Name: Microgavage de larvas do peixe (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprenda a técnica de microgavagem em larvas de peixe-zebra para administração oral controlada de substâncias no lúmen intestinal. Este método seguro permite estudar transporte intestinal e tecidos extraintestinais com precisão.

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Agradecemos aos membros do laboratório de Rawls pelas sugestões úteis sobre o conteúdo e ao Dr. Alan Fanning pelas valiosas discussões sobre permeabilidade de tamanho e métodos de disruptura das junções íntimas. Agradecemos também ao Dr. Michael Chua e ao Dr. Neal Kramarcy da Michael Hooker Microscopy Facility pelo apoio com o microscópio confocal. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos National Institutes of Health T32 DK007737-15 (bolsista J.L.C.), F32 DK094592 (para J.L.C.) e R01 DK081426 (para J.F.R.).

<ol><li>Kuhlman, J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+mutations+affecting+development+and+function+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system.</a> Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).</li>
<li>Pack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+zebrafish+digestive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of zebrafish digestive organs.</a> Development. 123, 321-328 (1996).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).</li>
<li>Hama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+digestive+organ+function+using+multiple+quenched+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).</li>
<li>Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-content+model+system+for+studies+of+gastrointestinal+transit%3A+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish.</a> Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).</li>
<li>Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+single+lumen+formation+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut.</a> Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).</li>
<li>Bagnat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cse1l+is+a+negative+regulator+of+CFTR-dependent+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion.</a> Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Brugman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone-induced+enterocolitis+in+zebrafish+depends+on+the+composition+of+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota.</a> Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).</li>
<li>Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+intestinal+cancer+models%3A+unraveling+gastrointestinal+homeostasis+and+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 361-376 (2009).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study.</a> Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).</li>
<li>Kanther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+colonization+induces+dynamic+temporal+and+spatial+patterns+of+NF-kappaB+activation+in+the+zebrafish+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract.</a> Gastroenterology. , (2011).</li>
<li>Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+zebrafish+reveal+evolutionarily+conserved+responses+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).</li>
<li>Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+genetic+analysis+link+bacterial+motility+and+symbiosis+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Bates, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+from+the+microbiota+promote+different+aspects+of+zebrafish+gut+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.</a> Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).</li>
<li>Cheesman, S. E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+know+you+are+in+there%3A+conversing+with+the+indigenous+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota.</a> Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).</li>
<li>Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+detoxifies+lipopolysaccharide+and+prevents+inflammation+in+zebrafish+in+response+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota.</a> Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+cis-regulatory+modules+mediate+tissue-specific+and+microbial+control+of+angptl4%2Ffiaf+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription.</a> PLoS Genetics. , In Press (2012).</li>
<li>Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+proliferation+in+the+developing+zebrafish+intestine+is+regulated+by+the+Wnt+pathway+and+microbial+signaling+via+Myd88%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+a+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Van Itallie, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+density+of+small+tight+junction+pores+varies+among+cell+types+and+is+increased+by+expression+of+claudin-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2.</a> J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).</li>
<li>Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+size-dependent+permeability+of+the+tight+junction+using+PEG+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling.</a> Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).</li>
<li>Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+of+tight+junctions+in+intestinal+cell+monolayers+using+polyethylene+glycol+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).</li>
<li>Rodgers, L. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+permeability+by+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+formation+in+cultured+epithelial+cells+%28MDCK%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK).</a> J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).</li>
<li>Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+tight-junction+permeability+and+structure+in+Necturus+gallbladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder.</a> Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).</li>
<li>Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+gut+motility+control+system+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).</li>
<li>Rich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit-like+immunoreactivity+in+the+zebrafish+gastrointestinal+tract+reveals+putative%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative.</a> 236, 903-911 (2007).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+and+TTX-insensitive+control+of+spontaneous+gut+motility+in+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae.</a> J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).</li>
<li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio.</a> J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Clifton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+dietary+lipid+absorption+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish.</a> PLoS One. 5, e12386(2010).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+offer+the+potential+for+a+primary+screen+to+identify+a+wide+variety+of+potential+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants.</a> Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).</li>
</ol>

Nenhum conflito de interesses declarado.

Neste trabalho, descrevemos um novo protocolo para a entrega direta de materiais ao intestino de larvas de peixe-zebra por meio de microsondagem. Existem várias etapas críticas ao longo do procedimento que devem ser levadas em consideração. Primeiramente, as larvas de peixe-zebra devem estar em boas condições de saúde antes do experimento de sondagem, a fim de prevenir mortes não relacionadas ao tratamento. Outro fator importante é a qualidade da agulha de sondagem. Uma das partes mais difíceis do protocolo é cortar a ag...

<table><tbody><tr><td>Finquel (metanosulfonato de tricaina)</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>Anestesia de larvas</td></tr><tr><td>Solução de vermelho de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>0,5% em DPBS, testado para cultura celular</td></tr><tr><td>Óleo mineral, leve, branco (alta pureza)</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>Para reenchimento da agulha e teste de volume</td></tr><tr><td>Dextrano TxRed, peso molecular 10.000, fixável por lisina</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>Suspensão a 1% em PBS 1x/vermelho de fenol</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>Estoque a 5 mM em água</td></tr><tr><td>Metilcelulose</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Diâmetro externo 1,14 mm, diâmetro interno 0,53 mm, comprimento 3,5 polegadas</td></tr><tr><td>Forma plástica para fabricação de moldes</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Unidade de microinjeção Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Puxador de micropipetas Flaming Brown, filamento largo de 3,0 mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>Fabricação de agulhas</td></tr><tr><td>Pinça Dumont #5 para estudantes</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0,1 x 0,06 mm, corte de agulhas</td></tr><tr><td>Retículo ocular, 5 mm - 100 divisões</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>Corte de agulhas</td></tr><tr><td>Microforja</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Corte de agulhas e polimento a fogo</td></tr><tr><td>Agulha para seringa Tuberculin SlipTip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml, agulha 25G 5/8</td></tr><tr><td>Microesferas Fluoresbrite YG (2,0 &amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>Análise da motilidade intestinal</td></tr><tr><td>Microsscópio estereoscópico</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>Procedimento de gavagem</td></tr><tr><td>Microsscópio estereoscópico de fluorescência</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>Ensaio de barreira com dextrano</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Imagem do dextrano na circulação</td></tr></tbody></table>

microgavage de larvas do peixe

Microgavage of Zebrafish Larvae

O peixe-zebra emergiu como um organismo modelo poderoso para o estudo do desenvolvimento intestinal1-5, da fisiologia6-11, de doenças12-16 e das interações entre hospedeiro e microrganismos17-25. Abordagens experimentais para o estudo da biologia intestinal frequentemente requerem a introdução in vivo de materiais selecionados na luz do intestino. No modelo de peixe-zebra larval, isso é tipicamente realizado imergindo os peixes em uma solução do material escolhido ou por injeção através da parede abdominal. Utilizando o método de imersão, é difícil monitorar ou controlar com precisão a rota ou o momento da entrega do material ao intestino. Por esse motivo, a exposição por imersão pode causar toxicidade indesejada e outros efeitos em tecidos extraintestinais, limitando a faixa potencial de quantidades de material que podem ser entregues ao intestino. Além disso, a quantidade de material ingerido durante a exposição por imersão pode variar significativamente entre larvas individuais26. Embora esses problemas não ocorram durante a injeção direta através da parede abdominal, a injeção adequada é difícil e causa danos teciduais que poderiam influenciar os resultados experimentais. Apresentamos um método de microsondagem em larvas de peixe-zebra. O objetivo deste método é fornecer uma maneira segura, eficaz e consistente de entregar material diretamente para a luz do intestino anterior em larvas de peixe-zebra com tempo controlado. A microsondagem utiliza equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia comuns na maioria dos laboratórios que realizam pesquisas com peixe-zebra. Uma vez que os peixes são adequadamente posicionados em metilcelulose, a sondagem pode ser realizada rapidamente a uma taxa de aproximadamente 7-10 peixes/min, e a sobrevivência pós-sondagem aproxima-se de 100%, dependendo do material administrado. Também demonstramos que a microsondagem pode permitir o carregamento da luz intestinal com altas concentrações de materiais que são letais para os peixes quando expostos por imersão. Para demonstrar a utilidade deste método, apresentamos um ensaio de microsondagem com dextrano fluorescente que pode ser usado para quantificar o trânsito da luz intestinal para espaços extraintestinais. Esse teste pode ser usado para verificar a execução correta do procedimento de microsondagem e também fornece um ensaio inovador em peixe-zebra para examinar a integridade da barreira epitelial intestinal sob diferentes condições experimentais (por exemplo, manipulação genética, tratamento com fármacos ou exposição a fatores ambientais). Além disso, mostramos como a sondagem pode ser usada para avaliar a motilidade intestinal mediante a administração de microesferas fluorescentes e o monitoramento subsequente de seu trânsito. A microsondagem pode ser aplicada para entregar diversos materiais, tais como microrganismos vivos, fatores microbianos secretados/toxinas, agentes farmacológicos e sondas fisiológicas. Com essas capacidades, o método de microsondagem em larvas de peixe-zebra tem o potencial de aprimorar uma ampla gama de áreas de pesquisa que utilizam o sistema modelo de peixe-zebra.

Quando a gavagem é realizada corretamente, o material administrado deve estar inteiramente contido no intestino anterior, com pouco ou nenhum resíduo no esôfago (Figura 3). Deve-se escolher um volume de administração que possa ser acomodado dentro do bulbo anterior e que não vaze pela cloaca ou pelo esôfago. Se o volume do material ou a pressão de administração forem excessivos, a força física da gavagem poderá causar danos ou vazamento através do epitélio. Também poderá expelir ou alterar outros compone...

Apresentamos um novo método de microgavagem de larvas de peixe-zebra utilizando equipamentos padrão de microinjeção de embriões e estereomicroscopia. Demonstramos que a microgavagem é uma técnica segura e eficiente, útil para administrar quantidades controladas de diversos materiais diretamente na luz intestinal de larvas de peixe-zebra.

Microgavage de larvas do peixe

O peixe-zebra emergiu como um organismo modelo poderoso para o estudo do desenvolvimento intestinal1-5, fisiologia6-11, doenças12-16 e da interação hospedeiro-micróbio...

O objetivo geral deste procedimento é administrar oralmente materiais para a luz intestinal de larvas de peixe-zebra. Primeiro, as larvas são anestesiadas e colocadas em um molde de injeção revestido com metilcelulose. Em seguida, as larvas são suavemente submersas no molde e alinhadas com o ângulo da agulha de gavagem e do micromanipulador.A agulha é então inserida na boca da larva e posicionada no bulbo intestinal. Uma vez no lugar, o material é liberado na luz. O passo final é extrair a larva do metilcelulose e colocá-la em meio fresco para se recuperar da anestesia.Essencialmente, este método pode ser utilizado para entregar materiais especificamente à luz intestinal de larvas de peixe-zebra, onde o transporte dentro do intestino ou em tecidos extra-intestinais pode ser estudado. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a imersão em água contendo o material de interesse, é que a quantidade de material administrado ao animal, bem como o momento e a dosagem, podem ser rigorosamente controlados. Isso reduz a variabilidade experimental e, em alguns casos, a toxicidade associada a certos materiais.Tivemos a ideia inicial deste método quando tivemos dificuldade em aplicar certas sondas fluorescentes em concentrações suficientemente altas para serem detectáveis no epitélio intestinal por microscopia. Altas concentrações muitas vezes matam os peixes e ainda assim não geram um sinal fluorescente suficientemente intenso para a obtenção de imagens. Para começar, puxe várias agulhas de gavagem utilizando um puxador de micropipetas e use capilares de vidro de sílica.Transfira-se para um microscópio estereoscópico para cortar as agulhas. Primeiro, alinhe a ponta da agulha com a extremidade de uma régua transparente ou escala gráfica. Após o alinhamento, utilize pinças de ponta fina de relojoeiro para cortar a agulha a cerca de um milímetro da ponta.Examine a ponta da agulha com aumento de 100 vezes. A agulha deve ter cerca de 27 a 30 mícrons de diâmetro e ser romba. Evite agulhas pontiagudas ou irregulares para obter resultados mais consistentes.Uma micro-fornalha pode ser usada para controlar melhor o ponto de corte da agulha e para polir a ponta da agulha com chama, removendo bordas afiadas. Em seguida, prepare a solução de gavagem.Para a maioria das aplicações, o vermelho de fenol é adicionado para auxiliar na visualização do microinjetor e na colocação da solução de gavagem. Após o preenchimento com óleo mineral, acople a agulha de gavagem à unidade de microinjeção Nano Jet Two. Envolva uma placa de Petri plástica de 10 centímetros com filme aderente para fornecer uma superfície plana e impermeável e distribua cerca de dois microlitros da solução de gavagem sobre o filme para-afin.O próximo passo é preencher manualmente a agulha de gavagem. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar no óleo mineral. Para calibrar o volume de ejeção, injete pequenas gotas em uma pequena placa de Petri cheia de óleo mineral até que sejam consistentes em tamanho, meça o diâmetro das gotas utilizando a ferramenta gráfica e calcule o volume da gota.Volume.A consistência entre as agulhas é representada graficamente aqui. Antes de usar a agulha para gavagem, remova todo o óleo mineral residual lavando-a em meio limpo para peixes-zebra. Após aquecer a tampa do molde de aros, cubra três ranhuras com metilcelulose a 3%. A ranhura deve ser coberta o suficiente para segurar o peixe, mas não tão pouco que a metilcelulose seque rapidamente.Em seguida, distribua cerca de quatro mililitros de meio para peixe-zebra em poços de uma placa de seis poços e transfira larvas de peixe-zebra de cada grupo experimental para poços separados. Para anestesiar os peixes, prepare uma solução de trica três vezes concentrada no meio apropriado para peixe-zebra. Uma vez por poço.Anestesie o peixe misturando um volume igual de solução de trica no meio e agitando suavemente. Assim que os peixes pararem de se mover, use uma pipeta de vidro larga e pastosa para colocá-los um a um sobre a metilcelulose, com as cabeças no ângulo de 45 graus do sulco e as caudas voltadas para o ângulo de 90 graus do sulco. Use uma sonda de dissecação romba para pressionar suavemente cada larva na metilcelulose, estabilizando sua posição.Em seguida, ajuste o equipamento de microinjeção nano jet dois de modo que a agulha fique inclinada em um ângulo raso. Certifique-se de que a amplitude de extensão seja suficiente para alcançar além do fundo do poço. Para minimizar a necessidade de ajustes futuros, configure a unidade de microinjeção para liberar 4,6 nanolitros utilizando a posição de injeção lenta, usando uma das mãos para fazer pequenos ajustes na placa contendo as larvas imobilizadas e a outra para controlar o micromanipulador da unidade de microinjeção.Em geral, indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades porque os peixes-zebra são muito pequenos e facilmente danificados. É necessário prática para identificar a estrutura esofágica sob o microscópio estereoscópico e para determinar a quantidade apropriada de pressão a ser aplicada na agulha de gavagem para alcançar a luz intestinal. Primeiro, movimente suavemente a agulha de gavagem para dentro da boca de um peixe anestesiado.Passe através do esôfago e deprema levemente o esfíncter esofagiano para introduzir a ponta logo no interior da parede intestinal anterior. Uma vez dentro do bulbo anterior, administre suavemente o material nessas configurações. O volume administrado deve preencher apenas o bulbo anterior do intestino, sem vazar pelo esôfago ou cloaca.Retire a agulha rapidamente e suavemente. Tenha cuidado para não liberar quantidades significativas de material na esôfago. Após remover a agulha de gavagem, transfira o peixe para uma placa contendo meio fresco.Reviva as larvas da anestesia e remova a metilcelulose lavando-as várias vezes em meio fresco. Transfira as larvas para uma placa de Petri ou placa de seis poços até o momento do uso. Para análises subsequentes, pode-se utilizar a microgavagem para introduzir diversos materiais no teste com peixe-zebra.Para começar, prepare as soluções necessárias para gavagem para demonstrar este método. O dextrano de 10 kD conjugado ao Texas Red é utilizado para analisar a integridade da barreira do epitélio intestinal.Após seguir os passos demonstrados anteriormente, realize a gavagem em grupos de 10 a 20 larvas de peixe-zebra para cada condição experimental. Repita o procedimento com grupos duplicados ou triplicados, se possível. Após a gavagem, recupere as larvas da anestesia e permita que nadem livremente em meio fresco.Após aproximadamente 20 minutos, reanestesiar novamente as larvas conforme mostrado anteriormente. Uma vez anestesiadas, posicionar as larvas em metilcelulose a 3% sobre um bloco de agarose a 3%, observar as larvas com um microscópio estereoscópico de fluorescência e filtro Texas red, e selecionar uma ampliação que exiba as larvas desde o focinho até imediatamente posterior ao final do cloácre. A fluorescência deve ser intensa na luz intestinal.No entanto, a função de barreira é avaliada pelo nível de dextrano que aparece nos tecidos extra-intestinais, ajustando a exposição para permitir a visualização da fluorescência do tronco. Mesmo que isso superexponha a fluorescência luminar quando administrado isoladamente, o dextrano é retido dentro da luz do intestino. No entanto, em larvas coincubadas com EDTA, que rompe as junções apertadas epiteliais, o dextrano é observado na circulação e nos vasos e espaços antissemíticos.Nesses exemplos, o Image J foi utilizado para quantificar a fluorescência média relativa em uma região de interesse no tronco do peixe-zebra e normalizada em relação a uma ROI fora do peixe, servindo como controle interno. Aqui, os resultados obtidos com uma agulha comum são comparados aos obtidos com uma agulha micro forge. Menos larvas no grupo somente com dextrina exibiram fluorescência extraintestinal, sugerindo que as agulhas micro forge têm menor probabilidade de danificar as larvas.Analisando uma região mais de perto, observa-se novamente que o dextrano está restrito ao lúmen intestinal, sem vazamento para a vasculatura ou espaços extra-intestinais. Na ausência de EDTA, quando comparado com o dextrano contendo EDTA, o dextrano é observado em espaços extra-intestinais e dentro do lúmen da aorta dorsal e da veia cardinais posteriores, sendo o sinal de sangue aqui decorrente do fluxo sanguíneo. Ao tentar realizar este procedimento, certifique-se de que a agulha não tenha bordas irregulares, que os peixes estejam bem posicionados e fixos na metilcelulose, e tenha cuidado e paciência ao aprender a manobrar a agulha através do esôfago da larva.Essa técnica pode ser utilizada em uma ampla gama de aplicações no peixe-zebra que exigem a introdução ou visualização controladas de materiais dentro do intestino. Permite um controle rigoroso sobre o momento, a via e a dosagem da administração no animal, e reduz significativamente a variação dentro de um experimento e entre experimentos.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo mostra como morfolino ou mRNA podem ser injetadas em embriões de peixe-zebra na fase de uma célula para diminuir ou aumentar o nível de produtos de genes específicos durante o desenvolvimento subseqüente.

Microinjeção de embriões Zebrafish para analisar a função do gene

Fonte: Li, J., et al. Desenvolvimento de um modelo larval de infecção por peixe-zebra para Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).Este vídeo demonstra o procedimento de microgavage, no qual uma larva de peixe-zebra anestesiada é imobilizada em agarose e injetada oralmente com uma bactéria patogênica usando uma agulha guiada por traçadores. O parto não invasivo imita infecção natural, permitindo a análise da replicação bacteriana, liberação de toxinas e danos epiteliais intestinais.

Desenvolvimento de um modelo de infecção larval de peixe-zebra usando microgavage

O uso crescente de peixe-zebra como um modelo animal requer o desenvolvimento de métodos eficazes para a entrega de quantidades conhecidas de compostos e soluções. O procedimento de gavagem descrito abaixo permite a distribuição oral de volumes precisos de solução fiável, segura e eficiente de peixe-zebra adultos.

Gavaging Zebrafish Adulto

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