Name: Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Aprenda a capturar 5-hidroximetilcitosina do DNA genômico usando β-glucosiltransferase e química click com biotina. Este método permite enriquecimento eficiente e independente de densidade para mapeamento epigenômico de alta vazão.

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Este estudo foi financiado em parte pelo Instituto Nacional de Saúde (GM071440 a CH e NS051630/MH076090/MH078972 para PJ).

1. A fragmentação de ADN genómico Fragmento de ADN genómico utilizando sonicação de uma gama de tamanhos desejada adequada para a plataforma de sequenciamento do genoma. (Nós normalmente sonicar a ~ 300 pb.) Verificar a distribuição do tamanho do ADN genómico fragmentado em 1% de gel de agarose (Figura 1). 2. Preparação de ADN Determinar as quantidades de ADN a partir baseadas na abundância de 5 HMC em ADN genómico. Desde 5-HMC níveis variam significativamente em diferentes tipos de tecidos, quantidades de DNA a partir dependem dos níveis de 5-HMC das amostras. Por favor, consulte a Tabela 1 para exemplos. 3. β-GT reacção catalisada (reacção de transferência de Glicose) <ol><li> Misturar por pipetagem da mistura, como detalhado na Tabela 2 e incuba-se em um banho de água a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Após a incubação, limpar-se a mistura reaccional com remoção Kit QIAquick Nucleotide, utilizando 10 jig de DNA porcoluna. Eluir com 30 ul de água por coluna e combinar. </li></ol> 4. Reação Biotinilação (Clique Química) <ol><li> Adicionar DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado de solução de trabalho (1 mM) na solução de ADN eluído (do passo 3) para uma concentração final de 150 uM (ou seja, 5 uL de solução de trabalho por 30 ul de solução de ADN). </li><li> Misturar por pipetagem, e incubar em banho de água a 37 ° C durante 2 horas. </li><li> Limpe a reação com QIAquick Removal Kit Nucleotide. O volume de eluição total ideal é de 100 uL. </li><li> Quantificar a quantidade de DNA recuperado usando microlitro espectrofotômetro escala (por exemplo., NanoDrop). </li></ol> 5. Captura de 5 HMC contendo DNA <ol><li> Lave 50 ul de Dynabeads MyOne Estreptavidina C1 3 vezes com 1 ml de 1X tampão B &amp; W de acordo com as instruções do fabricante. Separa-se as pérolas com um suporte magnético. </li><li> Adicionar um volume igual de 2X tampão B &amp; W para o D recuperado biotiniladoNA (100 ul) às pérolas lavadas. </li><li> Incubar durante 15 min à temperatura ambiente com rotação suave num agitador rotativo. </li><li> Separa-se as pérolas com um suporte magnético e lavar as pérolas três vezes com 1 ml de 1X tampão B &amp; W. </li><li> Eluir o DNA através da incubação as pérolas em 100 ul de DTT mM preparada de fresco 50 durante 2 h à temperatura ambiente, com rotação suave num agitador rotativo. </li><li> Separa-se as pérolas com um suporte magnético. Aspirar o eluente e uma carga para Micro Bio-Spin 6 Coluna de acordo com a instrução de fabrico para remover o DTT. O ADN alvo é a solução agora. </li><li> Purifica-se o DNA eluído a partir do passo anterior, Qiagen Purification Kit MinElute PCR DNA e elui-se em 10 ul de tampão EB. Quantificar DNA usando Fluorometer Qubit ou NanoDrop se a concentração é superior a 20 ng / ul. O DNA está pronto para jusante preparação biblioteca genômica sequenciação. </li></ol> 6. Resultados representativos Se a qualidade de of DNA genómico é elevada, o rendimento de recuperação típicos após a β-GT e reacções de biotinilação são ~ 60-70%. No entanto, a eficiência da captação variar significativamente com os tipos de tecidos diferentes, dependendo dos níveis de 5-HMC das amostras. Normalmente, a eficiência da captação de DNA genómico cérebro é ~% 4-9, e, em alguns casos extremos, a eficiência pode atingir até 12%. No caso de células ES, a eficiência da captação média é de aproximadamente 2-4%, em contraste com a ~ 0,5% para as células estaminais neurais. A menor eficiência visto até agora foi para o DNA genômico de células cancerosas. Todos DNA enriquecido está pronto para o padrão da próxima geração de protocolos de preparação de bibliotecas. Além disso, o ADN capturado pode também ser usado como molde para a PCR em tempo real para detectar o enriquecimento de alguns fragmentos em comparação com o ADN de entrada, se os iniciadores relacionados estão disponíveis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> Figura 1. Sonicados fragmentos genómicos humanos de DNA em1% de gel de agarose. De 10 ug de DNA genómico isolado a partir de células humanas do iPS em 120 ul de tampão TE 1X foi sonicada usando um dispositivo de ultra-sons (Covaris). Após sonicação, 2 ul do DNA sonicado foi carregada num gel de agarose a 1% utilizando 100 pb do marcador de DNA para comparar os tamanhos dos fragmentos de DNA sonicados. <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> Água </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X tampão de reacção β-GT </td><td> 2 ul </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Até 10 ug de ADN genómico </td><td> _ Ul </td><td> Até 500 ng / uL </td></tr><tr><td> UDP-N-6, 3-Glc (3 mM) </td><td> 0,67 ul </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 1 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 20 ul </td&gt; <td></td></tr></tbody></table> i) Para o DNA genômico de tecidos (conteúdo 5 HMC alta&gt; 0,1%) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> Água </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X tampão de reacção β-GT </td><td> 10 ul </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Até 20 ug de ADN genómico </td><td> _ Ul </td><td> Até 500 ng / uL </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> Ul 1,33 </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 2 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 40 ul </td><td></td></tr></tbody></table> ii) Para o ADN genómico de células estaminais (mediana 5 HMC conteúdo ~ 0,05%) <table border="1"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volume </td><td> Concentração Final </td></tr><tr><td> Água </td><td> _ Ul </td><td></td></tr><tr><td> 10 X tampão de reacção β-GT </td><td> 10 ul </td><td> 1 X </td></tr><tr><td> Até 50 ug de ADN genómico </td><td> _ Ul </td><td> Até 500 ng / uL </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 3,33 ul </td><td> 100 uM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 5 ul </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Volume total </td><td> 100 ul </td><td></td></tr></tbody></table> iii) Para o câncer de DNA genômico de células (conteúdo 5 HMC baixo ~ 0,01%) Tabela 1. Exemplos de quantidades de ADN de entrada e de reacções de etiquetagem utilizando as amostras com diferentes níveis de HMC-5 através do método selectivo química rotulagem. <table border="1"><tbody><tr><td> Amostra </td><td> 5 HMC nível </strong&gt; </td><td> ADN de partida (mg) </td><td> A recuperação após a etiquetagem (entrada de esferas) (ig) </td><td> Rendimento de recuperação </td><td> Pull-down DNA (ng) </td><td> Puxe para baixo rendimento </td></tr><tr><td> Cerebelo do rato adulto </td><td> 0,4% </td><td> 10 </td><td> 7,5 </td><td> 75% </td><td> 236 </td><td> 3,1% </td></tr><tr><td> Pós-natal do rato 7 dias cerebelo </td><td> 0,1% </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82% </td><td> 140 </td><td> 1,6% </td></tr><tr><td> Rato de células ES E14 </td><td> 0,05% </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70% </td><td> 350 </td><td> 0,8% </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Resultados representativos a partir de tecidos e células do cérebro de rato ES.

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li>
<li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li>
<li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241(2011).</li>
<li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li>
<li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li>
<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888(2010).</li>
<li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li>
<li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li>
<li>Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine%3A+a+new+kid+on+the+epigenetic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562(2011).</li>
<li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181(2010).</li>
<li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+recombinant+%CE%B2-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li>
<li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li>
<li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367(2010).</li>
<li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mbd3%2FNURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154(2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

5-hydroxymethylcytosine (5 HMC) é uma modificação do presente recentemente identificado epigenética em quantidades substanciais em certos tipos de células de mamíferos. O método aqui apresentado é para determinar a distribuição de todo o genoma de 5 HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glicosiltransferase para transferir uma porção glucose engenharia contendo um grupo azida para o grupo hidroxilo de 5 HMC. O grupo azida pode ser quimicamente modificados com biotina para a detecção, o enriquecimento por afinidade, e sequenciame...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Catalogo </td><td> Comentário </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagentes </td></tr><tr><td> O cloreto de sódio 5 M (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> PH 8,0 0,5 M de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma base (Tris) pH 7,5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de magnésio (MgCl2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530g </td><td></td></tr><tr><td> Dimetil-sulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher biorreagentes </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-PEG3-biotina conjugado </td><td> Clique em Ferramentas Química </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-Ditiotreitol, ultrapura (TDT) suprapuro </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick Removal Kit Nucleotide </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 Coluna </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Estreptavidina C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen MinElute PCR Purification Kit </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-glucose </td><td> Motivo ativa </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzima </td></tr><tr><td> β-glicosiltransferase (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Equipamento </td></tr><tr><td> Dispositivo sonicação </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrífuga de mesa </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Banho de água </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Aparelho de gel de corrida </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tubo Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tubo Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Suporte de Separação Magnética </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 Fluorometer </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Configuração de reagente 10 X Reacção β-GT tampão (500 mM de HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X de ligação e de lavagem (B &amp; W) de tampão (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, Tween a 0,02% 20) . </td></tr></tbody></table>

captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de dna genómico

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-metilcitosina (5-mC) constitui ~ 2-8% das citosinas totais no DNA genómico humano e um impacto de uma ampla gama de funções biológicas, incluindo a expressão de genes, a manutenção da integridade do genoma, a impressão parental, inactivação do cromossoma X, a regulação dos desenvolvimento, envelhecimento, cancro e 1. Recentemente, na presença de um oxidado 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5 HMC), foi descoberto em células de mamíferos, em particular no estaminais embrionárias (ES) e células neuronais 2-4. 5 HMC é gerado por oxidação de 5-mC catalisada por TET família de ferro (II) / α-cetoglutarato-dependente dioxigenases 2, 3. 5 HMC é proposto para ser envolvido na manutenção de células estaminais embrionárias (MES), a hematopoiese normal e doenças malignas, e o desenvolvimento do zigoto 2, 5-10. Para melhor compreender a função da 5-HMC, um sistema de sequenciação fiável e simples é essencial. Seqüenciamento bissulfito tradicional não pode distinguir 5 HMC de 5-MC 11 </sup&gt;. Para desvendar a biologia de 5 HMC, temos desenvolvido um método químico altamente eficaz e selectivo para etiquetar e capturar 5 HMC, aproveitando-se de uma enzima de bacteriófago que adiciona uma porção de glucose a 5 HMC especificamente 12. Aqui descrevemos um procedimento em duas etapas simples para rotulagem química seletiva de 5-HMC. No passo de rotulagem em primeiro lugar, 5 HMC em ADN genómico é marcado com um catalisada 6-azida-glucose por β-GT, uma glicosiltransferase de bacteriófago T4, de uma maneira que transmite a 6-azida-glucose a 5 HMC do cofactor modificado, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). No segundo passo, biotinilação, de um ligante de biotina de dissulfureto é ligado ao grupo azida por química do clique. Ambos os passos são altamente específicos e eficiente, levando à completa marcação, independentemente da abundância de 5 HMC em regiões genómicas e dando de fundo extremamente baixos. Seguindo a biotinilação de 5 HMC, os fragmentos de 5 HMC contendo ADN são então selectivamente capturadautilizando contas de estreptavidina de um modo independente de densidade. Os fragmentos resultantes de 5 HMC enriquecidas de DNA pode ser utilizado para as análises a jusante, incluindo a última geração de sequenciação. Nossa marcação selectiva e protocolo de captura confere alta sensibilidade, aplicável a qualquer fonte de DNA genômico com variáveis ​​/ diverso 5 HMC-abundâncias. Embora o objetivo principal deste protocolo é a sua aplicação a jusante (ou seja., Sequenciamento de última geração para mapear a distribuição de 5 HMC no genoma), é compatível com molécula única, em tempo real SMRT (DNA) de seqüenciamento, que é capaz de fornecer uma única base de sequenciação de resolução de 5 HMC.

Descrita é um processo de rotulagem em duas etapas usando β-glicosiltransferase (β-GT) para transferir uma azida de glucose para 5 HMC, seguido por química do clique para transferir de um ligante de biotina para o enriquecimento fácil e densidade independente. Este método de marcação eficiente e específico permite o enriquecimento de 5 HMC com fundo extremamente baixo e de alto rendimento de mapeamento epigenômico via sequenciamento de última geração.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

A 5-metilcitosina (5-mC) constitui aproximadamente 2-8% do total de citosinas no DNA genômico humano e impacta uma ampla gama de funções biológicas, incluindo a expressão gênica...

O objetivo geral deste procedimento é rotular e capturar a cinco-hidroxietil-citosina, uma modificação do DNA recentemente descoberta. Primeiro, fragmente o DNA genômico por sonicação, em seguida, realize uma reação de transferência de beta-glicose-glucosa para transferir grupos de glicose azidados para os resíduos de cinco-hidroxietil-citosina no DNA, utilizando a química Qlik. Conecte um ligante biotina salicílico ao grupo azida para produzir DNA biotinilado. Em seguida, capture seletivamente os fragmentos de DNA contendo cinco-hidroxietil-citosina em microesferas de estreptavidina de maneira independente da densidade.Os fragmentos de DNA enriquecidos em cinco hidroxietil citidina purificados podem ser utilizados em análises posteriores, incluindo sequenciamento de nova geração. A principal vantagem desta técnica em relação à abordagem existente, como a abordagem baseada em anticorpos, é que a captura de hidroxietil citosina é independente da densidade de PHY C. Eugene Lee, pesquisador sênior associado no laboratório, demonstrará este protocolo.Primeiro, sonique o DNA genômico para obter uma faixa de tamanho adequada à plataforma de sequenciamento genômico. Verifique a distribuiç

selective-capture-of-5-hydroxymethylcytosine-from-genomic-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Este vídeo descreve a técnica de dot-blot para determinar o nível de metilação do DNA em condrócitos humanos in vitro por meio do blotting de amostras de DNA em uma membrana de náilon e a visualização subsequente usando anticorpos monoclonais. Isso ajuda a determinar o fenótipo dos condrócitos em vários estágios da cultura.

Dot Blot de 5-metilcitosina para determinar a extensão da metilação do DNA

Aqui descrevemos um método imunoquímico sensível para mapear a distribuição espacial de derivados de oxidação de 5mC com base no uso de anticorpos secundários conjugados com peroxidase e amplificação de sinal de tiramida.

Detecção de formas modificadas da citosina Utilizando imunohistoquímica Sensível

Recém descoberto formas oxidadas de 5-metilcitosina (oxi-mCs), 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) pode representar modificações de DNA distintas com funções únicas funcionais. Aqui, um fluxo de trabalho semi-quantitativa para visualização da distribuição espacial de oxi-mCs, perfis de intensidade de sinal e colocalization é descrito.

Immunostaining para modificações do DNA: análise computacional de imagens Confocal

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Protocolos detalhados para a introdução de uma enzima de divisão de engenharia-TET2 (cidra) em células de mamíferos para química inducible DNA hydroxymethylation e remodelação epigenéticas são apresentados.

Uma enzima de Split-TET2 projetado para Hydroxymethylation de DNA químico-inducible e remodelação epigenéticas

Aqui, apresentamos um protocolo para permitir que a quantificação exata de metilação de DNA (mtDNA) mitocondrial. Neste protocolo, descrevemos uma digestão enzimática de DNA com BamHI juntamente com um pipeline de análise de bioinformatic que pode ser usado para evitar a superestimação dos níveis de metilação do DNA mitocondrial causada pela estrutura secundária do DNA mitocondrial.

Metodologia para detecção precisa de metilação do DNA mitocondrial

O objetivo deste relato é descrever o protocolo para a deteção de imuno-histoquímica robusto de marcadores epigenéticas, 5-metilcitosina (5mC) e 5-Hidroximetilcitosina (5hmC) no desenvolvimento e postmitotic mouse retina.

Deteção de immunohistochemical da 5-metilcitosina e 5-Hidroximetilcitosina no desenvolvimento e Mouse Postmitotic Retina

Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar 5 hydroxymethylcytosine nas pilhas e nos tecidos do cérebro, utilizando a mancha da imunofluorescência e os métodos do dot-borrão do ADN.

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Este trabalho descreve um protocolo para o monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra.

Monitoramento espaço-temporal rápido e eficiente da metilação normal e aberrante da citosina em embriões intactos de peixe-zebra

Aprenda a capturar 5-hidroximetilcitosina do DNA genômico usando β-glucosiltransferase e química click com biotina. Este método permite enriquecimento eficiente e independente de densidade para mapeamento epigenômico de alta vazão.

Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

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