Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

O objetivo geral deste procedimento é produzir substratos de cultura de células biomiméticas para projetar a estrutura e a função dos tecidos cardíacos macroscópicos. Isso é feito primeiro fabricando um mestre de silicone com a arquitetura topográfica desejada por gravação de íons reativos profundos. O segundo passo é transferir o padrão topográfico desejado do mestre de silício para um molde PUA usando litografia de força capilar assistida por UV.

Em seguida, o molde PUA é usado como modelo para fabricar substratos de cultura de células a partir de vários materiais poliméricos, dependendo da aplicação desejada por meio de litografia de força capilar assistida por UV ou mediada por solvente. A etapa final é colocar cardiomiócitos primários ou derivados de células-tronco no substrato de cultura de células de padrão nano para análise subsequente. Em última análise, a microscopia de campo claro e imunofluorescência é usada para mostrar mudanças na morfologia celular e no arranjo contratual de proteínas dentro dos cardiomiócitos.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a impressão de microcontato, é que a litografia de força capilar produz substratos de cultura de células de nanopadrão que podem induzir o alinhamento estrutural das monocamadas do tecido cardíaco sem depender da proliferação ou migração celular. Embora esse método possa ser usado para fornecer informações sobre a relação estrutura-função dos tecidos cardíacos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a mecanobiologia do câncer. Para estudar o impacto da topografia da matriz na migração celular Be, inicie este procedimento limpando a superfície mestra de silício com 100% de etanol ou xileno e secando sob gás nitrogênio oxigênio.

Em seguida, coloque o padrão mestre de silício com o lado voltado para cima em uma placa de Petri para um mestre de silício com uma pipeta de padrão de superfície de dois centímetros por dois centímetros de 40 microlitros de PUA. Em seguida, coloque uma folha de filme de poliéster transparente de quatro centímetros por quatro centímetros sobre o PUA dispensado, pressione a folha de PET e espalhe o PUA por baixo da folha na face do padrão usando um rolo ou superfície de borda plana para que todo o padrão seja coberto pelo pré-polímero PUA. Em seguida, coloque o pré-polímero mestre de silicone e o PET aproximadamente 10 centímetros abaixo de uma luz UV de 20 watts por 50 segundos.

Após a cura, remova o filme PET lentamente com uma pinça. O PUA deve ser anexado ao filme PET com um negativo do padrão nano Silicon Master. Posteriormente, cure os nano padrões P-U-A-P-E-T sob UV por pelo menos 12 horas antes do uso.

Para limpar o Silicon Masters, coloque outro filme de PET em cima do mestre sem a adição de PUA. Exponha-o à luz UV por 50 segundos e remova o filme PET. Em seguida, enxágue o silício mestre com 100% de etanol ou xileno e seque sob gás nitrogênio oxigênio.

Neste procedimento, trate lâminas de vidro circulares de 18 milímetros de diâmetro, colocando-as em uma câmara de ozônio por 10 minutos. Em seguida, coloque as lâminas em blocos de PDMS para prendê-las temporariamente para facilitar o manuseio. Em seguida, aplique uma camada de primer de vidro na superfície da lâmina de vidro.

Deixe o primer secar ao ar por 30 minutos. Agora coloque as lâminas de vidro em um pedaço de papel de impressora. Coloque 10 microlitros de pré-polímero de poliuretano no centro de cada lâmina de vidro e certifique-se de que nenhuma bolha seja gerada.

Em seguida, coloque o padrão de molde PUA voltado para baixo na lâmina de vidro e disperse o pré-polímero de PU uniformemente na superfície da lâmina de vidro rolando um rolo cilíndrico de borracha ao longo do molde PUA. O papel da impressora absorverá o estouro do polímero após a cura UV por 60 segundos sob uma lâmpada UV de 20 watts. Posteriormente, remova a amostra da fonte de luz UV e descasque cuidadosamente o molde PUA da polimerização da lâmina de vidro revestida com PU do PU é considerada completa.

Quando o molde PUA descascar da amostra e a lâmina de vidro PU tiver uma aparência iridescente, coloque as amostras em um desidratado para armazenamento por até um mês. Agora prenda as lamínulas A NFS a uma pipeta de poliestireno para cultura de tecidos de 35 milímetros com 20 microlitros de NOA no fundo da placa. Coloque delicadamente a lamínula de cobertura NPPU em cima do NOA e deixe a cola se espalhar e cobrir todo o fundo da lamínula após a cura do NOA expondo o prato aos raios UV por 10 minutos.

Em seguida, esterilize o NP SUBSTRATA, enxaguando-o duas vezes com dois mililitros de solução aquosa de etanol a 70% cada por cinco minutos. Remover o etanol por aspiração. Deixe o A NFS secar completamente ao ar por cerca de uma hora sob a esterilização UV lamp no gabinete de segurança biológica.

Para aumentar a adesão celular, cubra o A NFS com fibronectina durante a noite, diluindo primeiro a fibronectina em água di a cinco microgramas por mililitro. Em seguida, pipete dois mililitros de solução de fibronectina em um prato. Em seguida, coloque o A NFS na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 durante a noite.

Obtenha NR VMs, HESC CMS ou outras células cardíacas de interesse, centrifugue a amostra de células a 1000 RPM por três minutos para granular as células. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e certifique-se de não perturbar o pellet. Depois disso, ressuspenda as células em meios de cultura a uma concentração de 4,6 vezes 10 elevado a seis células por mililitro.

Pipete cuidadosamente 200 microlitros de suspensão celular no NFS A esterilizado e certifique-se de que a suspensão celular permaneça na lamínula. Em seguida, coloque as células na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por quatro horas para permitir que as células se liguem ao A NFS. Em seguida, adicione dois mililitros de meios de cultura quentes adicionais ao prato e coloque as células na incubadora novamente nas mesmas condições.

Após 24 horas, remova o meio e lave com dois mililitros de DPBS duas vezes para remover o excesso de células. Depois disso, adicione dois mililitros de meios de cultura quentes ao prato. Colocar as células numa incubadora nas mesmas condições e cultura.

As células para confluência substituem o meio a cada dois dias. Esta figura mostra as imagens representativas de campo claro de VMs NR após sete dias de cultura e CMS HESC. Após 48 horas de cultura, NR VMs e HESC CMS nas superfícies NP mostram anisotropia e alinhamento estruturais óbvios, enquanto os cardiomiócitos nas superfícies do padrão UN são orientados aleatoriamente.

A análise imuno-histoquímica destaca o impacto da nano topografia no alinhamento do citoesqueleto celular, microfilamentos de actina e actina alfa sarcomérica em células cultivadas no A NFS tornam-se alinhadas ao longo das nano cristas, mas permanecem distribuídas aleatoriamente em células em substratos não padronizados. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de esterilizar seus substratos antes de assentar as células, pois a contaminação pode ser um grande problema após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores em biologia cardiovascular explorarem a maturação cardíaca e os cardiomiócitos derivados de células-tronco.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir um substrato de cultura de células biomiméticas por meio de litografia de força capilar para aplicações de engenharia de tecidos cardíacos.