Name: A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em C. elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprenda a realizar leitura molecular da adaptação olfativa de longo prazo em C. elegans usando GFP::EGL-4 marcado em neurônios AWC. Este método permite avaliar rapidamente estados de adaptação e realizar triagens genéticas.

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Gostaríamos de agradecer a Scott Hamilton, e membros do laboratório O&#39;Halloran para a leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos também o nosso revisor anônimo pelos excelentes sugestões e comentários perspicazes.

1. Construção de GFP Tagged EGL-4 Animais Expressando <ol><li> Clonar o traducional fusão GFP :: EGL-4 sob o promotor para o gene odr-3 (2678 pb utilização directamente a montante do codão de iniciação): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. A expressão ODR-3 unidades promotoras nos pares de neurônios amphid: AWA, AWB; AWC, e fracamente em ASH. </li><li> Injectar o plasmídeo (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 do tipo selvagem (em N2) animais aos 50 ng / ul com os marcadores de co-injecção, utilizando técnicas padrão de transformação de linha de germe 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / uL), e (p) odr-1 :: DsRed 10 (25 ng / ul). O promotor odr-1 expressão unidades no AWC e pares AWB amphid neurônio, eo ofm-1 promotor expressão unidades nos coelomocytes. </li><li> Submeter os animais transgénicos que expressam os arrays extracromossómicos detalhados no Passo 1.2 para a Ultra Violeta (UV) / trimetilpsoraleno (TMP) protocolo de integração11. </li><li> Bleach sincronizar os 12 animais e cultivá-las em Nematóides de crescimento Media (NGM) placas contendo OP50 E. coli para a fase de L4. Lave L4 animais fora das placas NGM com tampão M9 para remover OP50 E. coli. </li><li> Remover o tampão M9 e adicionar 50-100 ul de 30 ug / ml de solução de trabalho de TMP para o sem-fim pellet no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Enrole a 1,5 ml em tubos de microcentrífuga de folha para bloquear a luz ambiente, e agitar suavemente num agitador rotativo durante 15 min na folha embrulhado tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Transfira os vermes na solução de TMP / worm para uma placa NGM grande unseeded. </li><li> Expor os vermes na placa NGM de UV 350 μJ (X100), utilizando um Stratalinker 2400. Em seguida, adicionar a uma placa de vermes NGM contendo OP50 e incubar no escuro durante 5 horas. </li><li> Escolha 50 vermes transgênicos para cerca de 10 placas semeadas (2-5 vermes cada placa). Transferência P0 é a placas novas a cada 24 horas durante 3 dias. </li><li> Escolha 250 F1 clonal umnimals (1 animal por placa). Clonar animais F2 2-4 fora de cada placa F1. Verifique animais F3 para procurar uma linha de transmissão de 100% olhando (p) ofm-1 :: GFP padrão de expressão sob um microscópio de dissecação fluorescente. </li><li> Outcross a linha final integrado (s) com os animais de tipo selvagem N2 5 vezes. Vamos remeter para a linha final integrada como pyIs500, eo GFP-tagged EGL-4 molécula como GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. Cultivo e Manutenção de Animais para Ensaios translocação nuclear <ol><li> Cultivar as pyIs500 animais a 25 ° C em placas de 10 cm padrão NGM (ver abaixo para receita) semeado com E. OP50 coli 13 (Figura 1). </li><li> No dia 1, escolher 4-5 L4 pyIs500 animais de placas cultivadas a 25 ° C para cinco separados 10 centímetros OP50 E. coli semeadas placas e incubar a 25 ° C (isto é, L4 4-5 animais por placa). </li><li> No dia 4, lavar adulto populations de pyIs500 animais fora das placas NGM grandes usando S-Basal tampão (veja abaixo a receita). Usar pipetas de vidro descartáveis ​​para transferência dos animais, como eles vão ficar ao lado de ponteiras plásticas. </li></ol> 3. Longo prazo Odor Induzida nucleares ensaios de translocação <ol><li> Lavar os pyIs500 animais 3 vezes em S-Basal para remover as bactérias. Não centrifugar animais entre as lavagens, mas sim que os animais possam resolver por gravidade em um tubo de microcentrífuga estacionário de 1,5 ml. É crítico para assegurar que todas as bactérias é removido, e que pates NGM estão livres de contaminação, como bactérias residuais irá afectar negativamente o resultado do ensaio de translocação. Além disso, descobrimos que a autoclavagem os tubos de 1,5 ml de microcentrífuga produz uma propriedade &quot;pegajosa&quot; nas paredes interiores do tubo que faz com que animais de ficar para os lados, e assim usar não autoclavados 1,5 microtubos ml. </li><li> Enquanto os animais estão se instalando entre as lavagens, fazer-se tele adaptação solução. Adicionam-se 100 ml de S-tampão basal para se formar um cilindro de 100 ml. Adicionar adaptando odor para o S-basal e selar o cilindro usando uma tira de Parafilm. Se se realizarem adaptação benzaldeído adicionar 7,5 ul de benzaldeído em 100 ml de S-basal, para adaptação butanona adicionar 11 ul de 2-butaone a 100 ml de S-basal. Inverta suavemente (não agite) o cilindro de se formar contendo S basais e odor 30 vezes para criar uma emulsão uniforme. </li><li> Após a lavagem final de S-basal, que os animais possam assentar e remover todo o líquido. Rotular um tubo &quot;+ ve&quot; ou &quot;adaptar&quot; e o outro tubo &quot;ve-&quot; ou &quot;unadapt&quot;. Em seguida, adicionar 1 ml da mistura de adaptação ao tubo de microcentrífuga de adaptação (+ ve) e adicionar 1 ml de S-Basal ao tubo de microcentrífuga unadapted controle (-ve). Tente para manter o número de animais entre 100 e 200 em cada um dos tubos. Com alguma prática, é possível estimar a quantidade aproximada de animais de um pellet por olho. </li><li> Coloque um tubo de 1,5 ml de microcentrífuga tampa protetoraa cada tubo (impede as tampas de abertura de estalo) e colocar os tubos num rotor durante 80 min. Nós descobrimos que a exposição odor entre 60 min e 80 min produz resultados semelhantes (ambos resultam em respostas de adaptação a longo prazo). No entanto, 80 minutos de exposição fornece resultados mais consistentes em nossas mãos. Assim, todos os nossos ensaios a longo prazo são padronizados de adaptação usando uma exposição de 80 min odor (fig. 2). </li><li> Após 80 min, lava-se 3 vezes em animais de S-basal. Permitir que os animais se contentar por gravidade entre cada lavagem. </li></ol> 4. Curto prazo Odor-nucleares induzidas ensaios de translocação <ol><li> No caso de curto-prazo adaptação odor, usar o mesmo protocolo como a longo prazo por ensaios de translocação odor induzidas (Passos 3,1-3,4), no entanto, em vez de incubação dos animais na adaptação pyIs500 odor por 80 min, utilizar uma exposição de 30 min . A quantificação do odor induzidas ensaios de translocação nuclear descritas abaixo (Passo 5) é o mesmo para a longo prazo e curto-tuloexposições m. </li></ol> 5. Marcando o Odor induzido evento de translocação nuclear <ol><li> Fazer almofadas de agarose a 2% contendo 5 mM de azida de sódio (NaN3) por dissolução de electroforese em gel de agarose em dH 2 0. Colocar uma única gota de agarose fundida contendo NaN 3 em uma lâmina de vidro de microscópio. Colocar imediatamente uma outra lâmina de microscópio de vidro sobre a primeira lâmina para achatar a gota de agarose fundida. Deixar durante 30 segundos, e então suavemente desmembrar o microscópio desliza deixando uma lâmina de microscópio com uma almofada de agarose plana de ~ 1 mm. </li><li> Após a lavagem final de S-basal, permitir que os vermes se estabelecer no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e remover todo o líquido. Em seguida, adicione os animais gota a gota sobre as almofadas de agarose de várias lâminas de microscópio. É importante manter o número de animais por slide para entre 50 e 100. Muitos animais por slide irá complicar pontuação e muitas vezes criar um brilho dispersando depois azul-luz de excitação. O excesso de líquido podeser mau a partir do bloco de agarose através de um pequeno Kim-wipe. Colocar um vidro de 0,5 milímetros tampa deslize para a almofada e deixar em repouso durante 2 min para permitir a NaN 3 a imobilizar os animais. Nota, os animais podem ser recuperados a partir das lâminas, depois de pontuação. Os animais recuperar da anestesia depois NaN 3 ~ h 1 se transferido para uma placa de NGM semeado em uma gota de tampão M9. </li><li> Neste ponto, é imperativo que cada experimentador conceber uma chave para controlar quais slide é o slide (+ ve) experimental e que deslizam é ​​o controle (-ve) slide, e passar os slides para outra pessoa que irá cegamente marcar o GFP: EGL-4 padrão de localização. Isto vai controlar a qualquer enviesamento experimentador. </li><li> Pontuação entre 50 e 100 animais por slide usando um microscópio vertical fluorescente com objetivos de ampliação de 10x, 40x e 63X e GFP / RFP filtros. Em primeiro lugar, localizar animais com a ampliação de 10X usando brilhante-campo de iluminação. Em segundo lugar, localizar o neurônio AWC desligando o bright-campo de iluminação e de utilização do filtro de RFP. Os (p) odr-1 :: unidades DsRed expressão em AWB e neurônios AWC. Os neurónios têm AWC distintivas ovais em forma de corpos celulares, em comparação com os corpos celulares AWB que são mais pequenos e de forma circular (Figura 2). </li><li> Uma vez que o corpo celular AWC foi localizado, mude para o filtro GFP e registrar a localização de GFP: EGL-4 como nuclear ou citoplasmática. Usando um contador permite o experimentador para manter olhando para o ocular ao marcar o slide. Nota: 5,1-5,5 passos são repetidos pelo menos 3 vezes em dias diferentes para produzir resultados estatisticamente significativos (Figuras 1-2). </li></ol> 6. Monitoramento GFP-tagged EGL-4 durante a recuperação de adaptação a longo prazo Odor <ol><li> Após o passo 3.5, dividir as populações de animais pyIs500 em alíquotas múltiplas e pontuação para GFP nuclear contra citoplasmática :: EGL-4 no CTA no ponto zero de tempo (isto é, após 80 min de exposição) e mpontos ultiple subsequentes de tempo (Figura 3). </li><li> Transferir tanto o controlo (-ve) e experimental (+ ve) animais usando pipetas de vidro descartáveis ​​em placas NGM. </li><li> Permitir que os animais recuperassem durante vários períodos de tempo e re-examinar a localização de GFP :: EGL-4in AWC em cada ponto de tempo como nos Passos 5,1-5,5. </li></ol> 7. Materiais Placas NGM: Para adicionar a 1 L 1 L DDH 2 0: 21 g de Bacto-Agar, 3 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,5 g de Bacto-peptona. Mídia autoclave. Depois de agar autoclavagem, o frio até a temperatura lê 54 ° C. Adicionar as soluções seguintes: 25 ml de tampão de fosfato de potássio 1M; 1 ml 1 M de sulfato de magnésio (MgSO 4), 1 ml de cloreto de cálcio 1 M (CaCl 2), 1 ml de colesterol em etanol (5 estoque mg / ml). 1 M Dibásico K 2 HPO 4 174,2 g / mol: Por 500 ml: Em 400 ml de DDQ 2 O, dissolver 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Ajuste o volume para 500 L com DDH 2 O. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de 500 ml estéril Filter. Monobásico 1 M KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Para 1 litro: Em 800 ml de DDQ 2 O, dissolver 136,1 g monobásico KH 2 PO 4. Ajustar o volume a 1 litro com DDQ 2 O. Filtrar esterilizar utilizando uma unidade de 500 ml estéril Filter. 1 M fosfato de potássio (K 3 PO 4), pH 6,0, tampão: Para 1 litro: Em uma unidade estéril de 1 L Filtro, adicionar 868 ml de 1 M monobásico KH 2 PO 4. Permita que a unidade para filtrar, em seguida, adicionar 132 ml de 1 M Dibásico K 2 HPO 4. Permita que a unidade para filtrar todo o líquido. Remover unidade de filtro e ajustar o pH a 6,0. Armazenar à temperatura ambiente. S-basal: para 1 L: adicione 50 ml 1M K 3 PO 4 Buffer, pH ~ 6,0 e 20 ml de NaCl 5M aq. Encha até 1 L comDDH 2 O. Autoclavar Solution. M9: Para 1 litro: 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H 2 O. Encha até 1 L com DDQ 2 0. Esterilizar em autoclave.

<ol><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803(1995).</li>
<li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+signals+modulate+olfactory+acuity%2C+discrimination%2C+and+memory+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Learning+and+Memory%22%5BJournal%5D)">Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans.</a> Learning and Memory. 4 (2), 179(1997).</li>
<li>Bargmann, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Neuron. 74 (3), 515(1993).</li>
<li>L'Etoile, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cyclic+GMP-dependent+protein+kinase+EGL-4+regulates+olfactory+adaptation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 regulates olfactory adaptation in C. elegans.</a> Neuron. 36, 1079-10 (2002).</li>
<li>Lee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+entry+of+a+cGMP-dependent+kinase+converts+transient+into+long-lasting+olfactory+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Nuclear entry of a cGMP-dependent kinase converts transient into long-lasting olfactory adaptation.</a> PNAS. 107 (13), 6016(2010).</li>
<li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+AWC-mediated+olfactory+plasticity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulators of AWC-mediated olfactory plasticity in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 5 (12), e1000761(2009).</li>
<li>O'Halloran, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cGMP+levels+affect+the+localization+of+EGL-4+in+AWC+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Changes in cGMP levels affect the localization of EGL-4 in AWC in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (2), e31614(2012).</li>
<li>Mello, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO Journal. 10, 3959-39 (1991).</li>
<li>Miyabayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+function+of+members+of+a+divergent+nuclear+receptor+family+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and function of members of a divergent nuclear receptor family in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 215, 314(1999).</li>
<li>L'Etoile, N. D., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+and+odor+discrimination+are+mediated+by+the+C.+elegans+guanylyl+cyclase+ODR-1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Olfaction and odor discrimination are mediated by the C. elegans guanylyl cyclase ODR-1.</a> Neuron. 25 (3), 575(2000).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451(1995).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Wormbook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> Wormbook. , (2006).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71(1974).</li>
<li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Positive+Butanone+Learning%2C+Short-term%2C+and+Long-term+Associative+Memory+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490(2011).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Hamamichi, S., Knight, A. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson%27s+Disease+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> J. Vis. Exp. (17), e835(2008).</li>
<li>Pittenger, C., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+general+mechanisms+for+long-lasting+plasticity%3A+Aplysia+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">In search of general mechanisms for long-lasting plasticity: Aplysia and the hippocampus.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358 (1432), 757(2003).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A entrada odor induzida nuclear de um GFP-tagged EGL-4 molécula aqui descrita proporciona uma leitura robusto molecular de adaptação olfactiva em C. elegans. O odor induzidas ensaios de translocação nuclear são simples e requerem apenas alguns dias de tempo de preparação. O animal pyIs500 que construímos para estes ensaios, expressa um marcador, que ilumina o neurónio AWC, bem como a expressão da GFP-tagged proteína EGL-4. Assim, sentimos que um experimentador com pouca ou nenhuma experiência de trabal...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> Agar Bacto </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Cloreto de Sódio </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Bacto Peptona </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Fosfato de Potássio Dibásico </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-tampão basal e NGM placas </td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-tampão basal e NGM placas </td></tr><tr><td> Kimwipes - Pequeno </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol a 100% </td><td> Escudo de ouro QuímicaCo. </td><td> 43196-115 </td><td> odores diluição para os ensaios de quimiotaxia </td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Sulfato de Magnésio </td><td> Biomedicals MP </td><td> 150136-500G </td><td> Placas NGM </td></tr><tr><td> Azida de sódio 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Anestésico </td></tr><tr><td> Agarose - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Agarose almofadas </td></tr><tr><td> Benzaldeído </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> Odor AWC </td></tr><tr><td> Butanona, ACS grau </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360.473-500ML </td><td> Odor AWC </td></tr><tr><td> Microtubos - 1,5 ml coloridas </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta Pasteur 5-3/4 copo descartável &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> Integração UV </td></tr><tr><td> Garrafa de vácuo Filter - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09-740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

a leitura molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; c. elegans</em

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Durante a estimulação sustentada neurónios sensoriais mais irá adaptar a sua resposta, diminuindo a sua sensibilidade ao sinal. A resposta de adaptação ajuda a atenção forma e também protege as células de mais de estimulação. Adaptação no circuito olfativo de C. elegans foi descrita pela primeira vez por Colbert e Bargmann 1,2. Aqui, os autores definiram parâmetros do paradigma adaptação olfativa, que eles usaram para projetar uma tela de genética para isolar mutantes defectivos na sua capacidade de adaptação a odores voláteis sentidas pelas células Asa Amphid tipo C (AWC) neurônios sensoriais. Quando wildtype C. elegans animais são expostos a um odor atraente sentiu-AWC 3 para 30 min irão adaptar a sua capacidade de resposta ao odor e ignorará o odor a adaptar de um ensaio de quimiotaxia de comportamento de ~ 1 hora. Quando wildtype C. elegans animais estão expostos a um odor AWC-sentia atraente para ~ 1 hora então eles vão ignorar o odor adaptação em achemotaxis ensaio comportamental para ~ 3 hr. Estas duas fases de adaptação olfativa em C. elegans foram descritos como de curto prazo de adaptação olfactiva (induzida após 30 min de exposição odor), e a longo prazo de adaptação olfactiva (induzida após 60 min de exposição odor). Mais tarde, o trabalho de L&#39;Etoile et al., 4 descoberto uma proteína quinase G (PKG) chamado EGL-4 que é necessário tanto para a adaptação a curto prazo e de longo prazo em neurônios olfativos AWC. A EGL-4 proteína contém uma sequência de localização nuclear que é necessário para respostas a longo prazo de adaptação olfativa, mas dispensáveis ​​para respostas de curto prazo de adaptação olfativa no 4 AWC. Ao marcar EGL-4 com uma proteína verde fluorescente, foi possível visualizar a localização da EGL-4 no AWC durante a exposição prolongada odor. Usando esta totalmente funcional GFP-tagged EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécula temos sido capazes de desenvolver um visor molecular de adaptação a longo prazo no olfactory 5 AWC. Usando este mleitura olecular de adaptação olfactiva temos sido capazes de realizar as duas telas para a frente e reverso genéticos para identificar os animais mutantes que exibem padrões defeituosos localização subcelular de GFP :: EGL-4 em 6,7 a AWC. Aqui descrevemos a: 1) a construção de GFP :: EGL-4 animais que expressam, 2) o protocolo para o cultivo de animais para os ensaios a longo prazo de translocação induzida odor nuclear, e 3) a pontuação do odor a longo prazo induzida evento de translocação nuclear e recuperação (re-sensibilização) da GFP nuclear :: EGL-4 estado.

Um exemplo do padrão de localização da GFP :: EGL-4in a CTA, antes e após exposição prolongada odor é mostrado na Figura 2. Antes da exposição prolongada odor, GFP :: EGL-4 está localizada no citosol da CTA (Figura 2B), e após 80 min de exposição odor GFP :: EGL-4 é localizada para o núcleo da CTA (Figura 2D). No nível comportamental, os animais com citosólica GFP :: EGL-4 em AWC são atraídas para uma fonte pontual de odor (Figura 2C representa graficam...

Descrevemos aqui uma leitura molecular de adaptação a longo prazo em olfactory<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. A Proteína Cinase G, EGL-4, é necessário para as respostas de adaptação estáveis ​​no par neurónio sensorial primário chamado AWC. Durante a exposição prolongada do odor EGL-4 transloca desde o citosol para o núcleo da AWC.

A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em<em&gt; C. elegans</em

Durante a estimulação sustentada, a maioria dos neurônios sensoriais adaptará sua resposta, diminuindo a sua sensibilidade ao sinal. A resposta de adaptação ajuda...

O objetivo geral deste vídeo é detalhar o desenvolvimento e a implementação de um indicador molecular da adaptação olfativa de longo prazo em *C. elegans*, que descreve o estado de adaptação de um animal. Isso é alcançado marcando uma proteína quinase G chamada EGL-4 com uma molécula de proteína verde fluorescente e expressando essa fusão proteica nas células amfícrinas do tipo C, ou neurônios AWC. Como segundo passo, animais que expressam a forma marcada com GFP da EGL-4 nos neurônios AWC são cultivados em placas de meio de crescimento para nematoides contendo a fonte alimentar bacteriana OP50. Em seguida, após quatro dias, uma população de animais é lavada das placas de cultivo e exposta a um odor detectado pelos AWC por 80 minutos, a fim de promover a adaptação olfativa de longo prazo.Os resultados mostram uma localização nuclear da GFP marcada com egg L quatro na AWC de animais adaptados em comparação com uma localização citoplasmática da GFP marcada com ALE quatro em animais-controle não adaptados. Ao criar uma cópia funcional dos campos ALE quatro, as duas proteínas verdes fluorescentes. Podemos acompanhar a localização subcelular de ACO quatro na AWC e descrever o estado comportamental do animal com base na localização da GFP. Esta ferramenta molecular permite-nos investigar rapidamente o papel de diversos mutantes ou tratamentos na modulação da atividade celular após estimulação neuronal prolongada.Este Protocolo inicia-se com a construção de animais marcados com GFP que expressam o estágio L4 de ovo, conforme descrito no procedimento escrito que acompanha este vídeo. A linhagem integrada final é denominada IS500 e a molécula de eggL4 marcada com GFP é denominada GFP::eggL4. Cultive os animais IS500 a 25 graus Celsius em placas NGM padrão de 10 centímetros, semeadas com bactérias OP50 de E. coli. No dia um, selecione quatro a cinco animais IS500 no estágio larval L4 de placas cultivadas a 25 graus Celsius e transfira-os para placas de 10 centímetros semeadas com OP50 de E. coli, utilizando um fio de platina pequeno, denominado "pick", para recolher e transferir os animais.Repita isso para mais quatro placas. Incube as placas a 25 graus Celsius no quarto dia. Lave populações adultas de 500 animais IS das placas NGM grandes adicionando tampão basal à placa e agitando suavemente.Isso desprende os animais da superfície da placa e os transfere para a solução tampão. Usando pipetas de vidro descartáveis, aspire os animais da placa e transfira-os para um tubo einor de 1,5 mililitro. Inicie os ensaios de translocação lavando 500 animais em s basil para remover as bactérias; não centrifugue.Animais entre lavagens. Em vez disso, permita que os animais sedimentem por gravidade em um tubo microcêntrifuga estacionário de 1,5 mililitro. É fundamental garantir que todas as bactérias sejam removidas e que as placas de NGM estejam livres de contaminação, pois bactérias residuais afetarão negativamente o resultado do ensaio de translocação.Repita a lavagem com S basil duas vezes. Prepare a solução de adaptação adicionando 100 mililitros de tampão S basil a um cilindro graduado de 100 mililitros. Se realizar a adaptação com aldeído, adicione 7,5 microlitros de aldeído a 100 mililitros de ESP basil e feche o cilindro usando uma tira de param.Inverta suavemente o cilindro graduado contendo manjericão e odor 30 vezes. Para criar uma emulsão uniforme, adicione animais a cada tubo, tentando manter o número de animais entre 100 e 200 em cada tubo. Com alguma prática, é possível estimar aproximadamente o número de animais em uma palheta a olho nu após os animais terem sedimentado.Após a lavagem com S basil, remova todo o líquido do tubo epi orph, rotule um novo tubo como positivo e o outro novo tubo como negativo. Em seguida, adicione um mililitro da mistura de adaptação ao tubo de microcentrífuga de adaptação positivo e adicione um mililitro de S basil ao tubo de controle negativo não adaptado. Coloque um protetor de tampa de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro em cada tubo e posicione os tubos em um rotador durante 80 minutos.Após 80 minutos, lave os animais três vezes em S basil, permitindo que os animais sedimentem pela gravidade entre cada lavagem. Prepare tampões de aros a 2% contendo azida de sódio a cinco milimolares dissolvendo aros de eletroforese em gel. Em água destilada, coloque uma única gota de mol e aros contendo azida de sódio sobre uma lâmina de microscópio de vidro; imediatamente, coloque outra lâmina de microscópio de vidro sobre a primeira lâmina para achatamento da gota de agros fundido.Deixe por 30 segundos e, em seguida, separe suavemente as lâminas de microscópio, deixando uma lâmina com uma almofada plana de aros de aproximadamente um milímetro. Neste momento, é imprescindível que cada pesquisador elabore uma chave para identificar quais lâminas correspondem ao experimento positivo e quais correspondem ao controle negativo. Depois que os vermes se acomodarem após a lavagem final em solução basal, remova todo o líquido e adicione os animais gota a gota sobre as almofadas de aros de várias lâminas de microscópio.É importante manter o número de animais por lâmina entre 50 e 100. Um número excessivo de animais por lâmina dificultará a análise e frequentemente causará um brilho disperso. Após a excitação com luz azul, o líquido em excesso pode ser removido do suporte aros utilizando um pequeno lenço de papel absorvente.Coloque uma lamínula de vidro de 0,5 milímetro sobre a preparação e deixe repousar por dois minutos para permitir que o azida sódio imobilize os animais. Em seguida, entregue as lâminas a outra pessoa que avaliará cegamente o padrão de localização da GFP no estágio de ovo L4. Isso controlará qualquer viés experimental na pontuação entre 50 e 100 animais por lâmina, utilizando um microscópio fluorescente ereto com objetivas de 10 x, 40 x e 63 x de aumento e filtros G-F-P-R-F-P.Primeiramente, localize os animais sob ampliação de 10 x utilizando iluminação de campo claro. Em seguida, localize o neurônio A WC desligando a iluminação de campo claro e utilizando o filtro RFP. O promotor odor.Um DS vermelho induz a expressão em neurônios WB e A WC. Os neurônios A WC possuem corpos celulares com formato oval distinto, em comparação com os corpos celulares WB, que são menores e de formato circular. Após localizar o corpo celular A WC, mude para o filtro GFP e registre a localização do GFP egg L quatro como nuclear ou citoplasmática.Usar um contador permite que o pesquisador continue olhando pelo ocular enquanto pontua a lâmina. Esse processo é repetido pelo menos três vezes em dias diferentes para gerar dados estatisticamente significativos. Um exemplo do padrão de localização da GFP ovo L quatro na A WC antes e depois da exposição prolongada a odor é mostrado antes da exposição prolongada a odor.GFP ovo L quatro está localizado no citosol da A WC após 80 minutos de exposição ao odor. GFP ovo quatro está localizado no núcleo da A WC ao nível comportamental. Animais com GFP ovo quatro no citosol em uma WC são atraídos para uma fonte pontual de odor.Este gráfico foi gerado a partir de resultados representativos de ensaios de quimiotaxia de animais não adaptados. Observe que o índice de QUIMIOTAXIA está próximo de um. Animais que exibem G-F-P-E-L nuclear quatro na A WC não são atraídos por uma fonte pontual do odor adaptador.Este gráfico foi gerado a partir de resultados representativos de ensaios de QUIMIOTAXIA de animais adotados. Observe que o índice de QUIMIOTAXIA está próximo de zero. Quando o ovo L4 entra no núcleo dos neurônios AWC, ele provoca alterações estáveis e de longa duração na fisiologia dos AWC, que persistem mesmo quando o ovo L4 já não está mais no núcleo.Após 80 minutos de exposição ao odor, os animais ignorarão uma fonte pontual do odor adaptativo, e essa adaptação persistirá mesmo após 120 minutos de recuperação. Após 80 minutos de exposição ao odor, observa-se GFP Egle quatro no núcleo do A WC. Esta entrada nuclear NU é tanto necessária quanto suficiente para induzir a adaptação de longo prazo no A WC. Após 120 minutos de recuperação, esses animais já não exibem GFP Eagle quatro no núcleo, mas ainda assim ignoram uma fonte pontual do odor aldeído adaptativo no nível comportamental, sem incluir os tempos de cultivo.Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em algumas horas, se for executada corretamente.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste artigo de vídeo, descrevemos um método novo que permite a construção de gradientes de odores com geometrias estável e controlável. Brevemente ilustrar como esses gradientes podem ser usados ​​para triagem de defeitos olfativa (anosmia total e parcial) e estudar características mais sutis de comportamento de quimiotaxia.

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A Leitura Molecular de adaptação a longo prazo olfativa em

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