intestinal.

No entanto, a função de barreira é avaliada pelo nível de dextrano que aparece nos tecidos extra-intestinais, ajustando a exposição para permitir a visualização da fluorescência do tronco. Mesmo que isso superexponha a fluorescência luminar quando administrado isoladamente, o dextrano é retido dentro da luz do intestino. No entanto, em larvas coincubadas com EDTA, que rompe as junções apertadas epiteliais, o dextrano é observado na circulação e nos vasos e espaços antissemíticos.

Nesses exemplos, o Image J foi utilizado para quantificar a fluorescência média relativa em uma região de interesse no tronco do peixe-zebra e normalizada em relação a uma ROI fora do peixe, servindo como controle interno. Aqui, os resultados obtidos com uma agulha comum são comparados aos obtidos com uma agulha micro forge. Menos larvas no grupo somente com dextrina exibiram fluorescência extraintestinal, sugerindo que as agulhas micro forge têm menor probabilidade de danificar as larvas.

Analisando uma região mais de perto, observa-se novamente que o dextrano está restrito ao lúmen intestinal, sem vazamento para a vasculatura ou espaços extra-intestinais. Na ausência de EDTA, quando comparado com o dextrano contendo EDTA, o dextrano é observado em espaços extra-intestinais e dentro do lúmen da aorta dorsal e da veia cardinais posteriores, sendo o sinal de sangue aqui decorrente do fluxo sanguíneo. Ao tentar realizar este procedimento, certifique-se de que a agulha não tenha bordas irregulares, que os peixes estejam bem posicionados e fixos na metilcelulose, e tenha cuidado e paciência ao aprender a manobrar a agulha através do esôfago da larva.

Essa técnica pode ser utilizada em uma ampla gama de aplicações no peixe-zebra que exigem a introdução ou visualização controladas de materiais dentro do intestino. Permite um controle rigoroso sobre o momento, a via e a dosagem da administração no animal, e reduz significativamente a variação dentro de um experimento e entre experimentos.