Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias finas de tecido da retina da salamandra de tigre aquático e usá-las para gravações simultâneas de grampos de voltagem de células inteiras de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem. Isso é feito dissecando primeiro um olho de salamandra e isolando a retina em um pedaço de membrana de nitrocelulose. O segundo passo é cortar fatias finas de retina e posicioná-las na câmara de gravação.

Em seguida, a câmara é colocada em um estágio fixo vertical Microscópio e pipetas de patch são posicionados acima das fatias da retina. A etapa final é obter registros de células inteiras de uma célula horizontal ou bipolar pré-sináptica, fotorreceptora e pós-sináptica. Em última análise, gravações de células inteiras emparelhadas podem ser usadas para manipular a liberação sináptica e estudar as interações entre as células da retina.

A preparação de fatias de retina foi originalmente desenvolvida nos laboratórios de Frank Werblin e Sam Wu.Ao contrário das preparações de células únicas, as preparações de fatias mantiveram o contato ntic intacto e, ao contrário das preparações de retina de montagem inteira, o corte da retina expõe várias camadas da retina, permitindo acesso imediato a todos os diferentes tipos de células. Na retina Slice. As preparações podem ser usadas para registros eletrofisiológicos, incluindo gravação simultânea para várias células e para experimentos de imagem.

Esta preparação provou ser extremamente valiosa para estudar as interações sinápticas entre os neurônios da retina. Neste vídeo, descrevemos a preparação de fatias usando retina de salamandra tigre e enfatizamos alguns dos pequenos detalhes que podem fazer a diferença entre o sucesso e o fracasso. Comece este procedimento montando a câmara.

Coloque dois grânulos de graxa a vácuo espaçados de oito a 10 milímetros na câmara de gravação para formar um canal para a super fase e incorporar as fatias de retinol em uma segunda batida de graxa, alguns milímetros além de cada um desses dois grânulos de graxa para atuar como uma taxa para limitar o transbordamento. Em seguida, coloque um pequeno pedaço triangular de lenço umedecido Kim na extremidade da câmara para garantir o contato do fluido com o eletrodo de referência. Depois disso, pressione um pedaço de membrana de nitrocelulose contra o microscópio de vidro.

Deslize em duas pequenas esferas de graxa a vácuo. Para preparar o cortador de tecidos. Quebre uma lâmina de barbear de dois gumes em quatro pedaços.

Em seguida, prenda um deles ao braço de corte. Certifique-se de que a ponta da lâmina de barbear fique plana contra a câmara de gravação cortando uma fatia fina de papel de filtro de nitrocelulose. Em seguida, depois de sacrificar uma salamandra por decapitação, nuclear o olho usando uma pequena tesoura de Veneza sob o microscópio, cortar a pele que conecta o olho à órbita circundante.

Em seguida, puxe o olho para frente e deslize a tesoura por baixo dele para cortar os músculos oculares e o nervo óptico. Depois, coloque o olho enucleado em uma cama de algodão em um bloco de linóleo. Agora faça uma pequena incisão no centro da córnea com uma lâmina cirúrgica afiada.

Remova a córnea deslizando a tesoura de Veneza fina na incisão e estendendo o corte radialmente em direção à aura Serrata. Em seguida, corte circunferencialmente ao redor da aura serrata girando o bloco de linóleo ou o algodão entre os cortes. Depois de cortar toda a volta do olho, remova a córnea e o cristalino puxando-os para fora da lateral da ocular.

Transfira a ocular restante para uma superfície dura do bloco de linóleo umedecido com solução salina de anfíbios. Corte-o em terços com uma lâmina de barbear afiada em um movimento de serra fina para garantir que ele corte toda a esclera. Em seguida, coloque um ou dois pedaços de IUP na membrana de nitrocelulose com a superfície da retina voltada para baixo.

Mergulhe os pedaços restantes com solução salina adicional. Depois disso, coloque-os na geladeira para o caso de fatias adicionais serem cortadas posteriormente. Agora, pressione suavemente o pedaço de IUP contra a membrana de nitrocelulose com um par de pinças finas.

Mergulhe a membrana de nitrocelulose e a peça de IUP com várias gotas de solução salina anfíbia fria. Em seguida, drene a solução salina tocando em um pedaço de lenço Kim nas bordas da membrana de nitrocelulose e iup. Depois disso, mergulhe o IUP na membrana de nitrocelulose com várias gotas de solução salina anfíbia fria.

Novamente, posteriormente retire o epitélio pigmentar da retina da coróide da esclera para isolar a retina. Se a retina não tiver aderido firmemente, drene a solução salina com um lenço umedecido. Para puxar a retina com mais firmeza para a membrana de nitrocelulose, substitua a solução salina e repita o procedimento, se necessário.

Em seguida, encha a câmara com solução salina anfíbia fria. Transfira-o para o estágio do cortador de tecido. Em seguida, corte a retina e a membrana de nitrocelulose em tiras finas de 125 mícrons, pressionando a lâmina de barbear suavemente, mas com firmeza

Depois de cortar toda a retina em fatias, transfira as fatias da retina uma a uma para o canal principal da câmara de gravação. Para transferir uma fatia, segure uma tira de membrana no lugar enquanto desliza a câmara por baixo dela. Certifique-se de manter a fatia submersa quando estiver acima da parte central da câmara.

Incorpore as bordas da membrana de nitrocelulose nas tiras de graxa a vácuo e gire-a 90 graus. Para visualizar as camadas da retina, pressione a membrana de nitrocelulose contra a superfície do vidro, mesmo que não haja retina em todas as peças. Coloque tiras de membrana de nitrocelulose em intervalos regulares de cerca de milímetros para ajudar a quebrar a tensão superficial e, assim, melhorar o fluxo do fluido.

Continue a transferir as fatias uma a uma até que as fatias tenham sido colocadas ao longo de todo o comprimento do canal de perfusão. Depois que todas as fatias tiverem sido transferidas, mova a câmara de registro para o estágio de um microscópio de estágio fixo vertical. Conecte o fio do eletrodo de referência a um fio terra no ampcabeça do lifier stage.

Concentre-se nas fatias usando uma objetiva de imersão em água de longa distância de trabalho de 40 a 60 x. Próximo super. Funda as fatias a uma taxa de um milímetro por minuto com solução salina anfíbia borbulhada com oxigênio.

Conecte a linha de sucção à linha de saída da câmara. Em seguida, ajuste o fluxo de saída para equilibrar o fluxo de entrada girando a extremidade chanfrada da agulha de sucção ou movendo o lenço kim na extremidade da câmara para mais perto ou mais longe da abertura na ponta da agulha de saída. Examine as fatias sob luz fraca ou infravermelha.

Em seguida, identifique um par de células, um fotorreceptor e uma célula horizontal ou bipolar próxima para atacado. Gravando a pipeta Philip preparada antes dos experimentos com a solução intracelular, monte-a no porta-eletrodo. Em seguida, eleve ligeiramente a objetiva do microscópio.

Posicione a pipeta fotorreceptora abaixo da objetiva. Em seguida, abaixe-o para que a ponta fique posicionada logo acima da fatia e ajuste o foco simultaneamente. Para evitar ir longe demais.

Repita este procedimento com a segunda pipeta. Em seguida, verifique a resistência da pipeta com um pulso despolarizante de cinco a 10 milivolts. Ajuste qualquer deslocamento no nível de corrente da linha de base no amplificador.

Depois disso, aplique uma leve pressão positiva e, enquanto isso, posicione a pipeta pós-sináptica de forma que ela entre em contato com o corpo celular horizontal ou bipolar. Em seguida, posicione a pipeta pré-sináptica de forma que ela entre em contato com o corpo celular de um fotorreceptor de bastonete ou cone. Ao monitorar a liberação de resistência, a pressão positiva na pipeta pós-sináptica, às vezes a liberação de pressão positiva é suficiente para formar uma vedação de giga ohm.

Depois que a resistência da ponta aumentar para mais de 100 mega ohms, aplique um potencial de retenção de menos 60 milivolts. Então, quando um selo giga om for obtido, cancele o transiente de capacitância da pipeta. Usando o circuito de compensação de capacitância do amplificador patch clamp, repita o procedimento de teto com a pipeta fotorreceptora, aplicando um potencial de retenção de menos 70 milivolts e cancele a capacitância da pipeta.

Transitória, então rompa o remendo aplicando sucção a cada célula. A ruptura do remendo é evidente pelo aparecimento de transiente de capacitância de células inteiras. Agora, confirme a identidade da célula pós-sináptica fisiologicamente aplicando um flash de luz e fornecendo uma série de etapas de tensão de menos 120 a mais 40 milivolts em incrementos de 20 milivolts.

Para avaliar se as células estão sinapticamente conectadas, forneça um 25 a 100 milissegundos de 60 milivolts. Passo a despolarização para o fotorreceptor e procure correntes pós-sinápticas. No neurônio de segunda ordem, aqui estão os traços representativos das respostas à luz dos neurônios em fatias verticais da retina da salamandra.

A célula horizontal do cone e a célula bipolar desligada exibem uma corrente externa em resposta ao início da luz. A corrente interna proeminente após o flash de luz nas gravações de células horizontais e bipolares aqui é causada pelo aumento da liberação de glutamato dos fotorreceptores à medida que eles se despolarizam no deslocamento da luz. A célula bipolar on responde com uma corrente interna no início da luz, que resulta de um sinal invertendo a cascata de sinalização do receptor metabotrópico de glutamato e a ativação de um canal tripm.

Células horizontais e células bipolares podem ser distinguidas umas das outras por suas relações de tensão de corrente. As células horizontais normalmente têm relações de tensão de corrente lineares ou retificadoras internas com uma resistência de entrada inferior a 500 mega ohms, as células bipolares têm uma relação de tensão de corrente retificadora externamente e maior resistência de entrada entre 0,5 a dois giga ohms. Esta figura mostra os resultados representativos das gravações de um par de células horizontais de cone e um par de células bipolares de cone.

Em cada caso, a despolarização do cone para menos 10 milivolts de um potencial de retenção de menos 70 milivolts evocou uma corrente de cálcio dependente de voltagem no cone e uma rápida entrada pós-sináptica. Corrente na célula horizontal ou bipolar Fatia da retina. As preparações têm sido usadas em centenas de estudos sobre a anatomia e fisiologia da retina.

Eles são particularmente vantajosos para examinar as respostas de várias células simultaneamente, pois facilitam o registro e a imagem de várias células ao mesmo tempo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar a retina, cortar fatias finas de retina, posicioná-las na câmara de gravação e obter gravações por atacado de pares de eus sinapticamente conectados.