Name: Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Aprenda a aplicar drogas localmente para estudar receptores nicotínicos de acetilcolina em neurônios de fatias cerebrais de camundongos adultos usando patch clamp. Este método revela propriedades biofísicas de canais iônicos em neurociência.

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Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (NIH) concessão DA030396. Graças aos membros do laboratório Drenan para discussão útil e crítica do manuscrito. Agradecimentos especiais a Mi Ran Kim para assistência técnica e Thomas Jonathan Ting para aconselhamento sobre fatias de cérebro de rato adulto.

1. Preparação de Soluções de Preparação Cérebro Slice e Eletrofisiologia <ol><li> As soluções para a preparação de fatias de cérebro foram previamente descritos 3, 4. Preparar N-metil-D-glucamina (NMDG) baseada em corte e solução de recuperação com a seguinte composição (em mM): 93 N-metil D-glucamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 de NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 glucose, 5 de Na + ascorbato, 2-tioureia, 3 piruvato de Na +, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 2H 2 O. • Ajuste para 300-310 mOsm com NMDG. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 10 N de HCl. <ol class="lalpha"><li> Dissolver MgSO 4 • 7H 2 O, e CaCl 2 2H 2 O • em água Millipore para fazer soluções de reserva 2 M de cada um. </li><li> Pesar outros componentes na ordem indicada e adicionar a um frasco volumétrico de parcialmente cheio com água Millipore, agitando para dissolver. Uma vez que tudo é adicionado, preencherbalão volumétrico de água Millipore. </li><li> Medir o pH e ajustar com 10 N de HCl. </li><li> Medir a osmolaridade e ajustar com NMDG se necessário. </li></ol></li><li> Prepare HEPES prendem fluido cerebrospinal artificial (aCSF) com a seguinte composição (em mM): NaCl 92, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO3, 20 mM de HEPES, 25 glucose, 5 Na + ascorbato, 2, 3 de Na tioureia + piruvato, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajustar para 300-310 mOsm com sacarose. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 1 N HCl ou NaOH. <ol class="lalpha"><li> Pesar os componentes na ordem indicada e adicionar a um frasco volumétrico de parcialmente cheio de água Millipore, agitando para dissolver. Uma vez que tudo é adicionado, encher balão volumétrico com água Millipore. </li><li> Medir o pH e ajustar com NaOH ou HCl, se necessário. </li><li> Medir e ajustar a osmolaridade com sacarose, se necessário. </li></ol></li><li> Preparar a solução de gravação de padrão de aCSF a seguinte composição (em mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,2 O. NaH 2 PO 4, 24 de NaHCO3, 12,5 glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 2H 2 • Ajustar para 300-310 mOsm com sacarose. Ajustar o pH a 7,3-7,4 com 1 N HCl ou NaOH. </li></ol> 2. Preparação de fatias cerebral aguda <ol><li> Corte fatia cerebral e de recuperação são realizados como anteriormente descrito 3, 4. Pratos bolha cheia de dois cristais NMDG solução de recuperação com 95% de oxigénio / 5% de CO 2 do gás (carbogénio), um prato em gelo, o outro a 33 ° C. </li><li> Bolha prato de cristal cheio de um HEPES segurando aCSF com carbogênio à temperatura ambiente. </li><li> Anestesiar rato adulto (com idades entre 2 a 12 meses) com pentobarbital de Na + (200 mg / kg, ip). Prossiga com o procedimento quando o animal não tem resposta a um dedo do pé pitada. </li><li> Se necessário, cortar uma amostra de tecido da cauda para posterior genotypção do animal. </li><li> Abrir a cavidade torácica, expor o coração, e prender a aorta descendente. Dilacerar o átrio direito. </li><li> Transcardially perfundir animal com 5-10 ml de 0-4 ° C uma solução de recuperação NMDG. </li><li> Decapitar animal, remover o cérebro e colocá-lo em solução de 4 ° C NMDG recuperação durante 1 min. </li><li> Sobre uma placa de metal em gelo refrigerados, aparar o cérebro na orientação desejada (coronal, parasagital, horizontal, etc), para incluir a área de interesse. </li><li> Apor o bloco de cérebro com supercola para a superfície de fase seca de um cortador de vibração (DSK-Zero 1; Dosaka), submergir o bloco cerebral em 4 ° C uma solução de recuperação de NMDG e continuamente a solução de bolha com carbogénio. </li><li> Cortar fatias de cérebro a área de interesse. Espessura de corte é 200-400 um, dependendo da área específica do cérebro de interesse, a idade do animal, e experimentar a ser executada. </li><li> Imediatamente após o corte, incubar fatias desejados em carbogenated, 33 ° C NMDG a recuperação solution durante exactamente 12 min, em seguida, transferir para carbogenated, HEPES a temperatura ambiente prendem solução durante um período inicial de 60 min. Após esta incubação de 60 min, as fatias pode ser utilizado para gravação. Fatias são mantidas em tampão HEPES prendem solução ao longo do dia, até que sejam utilizados para a gravação. </li></ol> 3. Gravação de remendo da braçadeira de neurônios em fatias de cérebro <ol><li> Puxe uma micropipeta remendo padrão com uma programável Flaming-Brown extrator (Sutter P-97, ou puxador vertical, equivalente). Pipetas que são ideais para giga-ohm formação selo normalmente têm uma resistência de 4-6 MQ </li><li> Transferir uma fatia para a câmara de gravação (RC-27L; Instrumentos Warner) no palco de um microscópio vertical (Nikon FN-1). Continuamente superfuse (1,5 - 2,0 ml / min) a fatia com carbogenated, padrão de gravação aCSF aquecido e mantido a 32 ° C. Alternativamente, as fatias pode ser mantida à temperatura ambiente. </li><li> Localize e centro a área do cérebro de interesse usandoum objectivo ar 10X (Nikon Plano Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm). </li><li> Visualizar os neurónios individuais usando um 40X infravermelha (IR) objectiva de imersão em água (Nikon APO 40XW; NA: 0,80; WD: 3,5 mm) ligados a IR-contraste de interferência diferencial (DIC) e uma óptica de alta velocidade do infravermelho próximo Charged Coupled Device (CCD) da câmera de vídeo (Hamamatsu C-7500). Sob IR-DIC de observação, os neurônios saudáveis ​​apresentam uma superfície lisa, membrana plasmática cinza claro. </li><li> Encher uma micropipeta com uma solução de gravação adequado intracelular. Para a maioria das aplicações, que utilizam a solução seguinte (em mM): 135 Gluconato de potássio, 5 EGTA, 0,5 CaCl2, 2 de MgCl2, 10 mM de HEPES, 2 de Mg-ATP, GTP e 0,1 (pH ajustado a 7,25 com base Tris, osmolaridade ajustado para 290 mOsm com sacarose). Estabelecer uma gravação de células inteiras de um neurônio visualizado. </li></ol> 4. A aplicação local de medicamentos para Neurônios em fatias <ol><li> Puxar uma micropipeta grampo padrão adesivo, como descrito acima. Usoum extractor de pipeta, tal como um Sutter P-97 que produz dois idênticos &quot;irmãs&quot; pontas da mesma peça de vidro é vantajoso quando as soluções de múltiplas drogas estão a ser utilizados na mesma célula. Tamanhos de ponta que tem uma resistência de ~ 5 MQ se eles foram preenchidos com a solução intracelular descritas acima são o ideal. </li><li> Backfill micropipeta o com uma solução de fármaco diluído em carbogenated aCSF gravação, padrão. Apontar a ponta para baixo, e agite a micropipeta e recheada de drogas para remover quaisquer bolhas de ar retidas na coluna de solução. </li><li> Montar a micropipeta e recheada de drogas num suporte de pipeta ligada com tubagem a um sistema adequado de pressão de ejecção, como um Picospritzer III (General Valve Co.). O titular da pipeta deve ser montado sobre um micromanipulador com a mesma resolução que manipuladores comumente utilizado para a gravação de fixação de membranas (por exemplo, Sutter MP-285). Além disso, o manipulador deve permitir o movimento diagonal para dentro e fora da fatia. Homemdualmente ejectar pressão 3 a 4 vezes para a micropipeta, a fim de construir-se uma pressão adequada por trás da coluna de líquido. </li><li> Usando os controles micromaniplador, abaixe a pipeta de drogas na fatia, enquanto visualiza a ponta sob IR-DIC óptica. Idealmente, deve-se identificar visualmente e centro de um neurónio para ser gravado a partir de, seguido pelo posicionamento da pipeta droga perto da célula antes de baixar a micropipeta de gravação para a fatia. Posicionar a pipeta de drogas podem causar o movimento do tecido na vizinhança da célula gravada que poderiam interromper a gravação se a pipeta de droga é movido para a sua posição depois de se estabelecer uma vedação gigaohm. </li><li> Usando vídeo IR, posicionar a micropipeta droga na superfície superior da fatia de tecido. Executar uma pressão de ejecção e do monitor 1) na proximidade da ponta para o movimento de detritos relacionados com a ejecção, e 2) a ponta micropipeta para detectar quaisquer sinais de que a ponta está obstruída ou bloqueada. Se a ponta está bloqueada / entupidos, recolha a pipetae e substituí-la por uma nova. </li><li> Abordagem a célula gravado na diagonal a partir do topo da fatia de tal modo que quando em posição final, a ponta da pipeta e recheada de drogas é 1) no mesmo plano focal (ou ligeiramente inferior) como a célula gravada e a ponta do eléctrodo de registo , e 2) de 10 a 40 um da célula registada. Se a droga-cheia ponta da pipeta está acima da célula gravada, a força da pressão de ejecção poderiam perturbar o selo gigaohm. </li><li> Registar a resposta celular desejado enquanto mantém a célula em modo de grampo de tensão ou de corrente de modo de fixação. Rotineiramente gravar acetilcolina e / ou nicotina provocou correntes de celulares, mantendo os neurônios no modo de fixação de voltagem. Embora a pressão de ejecção pode ser activado manualmente quando se utiliza um Picospritzer III, para resultados mais reprodutíveis, é aconselhável para provocar a ejecção de pressão através do sistema de aquisição (Axon Digidata 1440 e pClamp 10,3) com um TTL digital de pulso. </li></ol> 5. ControladorMicropipeta a Drug-cheia com um tradutor piezoelétrico <ol><li> Se possível, montar o suporte de pipeta e recheada de drogas a um tradutor de dimensão única piezoeléctrica (por exemplo Piezojena PA-100 ou Burleigh PZM-150) que é capaz de aceitar uma entrada de tensão analógico (mais uma vez, a partir do sistema de aquisição), que é então montado sobre o micromanipulador de alta precisão (Sutter MP-285). Um tradutor piezoeléctrico é útil porque o movimento da pipeta e recheada de drogas para dentro e para fora da fatia, incluindo o tempo e a velocidade de entrada / saída, pode ser mais facilmente controlado e reproduzido de experiência para experiência. Ao estudar nAChRs, os efeitos de dessensibilização de vazamento de nicotina a partir da pipeta cheia de medicamento, deve ocorrer que alguma vez, são minimizadas quando a pipeta é movido apenas perto da célula com um tradutor piezoeléctrico para o momento de ejecção de pressão. </li><li> Através do potenciômetro controlado manualmente no amplificador de controle de tensão piezoelétrico, disque a tensãopara o seu valor máximo. </li><li> Usando o micromanipulador posição, a pipeta de droga-cheia na fatia onde a pipeta ejecta o seu conteúdo para a célula gravada, e retrair a pipeta manualmente, reduzindo a tensão para zero no amplificador piezoeléctrico tensão de controlo. </li><li> Utilizando um sinal de saída analógico do sistema de aquisição de gravação, mover a pipeta e recheada de drogas na fatia por um período de 250 mseg a partir de 300 ms antes do impulso de pressão de ejecção TTL ocorre. Retrair a pipeta durante um período de 250 mseg, a partir de 50 ms após o impulso TTL termina. </li></ol>

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O método apresentado neste artigo é de grande utilidade para o estudo de ligante fechado função de canal iônico em preparações fatia do cérebro. No entanto, há uma série de factores que irão afectar significativamente a qualidade e reprodutibilidade dos dados experimentais, que resultam da utilização deste método. Por exemplo, as correntes evocadas são muito sensíveis ao diâmetro da ponta da pipeta e recheada de drogas. Pequenas dicas irá causar dificuldade com esvaziando a solução de drogas, e dicas de grande porte com...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nome do reagente</strong</td&gt;<td<strong&gt; Empresa</strong</td&gt;<td<strong&gt; Número de catálogo</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-metil D-glucamina</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glicose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Ascorbato</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tiouréia</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Piruvato</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pentobarbital</td&gt;<td&gt; Vortech Pharmaceuticals</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gluconato de potássio</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 vibratório slicer</td&gt;<td&gt; Ted Pella, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / Brown micropipeta extrator</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Câmara RC-27 Gravação</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B controlador de aquecedor Perfusão</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SH-27B aquecedor Solução</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nikon FN-1</td&gt;<td&gt; Nikon</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 câmera de vídeo CCD</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; Geral Valve Co.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Micromanipulador MP-285</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 tradutor piezoelétrico</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 piezo amplificador</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

aplicação local de drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato fatias

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

O uso do tabaco leva a inúmeros problemas de saúde, incluindo câncer, doenças cardíacas, enfisema e infarto. Vício de fumar cigarro é uma doença prevalente neuropsiquiátrica que decorre das ações biofísicas e celulares da nicotina sobre os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em todo o sistema nervoso central. Compreender os subtipos nAChR vários que existem em áreas do cérebro importantes para a dependência da nicotina é uma das prioridades. Experimentos que empregam técnicas de eletrofisiologia, como célula inteira braçadeira patch ou dois eletrodos gravações braçadeira de tensão são úteis para a caracterização farmacológica de nAChRs de interesse. Células que expressam nAChRs, tais como as células do tecido de mamífero de cultura ou oócitos de Xenopus laevis, são fisicamente isoladas e são, portanto, facilmente estudado usando as ferramentas da farmacologia moderna. Muito progresso foi feito utilizando essas técnicas, particularmente quando o receptor alvo, já era conhecido umª expressão ectópica foi facilmente alcançado. Muitas vezes, no entanto, é necessário estudar nAChRs no seu ambiente nativo: em neurónios dentro fatias de cérebro de forma aguda colhidas a partir de ratos de laboratório ou ratos. Por exemplo, os ratos que expressa &quot;hipersensíveis&quot; subunidades nAChR tais como α4 ratinhos e ratos L9&#39;A um α6 L9 é 2, permitir uma identificação inequívoca dos neurónios com base na sua expressão funcional de uma subunidade de nAChR específico. Apesar de célula inteira gravações remendo da braçadeira de neurônios em fatias de cérebro é feito rotineiramente pelo eletrofisiologista hábil, é um desafio para aplicar localmente drogas como a nicotina ou acetilcolina para a célula gravado dentro de uma fatia do cérebro. A diluição de drogas para os superfusate (aplicação do banho) não é rapidamente reversível, e tubo em U de sistemas não são facilmente adaptados para funcionar com fatias de cérebro. Neste artigo, descrevemos um método para rapidamente aplicar nAChR drogas ativadoras de neurônios registrados em adultos mOuse fatias de cérebro. Padrão de célula inteira gravações são feitas a partir de neurónios em fatias, e uma segunda micropipeta cheia com uma droga de interesse é manipulado para a posição perto da célula registada. Uma injecção de ar comprimido ou de azoto inerte para a pipeta cheia de medicamento provoca uma pequena quantidade de solução de fármaco a ser ejectada a partir da pipeta da célula registada. Usando este método, nAChR mediadas correntes podem ser resolvidos com a precisão de milissegundos. Tempos de aplicação de drogas pode ser facilmente variada, e a pipeta cheia de medicamento pode ser recolhido e substituído por uma nova pipeta, permitindo curvas concentração-resposta para ser criado por um único neurónio. Embora tenha sido descrita no contexto de nAChR neurobiologia, esta técnica deverá ser útil para o estudo de muitos tipos de canais iónicos dependentes do ligando ou de receptores nos neurónios de fatias de cérebro.

Em nossos experimentos, nós rotineiramente gravar a partir de dopamina (DA) de produção de neurônios da área tegmental ventral (VTA) e substantia nigra pars compacta (SNc). Em tensão-grampo modo, a aplicação de pressão ou de acetilcolina nicotina para essas células normalmente resultam em uma rápida corrente de catiões, para o interior, que atinge o pico dentro de 100-200 mseg (Figura 1A-B). Decaimento da corrente é em grande medida ditada por difusão da droga a partir do local de acção e, se enzimas na...

Neste trabalho, nós descrevemos um método útil para o estudo ligante fechado função de canal iônico em neurônios de fatias de cérebro de forma aguda isolados. Este método envolve a utilização de uma micropipeta cheia de medicamento para aplicação local de medicamentos para os neurónios gravados utilizando técnicas padrão de fixação de patch.

Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

O objetivo geral deste procedimento é estudar a função do canal iônico dependente de ligante em neurônios de fatias de cérebro preparadas agudamente derivadas de camundongos adultos. Isso é feito extraindo primeiro um cérebro intacto de um camundongo adulto que foi trans Cardi perfundido com líquido cefalorraquidiano artificial especializado. O segundo passo é preparar fatias de cérebro da região cerebral de interesse na orientação desejada.Em seguida, fatias cerebrais individuais colocadas em uma câmara de gravação sob o microscópio e neurônios individuais dentro da fatia são identificados para gravação. A etapa final é o registro de um neurônio com patch clamp de célula inteira, seguido pela aplicação local de drogas para ativar os canais iônicos dependentes de ligantes usando uma segunda micropipeta de vidro. Em última análise, este método de estudo de canais iônicos dependentes de ligantes é usado para mostrar as propriedades biofísicas dos receptores nativos em neurônios vivos.A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como aplicação de banho ou administração de medicamentos no YouTube, é que a entrega de medicamentos ao neurônio registrado é muito rápida e localizada. Pequenas quantidades de droga podem ser administradas e vários neurônios podem ser estudados a partir de uma única fatia. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do receptor nicotínico de acetilcolina, como determinar os receptores nicotínicos nativos envolvidos nas respostas biofísicas, biológicas e comportamentais da célula à nicotina.Neste procedimento, depois de sacrificar um camundongo adulto e obter o cérebro, corte o cérebro na orientação desejada para incluir a área de interesse em uma placa de metal gelada. Em seguida, fixe o bloco cerebral com super cola na superfície seca do estágio de um fatiador vibratório. Em seguida, mergulhe o bloco cerebral em solução de recuperação NMDG de quatro graus Celsius e borbulhe continuamente a solução com carbogênio.Em seguida, corte as fatias de 250 mícrons de espessura cada uma da área do cérebro de interesse. Em seguida, puxe uma micropipeta padrão com uma resistência de quatro a seis mega ohms usando o extrator marrom flamejante programável. Encha a micropipeta com uma solução de gravação intracelular adequada.Em seguida, transfira uma fatia para a câmara de gravação no estágio de um microscópio vertical continuamente super fundir a fatia com carbonatado 32 graus Celsius Gravação padrão A CSF a 1,5 a 2,0 mililitros por minuto. Sob o microscópio, localize e centralize a área de interesse do cérebro usando uma objetiva de ar 10x. Depois disso, visualize os neurônios individuais usando uma objetiva de imersão em água de infravermelho próximo de 40 x conectada à óptica de contraste de interferência diferencial IR e um dispositivo acoplado carregado de infravermelho próximo de alta velocidade ou câmera de vídeo CCD Sob observação IR DIC, neurônios saudáveis exibem uma membrana plasmática cinza claro lisa após a visualização celular.Realize o registro de células inteiras usando técnicas convencionais. Agora puxe outra micropipeta de grampo de remendo padrão como antes para produzir duas pontas irmãs idênticas do mesmo pedaço de vidro com uma resistência ideal de aproximadamente cinco mega ohms. Preencha uma das micropipetas com a solução de medicamento diluída em registro padrão carbonatado A CSF, aponte a ponta para baixo e mova a micropipeta cheia de medicamento para remover quaisquer bolhas de ar presas na micropipeta.Em seguida, monte a micropipeta cheia de medicamento em um suporte de pipeta conectado ao manipulador microm. O porta-pipetas deve ser conectado com tubulação a um sistema de ejeção de pressão adequado. Ejete manualmente a pressão três a quatro vezes para a micropipeta para aumentar a pressão adequada atrás da coluna de fluido.Em seguida, abaixe a pipeta de drogas na fatia usando o manipulador microm usando IRDIC. Observação. Posicione a micropipeta de drogas na superfície da fatia de tecido. Execute uma ejeção de pressão e monitore a vizinhança da ponteira quanto ao movimento de detritos relacionados à ejeção e à microponteira da pipeta.Para quaisquer sinais de que a ponteira está entupida ou bloqueada, se a ponteira estiver entupida, retraia a pipeta e substitua-a por uma nova. Aproxime-se da célula gravada diagonalmente a partir do topo da fatia. Quando está na posição final, a ponta da pipeta cheia de medicamento está no mesmo plano focal que a célula registrada e a ponta do eletrodo de registro, e está a cerca de 10 a 40 mícrons da célula registrada.Se a ponta da pipeta cheia de drogas estiver acima da célula registrada, a força da ejeção de pressão pode interromper o giga selo da célula e, em seguida, registrar as correntes celulares induzidas por acetilcolina e/ou nicotina enquanto mantém os neurônios no modo de grampo de tensão. Embora a rejeição de pressão possa ser acionada manualmente ao usar um pico spritzer três para resultados mais reprodutíveis, é aconselhável acionar a rejeição de pressão usando o sistema de aquisição e um pulso TTL digital. Para melhorar o experimento, o porta-pipetas cheio de medicamentos pode ser montado em um tradutor elétrico pizo de dimensão única que é capaz de aceitar uma entrada de tensão analógica, que é então montada no micro manipulador de alta precisão.Um tradutor elétrico pizo é útil porque o movimento da pipeta cheia de drogas para dentro e para fora da fatia, incluindo o tempo e a velocidade de entrada e saída, pode ser mais facilmente controlado e reproduzido de experimento para experimento. Em seguida, ajuste a tensão para seu valor máximo com o potenciômetro controlado manualmente no pizo electric voltage amplificador controlado. Use o micro manipulador para posicionar a pipeta cheia de medicamento na fatia.Retraia a pipeta reduzindo manualmente a tensão a zero no pazo elétricotage controlado amplifier usando um sinal de saída analógica do sistema de aquisição de gravação. Mova a pipeta cheia de medicamento para a fatia antes que ocorra o pulso TTL de ejeção de pressão. Depois que o pulso ocorrer, retraia a pipeta.Esta figura mostra a resposta representativa de um neurônio dopaminérgico a 100 micromolares de acetilcolina aplicada localmente, e esta figura mostra a resposta representativa de outro neurônio dopaminérgico a 100 micromolares de nicotina aplicada localmente. Aqui estão os potenciais de ação espontânea de um neurônio dopaminérgico em uma fatia de cérebro de camundongo Alpha six L nine prime S sendo mantida no modo de pinça atual. A aplicação de um micromolar de nicotina usando uma rejeição de pressão de 250 milissegundos induziu mudanças na ação, na taxa de disparo potencial e no potencial de membrana em repouso.Usando a pesquisa de limiar no software P clamp, a taxa de disparo instantânea foi derivada para classificar os neurônios pelos tipos de resposta à acetilcolina neurônios colus superiores individuais. Em uma fatia de cérebro de camundongo Alpha six L nove primes foram pinçadas por voltagem, seguidas pela aplicação local de nicotina micromolar por meio de ejeção de pressão, os neurônios do tipo um exibiram IPCs aumentados. Após a aplicação de nicotina, os neurônios do tipo dois exibiram grandes correntes internas e EPCs aumentadas em resposta à aplicação de nicotina.O tradutor elétrico Pizo oferece consistência e protege contra vazamento de drogas. Um neurônio dopaminérgico VTA em uma fatia de cérebro de um camundongo Alpha six L nine prime S foi registrado no modo de palmas de voltagem. Durante a aplicação de um micromolar de nicotina, a pipeta cheia de nicotina foi manobrada para a posição final antes da ejeção da pressão e retraída após a ejeção usando um tradutor elétrico pazo.Uma segunda resposta foi registrada dois minutos após a primeira para demonstrar que nenhuma dessensibilização N-A-C-H-R havia ocorrido. Os experimentos foram repetidos com a aplicação de nicotina 10 micromolares. Novamente, nenhuma dessensibilização foi observada na segunda resposta quando comparada à primeira.Uma vez dominada, essa técnica pode ser executada em menos de três horas, se feita corretamente. Em alguns casos, 10 a 15 neurônios podem ser estudados a partir de uma única fatia de cérebro em um dia Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de posicionar com precisão a pipeta cheia de drogas para manter um equilíbrio entre a ativação total dos receptores nicotínicos de superfície e a integridade do selo giga.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Nós desenvolvemos uma nova técnica de quantificar as alterações de receptores de acetilcolina nicotínicos no interior das regiões subcelulares de subtipos específicos de neurónios no SNC a compreender melhor os mecanismos da dependência da nicotina, usando uma combinação de abordagens, incluindo a marcação da proteína fluorescente do receptor usando o arrastamento na abordagem e espectral imagiologia confocal.

Imagem Confocal Espectral de fluorescência com a tag receptores nicotínicos na Knock-em camundongos com a administração de nicotina crônica

Tráfico de membrana neuronal controla dinamicamente membrana disponibilidade de proteína plasmática e significativamente impactos neurotransmissão. Até à data, tem sido um desafio para medir tráfico endocítico neuronal em neurônios adultos. Aqui, descrevemos um método altamente eficaz, quantitativo para medir as mudanças rápidas na expressão de proteínas de superfície ex vivo em fatias cerebrais agudas.

Cérebro Fatia Biotinilação: Uma<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Abordagem medir Região específicas do tráfego de proteínas de membrana plasmática em adultos Neurônios

Desenvolvemos uma preparação quimérica genética do hipocampo ventral – circuito accumbens in vitro que permite imagens diretas ao vivo para analisar os mecanismos pré-sinápticos da transmissão sináptica mediada pelos receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs). Esta preparação também fornece uma abordagem informativa para estudar os mecanismos pré e pós-sinápticos da plasticidade sináptica.

Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Este protocolo demonstra a implementação de um otimizado N-metil-D-glucamine (NMDG) método de recuperação protetora de preparação de fatia do cérebro. Uma formulação única mídia é usada para obter confiavelmente fatias de cérebro saudável de animais de qualquer idade e para diversas aplicações experimentais.

Preparação de fatias de cérebro aguda usando um otimizado N-metil-D-método de proteção de recuperação glucamine

Uma validado bateria informatizada de testes neuropsicológicos e neurofisiológicos é usada para estudar os efeitos farmacodinâmicos no sistema nervoso central de drogas recentemente desenvolvidos na fase inicial de desenvolvimento. Para demonstrar a bateria de testes, são descritos os efeitos agudos de mecamylamine e a reversão destes efeitos por duas drogas do agonista.

Uma bateria de testes informatizados para estudar os efeitos farmacodinâmicos no sistema nervoso Central de drogas colinérgicas em fase inicial de desenvolvimento de drogas

Apresentamos um método que pode fornecer mais insights sobre os primeiros eventos subjacentes a neurodegeneração e baseia a técnica de cérebro estabelecido ex vivo , combinando as vantagens dos experimentos in vivo e in vitro . Além disso, representa uma oportunidade única para comparação directa do grupo tratado e não tratado no mesmo plano anatômico.

Uma abordagem alternativa para estudar eventos primários na neurodegeneração usando fatias de cérebro de rato Ex Vivo

Microglia, as residentes células imunes do cérebro, responder rapidamente com alterações morfológicas às modificações do seu ambiente. Este protocolo descreve como usar dois fotões microscopia para estudar a atração dos processos microglial em direção a serotonina ou ATP em fatias aguda do cérebro de ratos.

Imagem de dois fotões de atração Microglial processos para ATP ou de serotonina no cérebro aguda fatias

Este artigo apresenta um método para estudar os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em fatias de cérebro de rato por nicotina uncaging. Quando acoplado com gravação de braçadeira do remendo simultânea e 2-fóton laser, microscopia eletrônica de varredura, nicotina uncaging conecta a função do receptor nicotínico com morfologia celular, proporcionando uma compreensão mais profunda da neurobiologia colinérgico.

Função de receptores nicotínicos de acetilcolina em fatias de cérebro de rato através de Laser Flash fotólise de nicotina Photoactivatable de sondagem

Apresentamos um protocolo para avaliar o equilíbrio entre liberação de glutamato e liberação em sinapses glutamatergicas corticostriatais únicas em fatias agudas de camundongos adultos. Este protocolo usa o sensor fluorescente iGluu para detecção de glutamato, uma câmera sCMOS para aquisição de sinal e um dispositivo para iluminação a laser focal.

Indicadores únicos de sinapse de liberação de glutamato e absorção em fatias cerebrais agudas de ratos normais e huntington

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

Esse protocolo descreve a expressão e quantificação das subunidades neuronais dos receptores nicotínicos de acetilcolina usando a linha celular Neuro-2a de mamíferos. Marcadores fluorescentes sensíveis ao pH e microscopia confocal permitem a avaliação precisa da localização dos receptores na membrana plasmática versus aqueles expressos em compartimentos intracelulares neutros em pH, facilitando o estudo do tráfego e modulação farmacológica do nAChR.

Localização da membrana plasmática e dos receptores de acetilcolina nicotínica intracelular neuronal usando imagem quantitativa em células de mamíferos

Aprenda a aplicar drogas localmente para estudar receptores nicotínicos de acetilcolina em neurônios de fatias cerebrais de camundongos adultos usando patch clamp. Este método revela propriedades biofísicas de canais iônicos em neurociência.

Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

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