Name: Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Aprenda a preparar fatias retinianas de Ambystoma tigrinum para gravações whole-cell simultâneas de fotorreceptores e neurônios de segunda ordem. Este método permite estudar processamento sináptico em neurociência.

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Este trabalho foi financiado pela Research para prevenir a cegueira e National Institutes of Health concessão EY10542.

1. Fatias de retina Preparação <ol><li> Montar a câmara (desenho ilustrado na Figura 1). Colocar duas gotas de gordura vácuo, espaçadas de ~ 8-10 mm de distância, através da câmara de registo para formar um canal para superfusate e em que para incorporar as fatias de retina. Adicione uma segunda gota de graxa alguns milímetros mais longe além de cada uma dessas duas esferas de gordura para funcionar como um dique e limite de transbordamento. Coloque um pequeno pedaço triangular de kimwipe na extremidade da câmara de fluido para garantir o contacto com o eléctrodo de referência. </li><li> Pressione um pedaço de membrana de nitrocelulose (~ 5 x 10 mm, 0,8 mM poros) plana contra a lâmina de vidro em duas pequenas gotas de gordura vácuo. Evite gorduras directamente abaixo do centro da membrana de nitrocelulose, tal como esta pode impedir a aderência da retina. </li><li> Para preparar o cortador de tecidos, quebrar uma borda dupla lâmina de barbear em 4 pedaços e coloque um no braço corte. Corte uma fatia fina de nitrocellulose membrana para garantir que a aresta de corte da lâmina fique plana contra a câmara de registo e, portanto, limpa corta através da membrana de nitrocelulose. </li><li> Manter uma pequena proveta de solução salina anfíbio (Tabela 1) em gelo na estação de esvaziamento. </li><li> Salamandra eutanásia por decapitação. Hemisect a cabeça sagital e na medula através da medula espinhal. Coloque metade da cabeça em um pedaço de algodão umedecido com solução salina anfíbio em cima de um bloco de linóleo. A outra metade da cabeça pode ser embrulhado com uma toalha de papel húmido e armazenados a 4 ° C para utilização mais tarde no dia. </li><li> Enuclear o olho. Usando pequenas Vannas tesoura, corte a pele que liga o olho à órbita ao redor. Depois de libertar a frente do olho a partir do tecido orbital ao redor, puxar o olho para a frente e deslize a tesoura sob o olhar de cortar os músculos do olho e do nervo óptico, liberando o olho da órbita. </li><li> Coloque o olho enucleado em uma cama de algodão nobloco de linóleo. Descarte o meia cabeça. Corte o excesso de gordura orbital do fundo do olho. </li><li> Adicione uma pequena incisão no centro da córnea com uma lâmina de bisturi afiado. Retire a córnea deslizando Vannas multa tesoura na incisão e prorroga o corte radial em direção ora serrata. Cortar circunferencialmente em torno ora serrata rodando o bloco de linóleo ou o algodão entre os cortes. </li><li> Depois de cortar todo o caminho ao redor do olho, retire a córnea ea lente, puxando-os para fora do lado da ocular. Mova o ocular, resultando em uma superfície dura do bloco de linóleo umedecido com solução salina anfíbio. Corte-o em três partes com uma lâmina afiada, usando um movimento de corte fino para garantir que você tenha cortado todo o caminho através da esclera. </li><li> Coloque uma ou duas peças de ocular na membrana de nitrocelulose com a superfície da retina voltada para baixo. Mergulhe os pedaços restantes com soro fisiológico adicional e colocá-los na geladeira para a 4 ° C. </li><li> Gently pressione o pedaço de ocular contra a membrana de nitrocelulose, com uma pinça fina. Imergir a membrana de nitrocelulose e um pedaço ocular com várias gotas de solução salina fria e anfíbio blot com as bordas com kimwipe ajudando a retina para aderir. Mais uma vez, submergir a ocular e da membrana de nitrocelulose, com várias gotas de solução salina fria e anfíbio descascar a esclera / coróide / retina epitélio pigmentar da retina para isolar (que podem aparecer rosa devido à presença de não branqueada rodopsina). Se necessário, o corte do nervo óptico para libertar a retina. </li><li> Se a retina não aderiu firmemente, escorrer a solução salina com um Kimwipe para puxar a retina mais firmemente para baixo sobre a membrana de nitrocelulose. Substitua a solução salina. Repetindo, se necessário. </li><li> Encher a câmara com uma solução salina fria anfíbio e transferi-lo para a fase do fatiador de tecidos. Cortar a retina e a membrana de nitrocelulose em tiras finas, trabalhando a partir de uma extremidade para a outra, rodando o micrómetro vernierem incrementos de 125 uM. Pressione a lâmina de barbear gentil mas firmemente através da retina e membrana de nitrocelulose. </li><li> Transfira as fatias da retina movendo tiras de membrana de nitrocelulose para o canal principal da câmara de gravação. Retire uma tira de membrana livre e, em seguida, mantê-lo no lugar enquanto se move a câmara por baixo, tendo a certeza de manter as fatias submerso. Incorporar as arestas da membrana de nitrocelulose em tiras de graxa vácuo, rodá-los em 90 graus para visualizar as camadas da retina. </li><li> Pressionar a membrana de nitrocelulose fixa sobre a superfície do vidro. Mesmo se não houver retina em cada peça, coloque as tiras de membrana de nitrocelulose em intervalos regulares (~ 1 mm de distância) ao longo de todo o comprimento do canal de perfusão para ajudar a quebrar a tensão superficial e aumentar o fluxo de fluido. </li></ol> 2. Gravações Whole-cell emparelhados <ol><li> Depois de todas as fatias foram transferidas, mover a câmara de registo com o estágio de uma posição vertical, fixosmicroscópio palco e prender o cabo-eletrodo de referência. Concentre-se sobre as fatias usando uma distância longa de trabalho, imersão em água, 40-60X objetiva. O microscópio deve ser colocado sobre uma mesa de ar para amortecer as vibrações e encerrado numa gaiola de Faraday para reduzir a interferência eléctrica. </li><li> Superfuse as fatias continuamente a uma taxa de 1 ml / min com solução salina anfíbio borbulhar com 100% de O 2. Ligue a sucção, certificando-se de que a entrada e saída são equilibrados. Escoamento pode ser regulado pela rotação da extremidade biselada da agulha de aspiração ou movendo o kimwipe na extremidade da câmara mais perto ou mais longe da agulha de saída. A preparação pode ser mantido à temperatura ambiente ou arrefeceu-se com um dispositivo Peltier ou simplesmente definindo um bloco de gelo sobre a platina do microscópio. </li><li> Examinar fatias sob luz fraca ou de infra-vermelho e identificar um par de células - um fotorreceptor (haste ou cone) e células horizontais ou bipolar nas proximidades - alvo para a gravação de célula inteira. Hastes podem ser identified pelos seus corpos celulares de grandes e proeminentes rod-like segmentos exteriores (Figura 2A). Cones são menores do que as hastes e tem pequenos segmentos exteriores cónicos. Células bipolares e células horizontais somas estão na fila mais exterior de corpos celulares na camada nuclear interna (INL, Figuras 2B e 2C). </li><li> Antes de preparar fatias, use um extrator pipeta para a fabricação de micropipetas de vidro de borosilicato (1,2 mm de diâmetro externo, 0,95 mm de diâmetro interno com um filamento de vidro). A ponta de cada uma micropipeta deve ser ~ 1-2 microns de diâmetro. </li><li> Usando uma agulha de enchimento não-metálicos (por exemplo, uma fabricados a partir de uma seringa de 1 cc ou a Microfil), preencha pipetas com a solução intracelular (Tabela 1) e anexar ao suporte do eletrodo. </li><li> Eleve a objetiva do microscópio ligeiramente. Posicione a pipeta fotorreceptor abaixo do objetivo e, em seguida, baixá-lo de modo que a ponta é posicionada logo acima das fatias. Repita com tsegundo ele pipeta. </li><li> Ajuste qualquer deslocamento no nível atual da linha de base no amplificador. Verificar a resistência da pipeta com um pulso despolarizante mV 5-10. Nós normalmente utilizam pipetas que variam 10-15 mohms, o resultado a longo conicidade do veio e baixa osmolaridade das soluções anfíbio pipeta. Com as soluções de osmolaridade mamíferos superiores, estes mesmos pipetas apresentam valores de resistência de ~ 8-12 mohms. Embora tenhamos usado maiores diâmetros de ponta com os valores de resistência de 3-4 mohms em soluções de anfíbios, as vantagens proporcionadas por uma resistência de acesso inferior são compensados ​​por uma maior dificuldade de vedação para as membranas celulares e uma degradação mais rápida das correntes de cálcio e outro segundo mensageiro respostas de minúsculas. </li><li> Ao aplicar pressão ligeira, a posição positiva da pipeta pós-sináptico para que ele contata o corpo da célula horizontal ou bipolar. Em seguida, posicionar a pipeta pré-sináptica de modo que entra em contacto com o corpo da célula de uma haste ou cone de fotorreceptores. Gravações APPEar a ser mais estáveis ​​quando ponteiras contacto com o segmento interno em vez da soma, especialmente em cones. </li><li> Enquanto monitoriza a resistência, libertar a pressão positiva na pipeta pós-sináptica. Por vezes, a libertação de pressão positiva é suficiente para formar uma vedação gigaohm. Se não, aplicar sucção suave, com uma seringa de 1 ml ou por via oral. Após a resistência de ponta cresceu para&gt; 100 mohms, aplicar um potencial de realização de -60 mV. Após a obtenção de um selo gigaohm, nulo quaisquer transientes de capacitância pipeta e repita o procedimento de vedação para o fotorreceptor pipeta, aplicando um potencial de realização de -70 mV. </li><li> Rupture o patch usando sua boca ou uma seringa para aplicar o vácuo para cada célula de cada vez. Rods, cones, e células bipolares vontade tipicamente ruptura com sucção suave. Obtenção de configuração de célula inteira com uma célula horizontal pode exigir uma maior sucção (ou seja, com uma seringa de 3 cc), em combinação com fortes impulsos de tensão rápidas entregues com o &quot;zap&quot; fGolpe do amplificador de patch clamp. A ruptura da membrana e estabelecimento de configuração de célula inteira será evidente pelo aparecimento de fenómenos transitórios de capacitância de célula inteira. </li><li> Confirmar a identidade da célula pós-sináptica fisiologicamente pela aplicação de um flash de luz e entregando uma série de passos de voltagem de -120 a +40 mV em incrementos de 20 mV (Figuras 3 e 4). </li><li> Para avaliar se o par de células são ligados sinapticamente, entregar uma breve (25-100 ms), 60 mV passo despolarização ao fotorreceptor (a -10 mV, próximo do pico do cálcio tipo-L por voltagem de corrente) e procurar para as correntes de pós-sinápticos no segundo neurónio ordem (Figura 5). Um passo despolarizante forte deve provocar uma corrente de influxo rápido, transiente pós-sináptica na célula pós-sináptica bipolar horizontal ou OFF causada por uma explosão de libertação de vesículas do cone (Figura 5). </li></ol>

<ol><li>Thorpe, S. A., Glickstein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRam%C3%B2n+y+Cajal%2C+S+%22The+Structure+of+the+Retina%22">The Structure of the Retina</a>. , Charles C Thomas. Springfield, IL USA. (1972).</li>
<li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal+and+the+retina%3A+a+100-year+retrospective%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cajal and the retina: a 100-year retrospective.</a> Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).</li>
<li>Hartline, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+response+of+single+optic+nerve+fibers+of+the+vertebrate+eye+to+illumination+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina.</a> Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).</li>
<li>Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discharge+patterns+and+functional+organization+of+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Discharge patterns and functional organization of mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).</li>
<li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+riger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the riger salamander retina.</a> J. Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+between+neurons+in+living+slices+of+the+larval+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina.</a> J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).</li>
<li>Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM1%3A+the+endpoint+of+the+mGluR6+signal+transduction+cascade+in+retinal+ON-bipolar+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells.</a> Bioessays. 32, 609-614 (2010).</li>
<li>Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+pool+size+at+the+salamander+cone+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse.</a> J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).</li>
<li>Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2%2B+imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis. Exp. (59), e3345(2012).</li>
<li>Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-retinal+visual+cycle+required+for+rapid+and+complete+cone+dark+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation.</a> Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).</li>
<li>Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+synaptic+transfer+from+rods+and+cones+to+horizontal+cells+in+the+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina.</a> Neuroscience. 122, 785-798 (2003).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+the+vertebrate+retina%3A+general+principles+and+species-specific+variations%3A+the+Friedenwald+lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).</li>
<li>Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+cell+feedback+regulates+calcium+currents+and+intracellular+calcium+levels+in+rod+photoreceptors+of+salamander+and+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina.</a> J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).</li>
<li>Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+calcium+release+contributes+to+synaptic+release+from+mouse+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors.</a> Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).</li>
<li>Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+encoding+in+retinal+bipolar+cells%3A+current+vs.+voltage%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage.</a> Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).</li>
<li>Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+between+calcium+and+chloride+in+rod+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors.</a> J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).</li>
<li>Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-induced+calcium+release+in+rod+photoreceptor+terminals+boosts+synaptic+transmission+during+maintained+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).</li>
<li>Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+optical+and+electrophysiological+methods+for+recording+retinal+ganglion+cells+during+electrical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation.</a> Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li>
<li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

A preparação fatia retina provou ser muito útil para a análise dos circuitos e mecanismos utilizados pela retina para processar a informação visual. A capacidade de obter gravações de células inteiras simultaneamente de pré e pós-sináptica neurônios tem sido particularmente útil neste esforço. Gravações de células inteiras emparelhados são muito mais fácil de alcançar com fatias do que com os preparativos da retina plana de montagem, porque as diferentes camadas da retina estão expostos. Além disso, por causa de seus grandes neurônios da retina, salamandras têm uma longa história como uma preparação da retina e, portanto, fornecer um sistema modelo particularmente bem caracterizada. Com a prática, fatias saudáveis ​​de salamandra retina pode ser preparado regularmente. A poucos passos importantes podem fazer a diferença entre sucesso e fracasso. 1) Certifique-se de que a lâmina de barbear é montado sobre o cortador de tecidos de modo a que fique plana contra a superfície do vidro e fatias limpa embora tanto o tecido e underlyimembrana de nitrocelulose ng. Se você fez um corte limpo através da membrana de nitrocelulose, você deve ouvir um leve clique quando a lâmina atinge a superfície da lâmina de vidro. 2) Certifique-se que a retina tenha aderido à membrana de nitrocelulose. Caso contrário, a retina pode flutuar para longe da membrana durante qualquer passo dos procedimentos. 3) Não exponha as fatias cortadas ao ar, pois isso irá prejudicar muitas das células superficiais. 4) Certifique-se as fatias e membrana de nitrocelulose deitado contra a lâmina de vidro para que as camadas da retina são visíveis sob o microscópio de dissecação. 5) Equilibre as taxas de entrada e saída superfusate para evitar transbordamento da câmara de gravação. Isto impede que as alterações súbitas nos níveis de solução, o que pode causar movimentos abruptos de tecidos. 6) Selecção de um par de células saudáveis ​​próximos uns dos outros. Células com citoplasma lisa são mais saudáveis ​​do que as células com citoplasma granuloso. As células mais profundas na fatia são mais propensos a reter con sináptica intactacontatos. 7) Certifique-se que a ponta da pipeta não tenha quebrado ou roçou outro tecido ou detritos no meio do caminho para as células. 8) Verificar a resistência pipeta para garantir que ele não está entupido com detritos ou uma bolha, o que pode tornar difícil a obtenção de uma gravação de célula inteira de qualidade. Em vez de fixar a retina para papel de filtro de nitrocelulose, alguns investigadores incorporar retinas num bloco de agar e usar um vibratome para cortar fatias de retina. Apesar de não ter tentado esta abordagem, Kim et al. 11 discutir as vantagens de ambas as abordagens. Em sua experiência, a abordagem baseada em agar fornece um rendimento mais consistente de fatias planas com camadas da retina bem delineados, mas abordagem baseada em papel do filtro produz fotorreceptores saudáveis. Cones e bastonetes são responsáveis ​​pela transdução de luz em mudanças no potencial da membrana. Com gravações emparelhadas, o potencial de bastonetes ou cones membrana pode ser manipulated diretamente e assim a capacidade para gerar respostas de luz, embora útil para a identificação de tipos de células, pode não ser essencial. Por isso, muitas vezes preparar fatias de luz branca. No entanto, mesmo quando preparado sob iluminação brilhante, salamandra neurónios da retina pode gerar grandes respostas de luz, tal como ilustrado pelas respostas na FIG. 3. Isto é em parte devido a um número relativamente grande reservatório de cromóforo no grande volume de segmento externo, mas também podem reflectir a capacidade das células para regenerar Müller 11-cis-retinal para cones 12. Para obter respostas totalmente claras de adaptação ao escuro, pode-se preparar as fatias sob iluminação infravermelha. Para dissecções sob luz infravermelha, damos GenIII intensificadores de imagem (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) para as oculares do microscópio de dissecação e iluminar o tecido com uma lanterna LED infravermelho. Para cortar e outros procedimentos que não são realizados sob o microscópio de dissecação, nós empregamos uma head-mounted image intensificador. Para a colocação das pipetas de correção, nós visualizamos fatias usando uma câmera CCD infravermelho sensível (por exemplo, Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) montado na vertical, microscópio de fase fixa. Com estas precauções, pode-se obter respostas haste exibindo sensibilidade única fóton 6, 13. Uma limitação do trabalho em fatias retina é que os longos processos celulares de campo grandes neurônios da retina pode perder muitos de seus dendritos durante o processo de corte. Preparações fatia retinianas são, portanto, mais úteis para o estudo da fisiologia de células em que os contactos sinápticos envolvem processos para fechar o corpo da célula. Retinas de anfíbios e mamíferos compartilham muitos dos mesmos tipos de células e utilizar mecanismos fisiológicos semelhantes 14-16. Enquanto salamandra retina é um bom modelo para muitos aspectos da retina dos mamíferos, uma diferença importante parece ser a presença de uma via de vareta dedicada em mamíferos que involves contatos de células especializadas haste bipolares em células amácrinas AII 14. Uma limitação adicional da retina salamandra é o pequeno número de ferramentas genéticas desenvolvidas especificamente para esta espécie. No entanto, os anticorpos e reagentes que têm como alvo regiões shRNA bem conservados em outras espécies podem ser utilizadas com êxito na salamandra, como podem muitos inibidores de moléculas pequenas e reagentes peptídicos. Além disso, com algumas modificações na técnica, as fatias da retina podem ser preparados a partir de outras espécies em que algumas dessas ferramentas são mais prontamente disponíveis. Para além da sua utilidade para o registo de células inteiras emparelhado, a preparação de retina salamandra fatia é também compatível com uma variedade de outras abordagens. Como discutido acima, as fatias da retina pode ser usado para estudar as respostas de luz em combinação com vários protocolos de fixador de tensão 17. Neurónios da retina pode também ser carregada com corantes fluorescentes sensíveis ao Ca2 +, Cl -, ou Na+ Introduzido através da pipeta patch ou por banho-aplicação 15,18-20. Um péptido fluorescente que se liga à fita 21 sináptica pode ser introduzido através da pipeta patch e utilizado para imagiologia da fita 10, ou, quando conjugado com fluoresceína, para intensamente e selectivamente danificar a fita 22. Temos também utilizado fatias de retina em combinação com pontos quânticos para monitorar os movimentos dos canais de cálcio individuais em haste e cone terminais sinápticos 23. Assim, a fatia da retina vertical é uma preparação experimental versátil para o estudo dos mecanismos básicos sinápticas e as funções de processamento única realizadas na primeira sinapse, a via de sinalização visual.

<table><tbody><tr><td>Fatiador de tecidos</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de barbear de borda dupla</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de nitrocelulose</td><td>Millipore</td><td>AAWP02500</td><td>Tipo AAWP 0,8 mm poro</td></tr><tr><td>Pipetas de vidro borossilicato</td> World <td>Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>1,2 mm OD 0,95 mm ID</td></tr><tr><td>Ag/AgCl pellet</td><td>Warner</td><td>E206</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5 Agulha de</td><td>enchimento de 34 ga., 67 mm de comprimento</td></tr></tbody></table>

gravações whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio retinal slice preparação

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Uma das tarefas centrais da retina neurociência é compreender os circuitos de neurônios da retina e como essas conexões são responsáveis ​​por moldar os sinais transmitidos para o cérebro. Os fótons são detectados na retina por haste e cone fotorreceptores, que convertem a energia em um sinal elétrico, transmiti-lo a outros neurônios da retina, onde é processado e comunicado a alvos centrais do cérebro através do nervo óptico. Primeiros insights importantes sobre os circuitos da retina e processamento visual veio dos estudos histológicos de 1,2 Cajal e, posteriormente, a partir de registros eletrofisiológicos da atividade spiking de células ganglionares da retina - as células da retina 3,4 de saída. Uma compreensão detalhada do processamento visual na retina requer uma compreensão da sinalização em cada passo na via de fotorreceptores de células ganglionares da retina. No entanto, muitos tipos de células da retina são burIED profunda no tecido e, portanto, relativamente inacessível para a gravação eletrofisiológico. Esta limitação pode ser superada por trabalhar com fatias verticais, nas quais as células que residem dentro de cada uma das camadas da retina são claramente visíveis e acessíveis para gravação electrofisiológico. Aqui, descrevemos um método para fazer seções verticais de retinas de larval salamandras tigre (Ambystoma tigrinum). Embora esta preparação foi originalmente desenvolvida para as gravações com microeléctrodos afiadas 5,6, é descrito um método para a gravação de fixação de tensão dupla de células inteiras a partir de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem em que manipulam o potencial de membrana do fotorreceptor enquanto grava simultaneamente pós- as respostas sinápticas em células horizontais ou bipolar. Os fotorreceptores da salamandra tigre são consideravelmente maiores do que os das espécies de mamíferos, tornando esta uma preparação ideal para realizar tsua abordagem experimental tecnicamente desafiador. Estas experiências são descritas com um olho para investigar as propriedades de sinalização da fita sináptica - uma estrutura sináptica especializada encontrado em um apenas um punhado de neurônios, incluindo a haste e cone fotorreceptores, que é bem adequado para a manutenção de uma elevada taxa de tônico liberação de neurotransmissores 7 , 8 - e como ela contribui para as propriedades de sinalização únicos deste primeiro sinapse da retina.

Vestígios representativos das respostas de luz a partir de neurónios em fatias verticais de salamandra retina são mostrados na Figura 3. O cone, célula horizontal e OFF célula bipolar tudo exibir uma corrente externa em resposta ao aparecimento de luz. O destaque atual para dentro após o flash de luz nas gravações de células horizontais e bipolar é causada pelo aumento da liberação de glutamato de fotorreceptores como despolarizar no deslocamento da luz. A ON célula bipolar responde com uma corrente interna no início da luz resultante de um receptor de glutamato metabotrópicos cascata de sinalização e ativação de canais TRPM1 9 sign-inversora. Células horizontais e células bipolares podem ser distinguidas uma da outra pela sua relações IV (Figura 4). Células horizontais têm tipicamente uma resistência de entrada de cadeia linear ou de rectificação para dentro e IV baixa (&lt;500 mohms, Figura 4A), enquanto as células bipolares têm uma elevada resistência de entrada(0,5-2 GÊ) e exteriormente, retificando I - V (Figura 4B) A Figura 5 mostra resultados representativos a partir de gravações de um par de células cone-horizontal (Figura 5A) e cone-OFF par célula bipolar (Figura 5B).. Em cada uma, o cone despolarizantes para -10 mV a partir de um potencial de manutenção de -70 mV evocada uma corrente no interior do cone e EPSC rápida na célula horizontal ou bipolar cálcio dependentes da voltagem. Esta forte estímulo é suficiente para esvaziar o conjunto prontamente libertável de ~ 20 de cada fita de vesículas sinápticas, resultando numa EPSC de ~ 47 pA / fita 10. O EPSC célula horizontal na Figura 5A foi 232 pA, sugerindo que recebeu 5 contatos fita do cone pré-sináptico. A estimativa similar do 178 pA EPSC no celular desligado bipolar (Figura 5B) sugere que ele recebeu 4 contatos fita do cone pré-sináptico. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Anfíbio salina </td><td> Pipeta pré-sináptico </td><td> Pipeta Postsynaptic </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3,5 mM </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1,8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> 5mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-Glutamato * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-gluconato ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> Cloreto Tetraethylammonium </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mm </td><td> 9 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5mM </td><td> 5mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolaridade **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutamato é feita por neutralização de 40 mM de ácido L-glutâmico, com 40 mM na solução de CsOH pipeta. ** Um estoque de Cs-gluconato de 1 M é feita por neutralizar uma solução de CsOH com 45-50% de ácido D-glucônico. *** O pH deve ser ajustado com NaOH para a solução extracelular e CsOH para as soluções de pipeta. **** Mantendo a osmolaridade das soluções de pipeta logo abaixo da temperatura da solução extracelular impede inchaço celular e aumenta a longevidade da gravação. Mesa1. Componentes e parâmetros para as soluções intra e extracelulares padrão utilizado neste protocolo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figura 1. Desenho da câmara de gravação. (AC) Top, lateral e cortante vistas da câmara de gravação mostrando dimensões. A câmara é usinado a partir de um pedaço de espessura 2 mm de acrílico. (D) câmara montada. Superfusate entra na câmara através de um comprimento de 10 cm de Teflon tubo (tubo de entrada; tipo 24LW). Superfusate é removido por aplicação de sucção leve a um tubo de metal de calibre 20 chanfrada, no outro lado da câmara. Adjacente a este tubo de saída é um eléctrodo de referência de Ag / AgCl de sedimento. A vantagem deste eléctrodo de referência está ligada à entrada de referência do headstage. Um pequeno triângulo de Kimwipeé colocada sobre o eléctrodo de referência para mantê-lo em contacto com a solução e regular o fluxo de solução para dentro do tubo de saída. A base da câmara é formada por colocação de uma lâmina de microscópio de vidro nas bordas de recesso da câmara. O slide é mantido no lugar com uma gota de graxa de vácuo. As tiras de membrana de nitrocelulose com as fatias de retina são incorporados nos grânulos de graxa de vácuo, que formam um canal para a solução de fluxo. Antes de fazer fatias, uma x 10 mm pedaço de membrana de nitrocelulose 5 é fixada à câmara com duas pequenas gotas de gordura vácuo. Um pedaço da ocular é colocada lado vítrea para baixo nesta membrana de nitrocelulose e levantou fora uma vez que os adere retina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figura 2. Pares de células cheias de corante em vepreparação fatia rtical. A) Imagens de uma vara e célula horizontal sinapticamente acoplado que foram preenchidos com contraste corantes fluorescentes introduzidas através da pipeta de patch durante a gravação de célula inteira simultânea. Lúcifer amarelo (2 mg / ml), foi incluída na solução pipeta haste (amarelo) e sulfarhodamine B (1 mg / ml), foi incluída na solução pipeta célula horizontal (roxo). Imagens fluorescentes foram capturados usando um disco giratório microscópio confocal (Perkin Elmer Ultraview LCI) equipado com uma câmera CCD refrigerado (Orca ER) e subiu ao microscópio palco fixo (Nikon E600 FN com 60X, 1,0 NA objetiva de imersão em água). Estas imagens foram sobrepostas em imagens de campo claro das fatias da retina correspondentes usando o Adobe Photoshop. B) Imagens de um cone e sinapticamente acoplados OFF célula bipolar. O terminal do axônio da célula bipolar ramifica no exterior sublamina (S1) da camada plexiforme interna, perto da fronteira com a camada nuclear interna. <strong&gt; C) Imagens de um cone e células horizontal sinapticamente acoplado. Note-se que os terminais de cone são consideravelmente maiores do que o terminal axonal da haste. Embora as células horizontais pode ser identificada pela forma oblonga dos seus corpos celulares, corpos celulares de células e-NO bipolares do tipo fora na INL não pode ser facilmente distinguida antes da gravação. No entanto, pode ter como alvo uma deslocado cone expulsos células bipolares, que têm corpos celulares no ONL e podem ser distinguidas a partir de cones com a ausência dos segmentos interno e externo. A barra de escala é de 20 mM. <img alt="Figura 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figura 3. Correntes registrados no braçadeira de tensão a partir de quatro diferentes neurônios da retina em resposta a um 500 ms flash brilhante de luz branca de luz evocada. Cone O (A), a célula horizontal <strong&gt; (B), e fora da célula bipolar (C) todos responderam à luz com uma corrente para fora. (D) A na célula bipolar respondeu ao mesmo estímulo de luz com uma corrente para dentro. O ruído da linha de base exibido pela célula bipolar off (C) reflete uma liberação contínua de vesículas sinápticas na escuridão que diminui quando fotorreceptores hiperpolarizar na luz. As respostas a estas quatro células foram obtidas em gravações separadas usando fatias preparadas de acordo com a luz branca. A intensidade do estímulo de luz branca utilizada nestes exemplos produzido respostas em células horizontais e bipolares equivalentes a 580 nm, fluxo de fótons de 1 x 10 5 fotões / sec / 2 mM. <img alt="Figura 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Figura 4. Relações corrente-tensão (IV) de horizontal células bipolares e desligado. (A) O painel de topo, as correntes de membrana evocados por uma série de passos de voltagem de 150 mseg, de -120 a +40 mV aplicada em incrementos de 20 mV (painel inferior) para uma célula horizontal. Células horizontais tipicamente têm uma baixa resistência de entrada e as relações lineares ou interiormente rectificação IV. (B) a relação IV de uma célula bipolar fora em resposta a uma série de degraus de tensão. Células bipolares têm uma maior resistência de entrada e um IV exteriormente rectificação, devido à ativação de correntes de voltagem-dependentes de potássio. <img alt="Figura 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figura 5. Exemplos de gravação de dados emparelhados. (A) Gravação do cone corrente de cálcio voltagem-dependentes (Cone I Ca </sub&gt;) em resposta a um passo de 100 ms a -10 mV a partir de um potencial de manutenção de -70 mV (Cone m V). Vazamento e capacitância transientes foram subtraídos usando um vazamento protocolo subtração P / 8. Uma corrente rápida excitatório pós-sináptico (EPSC; HC PSC) foi gravada simultaneamente a partir de uma célula horizontal, mostrando que estas duas células são sinapticamente acoplado (B) Uma EPSC foi registada numa célula bipolar fora em resposta ao mesmo estímulo noutro. cone.

Nós descrevemos a preparação de fatias finas de retina aquático salamandras tigre (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) E explicar como usamos essas fatias para estudar o processamento sináptico na retina através da obtenção de gravações braçadeira de tensão de célula inteira dupla de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem.

Gravações Whole-cell simultâneas de fotorreceptores e os neurônios de segunda ordem em um anfíbio Retinal Slice Preparação

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

O objetivo geral deste procedimento é preparar fatias finas de tecido da retina da salamandra de tigre aquático e usá-las para gravações simultâneas de grampos de voltagem de células inteiras de fotorreceptores e células horizontais e bipolares de segunda ordem. Isso é feito dissecando primeiro um olho de salamandra e isolando a retina em um pedaço de membrana de nitrocelulose. O segundo passo é cortar fatias finas de retina e posicioná-las na câmara de gravação.Em seguida, a câmara é colocada em um estágio fixo vertical Microscópio e pipetas de patch são posicionados acima das fatias da retina. A etapa final é obter registros de células inteiras de uma célula horizontal ou bipolar pré-sináptica, fotorreceptora e pós-sináptica. Em última análise, gravações de células inteiras emparelhadas podem ser usadas para manipular a liberação sináptica e estudar as interações entre as células da retina.A preparação de fatias de retina foi originalmente desenvolvida nos laboratórios de Frank Werblin e Sam Wu.Ao contrário das preparações de células únicas, as preparações de fatias mantiveram o contato ntic intacto e, ao contrário das preparações de retina de montagem inteira, o corte da retina expõe várias camadas da retina, permitindo acesso imediato a todos os diferentes tipos de células. Na retina Slice. As preparações podem ser usadas para registros eletrofisiológicos, incluindo gravação simultânea para várias células e para experimentos de imagem.Esta preparação provou ser extremamente valiosa para estudar as interações sinápticas entre os neurônios da retina. Neste vídeo, descrevemos a preparação de fatias usando retina de salamandra tigre e enfatizamos alguns dos pequenos detalhes que podem fazer a diferença entre o sucesso e o fracasso. Comece este procedimento montando a câmara.Coloque dois grânulos de graxa a vácuo espaçados de oito a 10 milímetros na câmara de gravação para formar um canal para a super fase e incorporar as fatias de retinol em uma segunda batida de graxa, alguns milímetros além de cada um desses dois grânulos de graxa para atuar como uma taxa para limitar o transbordamento. Em seguida, coloque um pequeno pedaço triangular de lenço umedecido Kim na extremidade da câmara para garantir o contato do fluido com o eletrodo de referência. Depois disso, pressione um pedaço de membrana de nitrocelulose contra o microscópio de vidro.Deslize em duas pequenas esferas de graxa a vácuo. Para preparar o cortador de tecidos. Quebre uma lâmina de barbear de dois gumes em quatro pedaços.Em seguida, prenda um deles ao braço de corte. Certifique-se de que a ponta da lâmina de barbear fique plana contra a câmara de gravação cortando uma fatia fina de papel de filtro de nitrocelulose. Em seguida, depois de sacrificar uma salamandra por decapitação, nuclear o olho usando uma pequena tesoura de Veneza sob o microscópio, cortar a pele que conecta o olho à órbita circundante.Em seguida, puxe o olho para frente e deslize a tesoura por baixo dele para cortar os músculos oculares e o nervo óptico. Depois, coloque o olho enucleado em uma cama de algodão em um bloco de linóleo. Agora faça uma pequena incisão no centro da córnea com uma lâmina cirúrgica afiada.Remova a córnea deslizando a tesoura de Veneza fina na incisão e estendendo o corte radialmente em direção à aura Serrata. Em seguida, corte circunferencialmente ao redor da aura serrata girando o bloco de linóleo ou o algodão entre os cortes. Depois de cortar toda a volta do olho, remova a córnea e o cristalino puxando-os para fora da lateral da ocular.Transfira a ocular restante para uma superfície dura do bloco de linóleo umedecido com solução salina de anfíbios. Corte-o em terços com uma lâmina de barbear afiada em um movimento de serra fina para garantir que ele corte toda a esclera. Em seguida, coloque um ou dois pedaços de IUP na membrana de nitrocelulose com a superfície da retina voltada para baixo.Mergulhe os pedaços restantes com solução salina adicional. Depois disso, coloque-os na geladeira para o caso de fatias adicionais serem cortadas posteriormente. Agora, pressione suavemente o pedaço de IUP contra a membrana de nitrocelulose com um par de pinças finas.Mergulhe a membrana de nitrocelulose e a peça de IUP com várias gotas de solução salina anfíbia fria. Em seguida, drene a solução salina tocando em um pedaço de lenço Kim nas bordas da membrana de nitrocelulose e iup. Depois disso, mergulhe o IUP na membrana de nitrocelulose com várias gotas de solução salina anfíbia fria.Novamente, posteriormente retire o epitélio pigmentar da retina da coróide da esclera para isolar a retina. Se a retina não tiver aderido firmemente, drene a solução salina com um lenço umedecido. Para puxar a retina com mais firmeza para a membrana de nitrocelulose, substitua a solução salina e repita o procedimento, se necessário.Em seguida, encha a câmara com solução salina anfíbia fria. Transfira-o para o estágio do cortador de tecido. Em seguida, corte a retina e a membrana de nitrocelulose em tiras finas de 125 mícrons, pressionando a lâmina de barbear suavemente, mas com firmeza.Depois de cortar toda a retina em fatias, transfira as fatias da retina uma a uma para o canal principal da câmara de gravação. Para transferir uma fatia, segure uma tira de membrana no lugar enquanto desliza a câmara por baixo dela. Certifique-se de manter a fatia submersa quando estiver acima da parte central da câmara.Incorpore as bordas da membrana de nitrocelulose nas tiras de graxa a vácuo e gire-a 90 graus. Para visualizar as camadas da retina, pressione a membrana de nitrocelulose contra a superfície do vidro, mesmo que não haja retina em todas as peças. Coloque tiras de membrana de nitrocelulose em intervalos regulares de cerca de milímetros para ajudar a quebrar a tensão superficial e, assim, melhorar o fluxo do fluido.Continue a transferir as fatias uma a uma até que as fatias tenham sido colocadas ao longo de todo o comprimento do canal de perfusão. Depois que todas as fatias tiverem sido transferidas, mova a câmara de registro para o estágio de um microscópio de estágio fixo vertical. Conecte o fio do eletrodo de referência a um fio terra no ampcabeça do lifier stage.Concentre-se nas fatias usando uma objetiva de imersão em água de longa distância de trabalho de 40 a 60 x. Próximo super. Funda as fatias a uma taxa de um milímetro por minuto com solução salina anfíbia borbulhada com oxigênio.Conecte a linha de sucção à linha de saída da câmara. Em seguida, ajuste o fluxo de saída para equilibrar o fluxo de entrada girando a extremidade chanfrada da agulha de sucção ou movendo o lenço kim na extremidade da câmara para mais perto ou mais longe da abertura na ponta da agulha de saída. Examine as fatias sob luz fraca ou infravermelha.Em seguida, identifique um par de células, um fotorreceptor e uma célula horizontal ou bipolar próxima para atacado. Gravando a pipeta Philip preparada antes dos experimentos com a solução intracelular, monte-a no porta-eletrodo. Em seguida, eleve ligeiramente a objetiva do microscópio.Posicione a pipeta fotorreceptora abaixo da objetiva. Em seguida, abaixe-o para que a ponta fique posicionada logo acima da fatia e ajuste o foco simultaneamente. Para evitar ir longe demais.Repita este procedimento com a segunda pipeta. Em seguida, verifique a resistência da pipeta com um pulso despolarizante de cinco a 10 milivolts. Ajuste qualquer deslocamento no nível de corrente da linha de base no amplificador.Depois disso, aplique uma leve pressão positiva e, enquanto isso, posicione a pipeta pós-sináptica de forma que ela entre em contato com o corpo celular horizontal ou bipolar. Em seguida, posicione a pipeta pré-sináptica de forma que ela entre em contato com o corpo celular de um fotorreceptor de bastonete ou cone. Ao monitorar a liberação de resistência, a pressão positiva na pipeta pós-sináptica, às vezes a liberação de pressão positiva é suficiente para formar uma vedação de giga ohm.Depois que a resistência da ponta aumentar para mais de 100 mega ohms, aplique um potencial de retenção de menos 60 milivolts. Então, quando um selo giga om for obtido, cancele o transiente de capacitância da pipeta. Usando o circuito de compensação de capacitância do amplificador patch clamp, repita o procedimento de teto com a pipeta fotorreceptora, aplicando um potencial de retenção de menos 70 milivolts e cancele a capacitância da pipeta.Transitória, então rompa o remendo aplicando sucção a cada célula. A ruptura do remendo é evidente pelo aparecimento de transiente de capacitância de células inteiras. Agora, confirme a identidade da célula pós-sináptica fisiologicamente aplicando um flash de luz e fornecendo uma série de etapas de tensão de menos 120 a mais 40 milivolts em incrementos de 20 milivolts.Para avaliar se as células estão sinapticamente conectadas, forneça um 25 a 100 milissegundos de 60 milivolts. Passo a despolarização para o fotorreceptor e procure correntes pós-sinápticas. No neurônio de segunda ordem, aqui estão os traços representativos das respostas à luz dos neurônios em fatias verticais da retina da salamandra.A célula horizontal do cone e a célula bipolar desligada exibem uma corrente externa em resposta ao início da luz. A corrente interna proeminente após o flash de luz nas gravações de células horizontais e bipolares aqui é causada pelo aumento da liberação de glutamato dos fotorreceptores à medida que eles se despolarizam no deslocamento da luz. A célula bipolar on responde com uma corrente interna no início da luz, que resulta de um sinal invertendo a cascata de sinalização do receptor metabotrópico de glutamato e a ativação de um canal tripm.Células horizontais e células bipolares podem ser distinguidas umas das outras por suas relações de tensão de corrente. As células horizontais normalmente têm relações de tensão de corrente lineares ou retificadoras internas com uma resistência de entrada inferior a 500 mega ohms, as células bipolares têm uma relação de tensão de corrente retificadora externamente e maior resistência de entrada entre 0,5 a dois giga ohms. Esta figura mostra os resultados representativos das gravações de um par de células horizontais de cone e um par de células bipolares de cone.Em cada caso, a despolarização do cone para menos 10 milivolts de um potencial de retenção de menos 70 milivolts evocou uma corrente de cálcio dependente de voltagem no cone e uma rápida entrada pós-sináptica. Corrente na célula horizontal ou bipolar Fatia da retina. As preparações têm sido usadas em centenas de estudos sobre a anatomia e fisiologia da retina.Eles são particularmente vantajosos para examinar as respostas de várias células simultaneamente, pois facilitam o registro e a imagem de várias células ao mesmo tempo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como dissecar a retina, cortar fatias finas de retina, posicioná-las na câmara de gravação e obter gravações por atacado de pares de eus sinapticamente conectados.

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