LeafJ: um plugin ImageJ para semi-automatizado de medição forma de folha

O objetivo deste procedimento é automatizar a medição da forma da folha para experimentos de alto rendimento. Isso é feito primeiro dissecando as folhas e fotografando-as com um scanner de mesa. A segunda etapa do procedimento é usar o plug-in leaf J para detectar e medir as folhas.

O terceiro passo é preparar as folhas para microscopia e fotografá-las usando um microscópio composto. A etapa final é traçar linhas de esgotamento nas imagens adquiridas usando um tablet com tela sensível ao toque. Em última análise, os resultados podem mostrar diferenças na forma da folha, tamanho e número de células por meio dessa combinação de análise de imagem.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes é a sua velocidade. É cerca de seis vezes mais rápido que a medição manual. As pessoas sabiam que esse método pode ter dificuldades porque o posicionamento adequado das folhas é fundamental para a análise a jusante e porque a montagem de folhas em lâminas pode ser tecnicamente desafiadora.

Tive a ideia desse método pela primeira vez quando percebi que tínhamos cerca de 15.000 folhas para analisar, e fazê-lo manualmente levaria muitos meses e seria incrivelmente chato, demonstrando que a técnica de dissecação da planta estaria causando neuro zue. Um cientista pesquisador do meu laboratório Comece preparando folhas de transparência de 8,5 por 11 polegadas. Cada folha deve ser dividida em molduras retangulares, grandes o suficiente para acomodar as folhas de uma planta, afunilar a segunda folha de transparência na folha impressa para servir de cobertura para evitar que as folhas sequem.

Rótulo com a planta, genótipo e condição de crescimento. Disseque as folhas das plantas do 26º diale. Organize as folhas na transparência em ordem tática do mais novo para o mais velho.

Posicione as folhas verticalmente dentro da moldura sem tocar na borda ou sobrepor outras folhas. Caso contrário, problemas ocorrerão Durante a análise, É importante para folhas orientais verticalmente não tocando, quadro, não sobrepondo Com as folhas arranjadas. Coloque-os com a segunda folha de transparência em branco e uma grade para manter as folhas planas.

Em seguida, gere uma imagem usando um scanner de mesa com pelo menos 600 pontos por polegada de resolução. Comece instalando o plug-in. Baixe a imagem J e arraste o arquivo leaf jja para a pasta de plugins da imagem J.Quando a imagem J for usada, o plugin leaf J estará disponível.

Prossiga com a abertura do arquivo de imagem folha na imagem J.Certifique-se de que a imagem J seja a versão 1.45 s ou posterior. Divida a imagem em três canais de cores, vermelho, verde e azul, clicando nos canais de divisão de cores da imagem. Em seguida, aplique um limite à imagem no canal azul.

Agora selecione todas as folhas de uma planta usando a ferramenta de seleção retangular e, em seguida, selecione o plug-in leaf J. O plugin agora abrirá uma caixa que permite definir as várias condições do experimento, como um grupo experimental e genótipo. Antes de prosseguir, edite essas opções, selecione as condições para as folhas selecionadas na região de interesse e forneça um nome descritivo.

Pressione continuar e a folha J contornará automaticamente cada folha com uma imagem de ROI exclusiva. J se encaixam na elipse na lâmina e calculam os eixos maior e menor dessa elipse, se necessário. Edite as linhas de rastreamento usando a janela do gerenciador de ROI.

Um tablet com tela sensível ao toque conectado como um monitor externo pode ser útil para este procedimento. Com os limites definidos corretamente, execute a análise pressionando. Ok, agora a folha J produz o comprimento da pétala e várias geometrias da lâmina da folha.

Por fim, exporte os resultados da medição e as informações associadas para uma planilha. Depois de escanear as folhas, fixe-as em F-A-A-F-A. Uma folha fixa pode ser armazenada a quatro graus Celsius por até seis meses.

Avançando uma ou duas horas antes da imagem das folhas, limpe as folhas alterando o fixador FAA para solução de cloridrato. Uma vez limpo, monte as folhas nas lâminas com tricomas voltados para cima usando uma ampliação de 40 x em uma imagem de microscópio composto, a camada mesil do centro de cada folha em ambos os lados da nervura principal, evitando células próximas a tricomas ou veias. Para evitar dificuldades no processamento da imagem, é importante remover todas as bolhas de ar das lâminas ao montar as folhas e também obter imagens em foco na próxima etapa.

Depois de coletar as imagens desejadas, abra uma na imagem J e trace os contornos das células da folha pela ferramenta de gerenciamento JROI de imagem com o auxílio do tablet touchscreen e uma caneta. Isso não utiliza o plug-in LEAF J. Antes de usar o LEAF J para experimentação, a precisão e a velocidade do plug-in foram comparadas às de um pesquisador experiente. Geral.

A folha J terminou 5,7 mais rapidamente do que os cálculos manuais e a comparação dos dados dos dois métodos mostrou que os resultados estavam fortemente correlacionados para todos os parâmetros medidos dos 3.532 comparados. Os pontos de dados 172 eram discrepantes. Desses outliers, 29 foram causados pelo plugin LEAF J, muito menos do que os 143 causados por erro humano.

Durante a medição manual, a folha J foi atualizada para reduzir ainda mais o número de erros. Confiando nas medições do LEAF J, ele foi usado para testar a evitação de sombra usando um modelo de efeitos mistos. O tratamento e o número de folhas foram efeitos fixos e a repetição foi como efeito aleatório.

Muitos parâmetros foram significativamente afetados pelo tratamento de sombreamento. Alternativamente, alguns parâmetros não foram significativamente afetados pela sombra. Usando uma análise de imagem assistida por comprimido de parâmetros celulares, 67 genótipos de Arabidopsis ANA foram examinados, totalizando 8.629 células de 877 folhas de 224 plantas.

Os genótipos foram então agrupados em seis classes. A maioria dos genótipos tem tamanho e número de células normais. No entanto, vários tinham tamanho de célula maior com número normal de células.

Embora seja importante tentar este procedimento para usar randomização e design experimental ao cultivar suas plantas, lembre-se de que trabalhar com formaldeído e cloridrato pode ser extremamente perigoso. Portanto, precauções como usar luvas e trabalhar na hotte devem ser tomadas ao fazer este procedimento. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fazer uma triagem de alto rendimento de fenótipos de forma de folha e célula usando suas próprias condições experimentais Seguindo este procedimento.

Métodos adicionais, como o sequenciamento de RNA, podem ser usados para responder a perguntas como quais genes se moldam efetivamente.