Explantes blastômero para testar Compromisso destino celular durante o desenvolvimento embrionário

O método mostrado neste vídeo utiliza mapas de destino do embrião opus do estágio de clivagem para identificar a cultura de um único laser isoladamente para avaliar se o sulfato embrionário é determinado por instruções intrínsecas ou extrínsecas, os dois primeiros embriões celulares são coletados nos quais o primeiro sulco de clivagem corta a área levemente pigmentada do hemisfério animal. Esses embriões são cultivados quando atingem 16 a 32 células, a membrana vitel é então removida e as células vizinhas são dissecadas da célula escolhida. Por exemplo, o blaster dissecado é então transferido para uma depressão em uma cultura revestida com trado, bem cultivada.

Uma vez que o explan atinge o estágio desejado, ele é colhido para avaliar a expressão gênica ou proteica usando QPCR de hibridização in situ ou imuno-histoquímica. A principal vantagem dessa técnica sobre outras, como cultura, grandes grupos de células embrionárias ou órgãos no login, é que blasfemadores embrionários únicos, cujo destino de desenvolvimento é conhecido a partir de estudos de rastreamento de linhagem, podem ser cultivados sem fatores de crescimento adicionados ou a presença de células vizinhas. Assim, pode-se testar diretamente se fatores intrínsecos à célula instruem essa blasfêmia a se tornar o precursor de um tecido específico ou se requer sinais das células circundantes.

A demonstração visual deste método é crítica, pois a dissecação de Blairs e sua transferência para poços de cultura requerem manipulações delicadas sob o microscópio estereoscópico. Neste vídeo, usarei esse método para demonstrar se os mRNAs derivados da mãe influenciam as células em direção a um destino neural Trabalhando sob um microscópio de dissecação. Afie quatro conjuntos de pinças usando filme abrasivo Illumina.

Um par de pinças serve como backup caso uma ponta seja danificada durante o procedimento, autoclave todas as quatro pinças e armazene em um recipiente estéril, faça 500 mililitros cada de 0,1 x e 1,0 x de solução salina de barth modificada ou MBS e filtre-os. Armazene essas soluções a 14 a 18 graus Celsius por meses em um frasco com tampa de rosca de vidro, prepare 2% de aros de grau de eletroforese em 100 mililitros de uma cultura X. Autoclave média para dissolver o microondas aros, para liquefazer o aros quando for necessário na próxima vez que o aros estiver líquido.

Despeje cerca de 0,5 mililitros no fundo de cada poço de uma placa de cultura estéril de 24 poços. Isso evitará que os implantes grudem no plástico. Em seguida, despeje cerca de dois a três mililitros no fundo de duas placas de Petri de 360 milímetros e gire suavemente para distribuir.

Estes servirão como placas de dissecação e o aros evita que os embriões grudem no plástico. Uma vez que suas membranas são removidas, quando o aros esfria e endurece a chama, a ponta de um pasto de seis polegadas pipeta até derreter em uma bola. Reformule a bola brevemente e, em seguida, toque-a levemente na superfície do aros em um poço da placa de cultura.

Isso criará uma depressão rasa na qual a explicação X será colocada. Repita para cada poço na placa. Em seguida, encha cada poço da placa de cultura com um mililitro de um meio de cultura estéril.

Em seguida, encha o prato de dissecação com 0,1 XMBS para facilitar a separação do blaster. Uma vez preparadas as placas de dissecação, transfira os ovos fertilizados com as camadas gelatinosas removidas para placas de Petri de 100 milímetros contendo 0,5 x meio de cultura. Aqueles que não são usados imediatamente podem ser cultivados a 14 graus Celsius, enquanto o primeiro prato é pesquisado para dois embriões celulares.

Pesquise os embriões na primeira placa de Petri usando um microscópio de dissecação, usando uma pipeta de transferência de plástico, transfira cerca de 101 células e dois embriões celulares para uma placa separada preenchida com 0,5 x cultura. Média. Coloque a placa de Petri em uma incubadora de 14 graus Celsius. A capacidade deste ensaio de avaliar com precisão o potencial de desenvolvimento de uma célula depende da dissecação da blasfêmia correta com base em mapas de destino.

Portanto, é crucial escolher embriões com o padrão de pigmentação correto no estágio de duas células que, consequentemente, estejam em conformidade com os padrões regulares de clivagem. Conforme ilustrado aqui. As clivagens regulares geralmente ocorrem apenas em um lado do embrião.

Esses embriões ainda podem ser usados como doadores se a célula doadora for originária do lado regular. Quando os embriões atingirem o estágio de duas células, classifique aqueles em que o primeiro sulco de clivagem corta a área levemente pigmentada no hemisfério animal em um prato separado, classifique cerca de cinco vezes mais embriões do que serão dissecados. Estes serão os doadores para o explan.

Mantenha os dois embriões celulares restantes em um prato separado ao lado dos embriões doadores durante todo o procedimento para servir como controles irmãos para preparar o explan. Depois que os embriões forem classificados e dissecados, volte aos pratos da incubadora para encontrar mais embriões de uma célula e duas células. Como os embriões celulares levam cerca de 90 minutos para se dividir, isso pode ser feito até duas horas após a coleta dos óvulos.

Para preparar o explan, coloque de cinco a 10 embriões em uma placa de dissecação. Em seguida, posicione o primeiro embrião de forma que a membrana vitel transparente possa ser agarrada com uma pinça. Geralmente não pode ser visto, mas pode ser agarrado no pólo animal, onde é separado por um espaço peral claro acima da superfície do embrião.

Usando uma pinça afiada em uma mão, segure a uma distância do blaster que deve ser dissecado para evitar danificá-lo. Em seguida, com uma pinça afiada, na outra mão, segure a membrana perto da ponta da outra pinça e puxe suavemente em direções opostas para descascar a membrana. O embrião se achatará quando a membrana for removida.

Em seguida, pegue uma célula vizinha com a pinça e use esta célula como alça para que a célula a ser dissecada não seja tocada diretamente com a pinça na outra mão, puxe suavemente as células vizinhas restantes para longe da blasfêmia desejada. Se as células da linha média que compartilham o mesmo destino forem visadas, elas podem ser removidas juntas como um par. Finalmente, disseque a célula da alça.

Pegue o par de blasfêmia ou amere com uma pipeta de vidro estéril, evitando bolhas de ar e sucção excessiva. Coloque a ponta da pipeta de pastagem sob a superfície do meio de cultura em um poço da placa de cultura X explan, e expulse suavemente o blaster. Deve deslizar para a depressão rasa pela gravidade.

Blasfemadores de mais de um embrião podem ser combinados em um único explan, depositando-os na mesma depressão em uma cultura. Bem, repita este procedimento com os embriões restantes na placa de dissecação, um por um. Após cerca de 10 embriões, a placa de dissecção será preenchida com detritos celulares.

Quando isso ocorrer, mude para a próxima placa de dissecação. Depois que todas as dissecações forem feitas, verifique se o explan está nas depressões rasas. Caso contrário, eles podem ser empurrados suavemente para a depressão com uma alça de cabelo que foi esterilizada em 70% de etanol e implantes incubados secos ao ar em temperatura ambiente na bancada cerca de uma hora após a última dissecção.

Remova os detritos ao redor da explicação cicatrizada com uma cultura de pipeta de pastagem de vidro estéril. A placa de explanação a 14 a 20 graus Celsius ao lado da placa de Petri contendo os embriões de controle irmãos. Embriões irmãos indicarão o estágio de desenvolvimento do explanação blasfema.

Após cerca de uma a duas horas em cultura, os blastômeros explantados terão se dividido cerca de quatro vezes e descartado a maior parte dos detritos remanescentes das células vizinhas danificadas. Após 20 horas, eles formam pequenas bolas de células resistentes. Quando os irmãos atingirem o estágio de desenvolvimento desejado, colha o explicativo.

Esses explans sobrevivem muito bem, mesmo que algumas das células se desintegrem. Portanto, se houver uma massa turva na cultura, explore-a com um laço de cabelo ou fórceps para determinar se uma explicação saudável está enterrada dentro. Pegue a explicação em um pequeno volume de solução de cultura com um copo passando pela pipeta e expulse-a suavemente para um fixador ou tampão de lise apropriado para o ensaio a ser realizado.

Dois blasfemadores dorsais ou dois blasfemadores ventrais foram dissecados no estágio de 16 células e cultivados em um XMBS a 14 graus Celsius até que os embriões irmãos atingissem os estágios iniciais da placa neural. Cada amostra foi testada para a expressão de uma placa neural zigótica. Gene Sox dois por hibridização in situ, que é visto como o produto da reação azul.

Os resultados deste ensaio demonstram que a maioria dos blasfemadores animais dorsais, que são precursores da placa neural, podem expressar SOX dois de forma autônoma. Isso sem sinalização adicional de outras regiões do embrião. Aqueles explans que não expressam SOX dois podem ter sido identificados incorretamente no momento da dissecação.

Em contraste, nenhum dos blasfemadores animais ventrais, que são precursores da epiderme ventral, expressam SOX dois. Esses dados indicam que os blasfemadores animais dorsais têm uma capacidade intrínseca de formar tecido neural, enquanto os blasfemadores animais ventrais não observam. Algumas das explicações dorsais também alongaram uma morfologia indicativa da formação do mesoderma dorsal.

Esses blastômeros também são desbotados para formar o Noor no embrião intacto e uma cultura explanante expressa uma proteína marcadora de Noor para testar o efeito de alterar os níveis endógenos de um gene neural expresso pela mãe. Fox D cinco mRNAs foram injetados nos blasfemadores precursores ventrais de oito células. Como mostrado aqui, a maioria dos implantes ventrais expressou SOX dois.

Por outro lado, quando o nível endógeno de Fox D cinco foi reduzido pela injeção de oligonucleotídeos de morfo antisense nos blasters precursores dorsais de oito células, apenas alguns explanadores dorsais expressaram SOX dois. Esses experimentos indicam que a expressão materna de Fox D five desempenha um papel na capacidade intrínseca dos blasfemadores dorsais de adquirir um destino neural antes desse procedimento. Outros métodos, como injetar nos Blairs a serem dissecados mRNAs para ganho de função ou morfonucleotídeos antisense para perda de função, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais.

Por exemplo, quais genes estão envolvidos na capacidade intrínseca das células de dar origem a um destino específico de desenvolvimento? Além disso, pode-se testar fatores de sinalização conhecidos adicionando fatores purificados ao meio de cultura. Essa abordagem também pode ser usada para transplantar blasfemadores individuais para novos locais no embrião intacto.

Este teste se a célula transplantada está comprometida com seu destino de desenvolvimento original, esta informação é crítica para definir os mecanismos celulares pelos quais uma célula embrionária pluripotente se compromete a se tornar o precursor de um tecido definido.