Captura selectivo de 5-hydroxymethylcytosine a partir de DNA genómico

O objetivo geral deste procedimento é rotular e capturar cinco citocinas hidroxietil, uma modificação de DNA recém-descoberta que primeiro fragmenta o DNA genômico por sonicação e, em seguida, executa uma reação de beta gluc glicose transferase para transferir porções de glicose azida para cinco resíduos de hidroxietil citidina no DNA usando a química Qlik. Anexe um ligante de biotina salide ao grupo Azid para produzir DNA biotinilado. Em seguida, capture seletivamente os cinco fragmentos de DNA contendo hidroxietilcitidina nas esferas de estreptavidina de maneira independente da densidade.

Os cinco fragmentos de DNA enriquecidos com hidroxietilcitidina purificados podem ser usados para análises a jusante, incluindo sequenciamento de próxima geração. A principal vantagem desta técnica sobre a abordagem existente, como a abordagem baseada em anticorpos anticorpos, é que a captura de phy hidroxietilcitosina é independente da densidade PHY C. Eugene Lee, pesquisador associado sênior do laboratório, demonstrará esse protocolo.

Primeiro, sonicar o DNA genômico em uma faixa de tamanho adequada para a plataforma de sequenciamento de todo o genoma. Verifique a distribuição de tamanho do DNA genômico fragmentado em um gel 1%aose. Agora determine as quantidades iniciais de DNA com base na abundância de cinco hidroxietilcitabina no DNA genômico.

Como as cinco hidroxietilcitabinas variam significativamente entre os diferentes machos de tecido, a quantidade inicial de DN dependerá do nível de cinco C das amostras. Consulte a tabela um no manuscrito para exemplos. A primeira etapa do processo de marcação é uma reação de transferência básica para transferir AZA glicose Es para os cinco resíduos de C no DNA genômico fragmentado.

Combine os componentes da reação e misture pipetando, depois incube a reação enzimática em banho-maria a 37 graus Celsius. Por uma hora. Passe a reação por um kit de remoção rápida de nucleotídeos de caiaque usando 10 microgramas de DNA por coluna de eluição, o DNA com 30 microlitros de água por coluna e puxe as amostras na segunda etapa do processo de rotulagem.

Eu salify o vinculador bing está anexado ao grupo eza por clique em química. Para a reação de elação da biotina, adicione cinco microlitros de solução de trabalho conjugada de biotina por 30 microlitros de solução de DNA. Incubar em banho-maria a 37 graus Celsius por duas horas.

Processe a reação através de um caiaque, kit de remoção rápida de nucleotídeos e dilua o DNA em 100 microlitros. Em seguida, quantifique o DNA recuperado usando o NanoDrop. Comece com 50 microlitros de grânulos estreptocócicos adin dyna.

Realize três lavagens de acordo com as instruções do fabricante e colete as contas em um suporte magnético. Agora dilua o DNA biotinilado com 100 microlitros de tampão BNW duas vezes e adicione a amostra aos grânulos lavados. Incube por 15 minutos em temperatura ambiente com rotação suave.

Colha as contas com um suporte magnético e lave três vezes ao lado de eluir, o DNA. Adicione 100 microlitros de DTT 50 milimolar recém-preparada e incube em temperatura ambiente sob rotação suave por duas horas. Separe as contas usando um suporte magnético.

Em seguida, colete o EENT contendo o DNA alvo e carregue a amostra em uma coluna microbio spin six. Para remover o DTT, purifique ainda mais a amostra em uma coluna de cogeração e elua o DNA em 10 microlitros de tampão EB, quantifique o DNA usando um qubit, fluorímetro ou NanoDrop. Se a concentração for superior a 20 nanogramas por microlitro, este gel de 1% de arose mostra fragmentos sonicados de DNA, isolados de células IPS humanas.

Para aplicações downstream, como sequenciamento de próxima geração, o tamanho típico da fragmentação é de cerca de 300 pares de bases. Observe que quando a qualidade do DNA genômico é alta, os rendimentos de recuperação após as reações beta GT e biotina são de cerca de 60 a 70%No entanto, os rendimentos de pull down variam significativamente com diferentes tipos de tecido, dependendo dos cinco níveis de citocinas hidroxietilas das amostras. Normalmente, a eficiência de captura do DNA genômico cerebral é de cerca de quatro a 9% e, em alguns casos extremos, a eficiência pode chegar a 12%Para células ES, a eficiência média de captura é de cerca de dois a 4%em contraste com cerca de 0,5%Para células-tronco de neurônios, a menor deficiência observada até agora foi para DNA genômico de células cancerígenas.

Seguindo esses procedimentos, outros métodos, como a técnica de sequenciamento de próxima geração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como a distribuição em todo o genoma de cinco modificações de GC.