Name: Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprenda a fabricar substratos biomiméticos para cultivo celular usando litografia por força capilar. Este método permite engenheirar tecidos cardíacos macroscópicos com padrões topográficos precisos para estudos de cardiomiocitos.

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D. H. Kim agradece ao Departamento de Bioengenharia da Universidade de Washington pelo novo fundo inicial do corpo docente. D. H. Kim também é apoiado pelo Prêmio Perkins Coie de Descoberta, pelo Prêmio de Parceria de Pesquisa Translacional da Fundação Wallace H. Coulter, pelo Fundo de Descoberta de Ciências da Vida do Estado de Washington e pelo Subsídio de Desenvolvimento de Cientistas da American Heart Association (13SDG14560076). J. Macadangdang e A. Jiao agradecem o apoio do NIH Bioengineering Bolsa de Treinamento Cardiovascular. O apoio adicional para este trabalho vem do R01HL111197 de subsídios do National Institutes of Health (NIH) a M. Regnier.

Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente (~ 23 ° C) a menos que indicado de outra forma. 1. Fabricação de Silicon Mestre <ol><li> Pastilha de silício Limpe com etanol ou xileno e seco de 100% em O 2 / N 2 gás. </li><li> Coloque bolacha de silício em spin-coater a velocidades de rotação de 2.000-4.000 rpm para produzir um filme de espessura de 0,3-0,5 um. </li><li> Padrão do filme foto-resistente com as dimensões correctas, usando um sistema de fotolitografia </li><li> Totalmente mergulhar as pastilhas de silício revestido de fotossensíveis estampados em um volume adequado de solução photoresist desenvolvimento. </li><li> Lavar as lâminas de silício revestido de fotossensíveis desenvolvidos com água deionizada. </li><li> Para formar matrizes de sub-mícron cumes escala com perto de paredes laterais verticais, profundo etch iônica reativa o silício exposto usando um sistema de ataque. </li><li> Remover o fotorresistente remanescente colocando a bolacha de silício em um sistema de incinerador do plasma. </li><li> Corte o silício wAfers com um cortador em mestres de silício dimensionadas adequadamente com ponta de diamante para moldagem réplica posterior. </li></ol> 2. Fabricação de PUA molde de silicone Mestre Nota: O volume a ser adicionado ao mestre de silício para nanofabrication irá variar, dependendo da área do mestre nanopatterned a ser replicado como também a viscosidade da solução (PUA) acrilato de poliuretano. <ol><li> Limpe a superfície mestre de silício com 100% de etanol ou xileno e seco sob O 2 / N 2 gás. </li><li> Coloque padrão mestre de silício lado em uma placa de Petri. </li><li> Para um mestre de silício com de 2 cm x 2 cm da superfície do teste padrão, pipeta 40 ul de PUA para a superfície do padrão. </li><li> Colocar uma folha de 4 cm x 4 cm transparente de poliéster (PET) de película sobre o PUA dispensado. </li><li> Pressione para baixo sobre a folha de PET e espalhar o PUA debaixo da folha em toda a face padrão, usando um rolo ou de superfície plana com arestas (tal como uma placa), de modo que a totalidadepadrão é coberto pelo pré-polímero PUA. </li><li> Coloque mestre de silício, pré-polímero, e PET aproximadamente 10 cm abaixo de uma luz de 20 watts (115 V) UV (λ = 365 nm) por 50 segundos. Para ser eficaz, o comprimento de onda de luz ultravioleta pode ser em qualquer lugar entre 310-400 nm. A intensidade da luz é de 10-15 mW / cm 2, na superfície do substrato. </li><li> Após a cura, remova filme PET lentamente com uma pinça. PUA deve anexar ao filme PET com uma negativa do mestre nanopattern silício. </li><li> Cure nanopatterns PUA / PET sob UV, durante pelo menos 12 horas antes de usar. Superexposição não é um problema. </li><li> Para limpar mestres de silício, coloque outro filme de PET em cima do mestre, sem a adição de PUA e expor à luz UV (λ = 365 nm) por 50 segundos e retire películas PET. Isto irá remover todos os monômeros não reagidos. </li><li> Enxágüe mestre de silício com 100% de etanol ou xileno e seco sob O 2 / N 2 gás. </li></ol> 3-A. Microusinagem poliuretano Polímero </p&gt; <ol><li> Preparar 25 milímetros de diâmetro lâminas de vidro circulares, introduzindo num compartimento de tratamento de ozono durante 10 min. </li><li> Coloque lâminas de vidro tratadas com ozônio em pequeno bloco PDMS para fácil manuseio. </li><li> Aplicar fina camada de aderência promotor superfície com pincel para lâminas de vidro. Ar lâminas de vidro seco durante 30 min. </li><li> Coloque a lâmina de vidro em um pedaço de papel da impressora. </li><li> Largue dispensar 10 ml de poliuretano (PU) pré-polímero (NOA 76) para o centro da lâmina de vidro. Certifique-se sem bolhas estão presentes após a adição. </li><li> Molde Lugar PUA, padrão de face para baixo, sobre a lâmina de vidro. Dispersar o PU uniformemente em toda a superfície da lâmina de vidro rolando um rolo de cilindro de borracha ao longo do molde PUA. Papel para impressora irá absorver excesso de polímero. </li><li> Lâmpada UV Watt. Tempo de polimerização do PU é dependente da potência da fonte de UV. </li><li> Retirar a amostra da fonte de luz UV e retire com cuidado o molde PUA de PU revestido lâmina de vidro. Polimerização do PU é considerado complete quando as cascas de molde PUA limpa distância a partir da amostra e a lamela de vidro de PU tem uma aparência iridiscente. </li><li> Coloque amostras terminados em dessecador para o armazenamento durante o tempo que um mês. </li></ol> 3b. Microusinagem Poli (láctido-co-glicólido) Hidrogel <ol><li> Criar um molde PDMS plana por vigorosa mistura silicone base de elastômero de silicone e agente de cura de elastômero em uma proporção de 10:1. </li><li> Despeje PDMS mistos solução precursora em uma placa de Petri de modo a que o precursor de PDMS atingir 5 mm até a borda do prato (isto é, de modo que o PDMS tem 5 mm de espessura). </li><li> Colocar uma placa de Petri e PDMS precursor num exsicador durante 1 hora para desgaseificar. </li><li> Mover uma placa de Petri e PDMS precursor num forno a 65 ° C durante pelo menos 2 horas para curar. </li><li> Depois de PDMS é curado, use uma navalha para cortar os PDMS planas em três centímetros x 3 cm seções quadrados. Estes serão os PDMS planas moldes utilizados mais tarde no processo de modelação. </li><li> Limpo 25 mm de diâmetro lâminas de vidro circular por plrastreio em álcool isopropílico, durante 30 min num sonicador de água. </li><li> Lâminas de vidro limpo a seco com menos de O 2 / N 2 gás. </li><li> Gota dispensar 100 ul de uma solução de PLGA (15% w / v de PLGA em clorofórmio) na lâmina de vidro. </li><li> Coloque um molde PDMS plana no topo do PLGA dispensado para absorver o solvente e obter uma superfície plana de PLGA. Aplicar uma ligeira pressão (~ 10 kPa), colocando um peso de 200 g na parte superior do PDMS de 5 min. </li><li> Lentamente descascar molde PDMS plana e colocar a tampa de vidro sobre um prato pré-aquecido (120 ° C) durante 5 minutos para remover o solvente residual e aumentar a aderência entre o PLGA e o vidro de cobertura. </li><li> Coloque o molde NP PUA no topo do PLGA plana e aplicar pressão constante (~ 100 kPa) e de calor (120 ° C) colocando um peso de 1 kg, em cima do molde de PUA, enquanto na placa de aquecimento durante 15 min. </li><li> Remover o peso de PLGA a tampa deslizante e permitir que o substrato arrefecer até à temperatura ambiente. Não retire o molde PUA até os substratos foramarrefecida. </li><li> Uma vez que os substratos tenham esfriado o suficiente, cuidadosamente descascar o molde NP PUA, revelando o substrato NP PLGA. O substrato NP PLGA deve ter uma aparência iridescente. </li><li> Coloque amostras terminados em dessecador para o armazenamento durante o tempo que um mês. </li></ol> 4. Sementeira e Cultura de Células NOTA: Este protocolo descreve a cultura de miócitos ventriculares de rato neonatal (NRVMs) e derivados de células humanas cardiomiócitos H7 estaminais embrionárias (hESC-MC), mas outras fontes de células podem ser utilizados. <ol><li> Anexar as lamelas ANFS (PU ou PLGA) para de 35 mm de cultura de tecidos de poliestireno prato. Pipetar 20 l de Norland Optical Adhesive (NOA83H) para o fundo do prato e colocar suavemente a lamela ANFS no topo da NOA. Permitir cola para se espalhar e cobrir todo fundo lamela. Cure NOA expondo prato a UV por 10 min. </li><li> Esterilizar ANFS lavando com 2 ml de solução aquosa de etanol a 70% durante 5 min, duas vezes. Remover eThanol por aspiração. Permitir ANFS para secar completamente ar por ~ 1 hora sob a esterilização lâmpada UV (λ = 200-290 nm) na cabine de segurança biológica. </li><li> Adesão celular é aumentada por revestimento do ANFS em fibronectina durante a noite. Dilui-se a fibronectina em água Dl a 5 ug / ml. Pipetar 2 ml da solução de fibronectina no prato. Colocar na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a noite (pelo menos 6 horas). </li><li> Obter NRVMs, hESC-CMs, ou outras células cardíacas de juros de acordo com os protocolos anteriores 22. </li><li> Centrífuga amostra de células a 1000 rpm durante 3 min para sedimentar as células. </li><li> Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento. </li><li> Ressuspender as células em meio de cultura adequado a uma concentração de 4,6 x 10 6 células / ml. </li><li> Pipetar cuidadosamente 200 mL de suspensão de células para ANFS esterilizados. Certifique-se de suspensão de células permanece na lamela. </li><li> Colocar as células em estufa a 37 ° C e 5%CO 2 para 4 horas para permitir que as células para anexar ao ANFS. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura quente para prato e substituir as células em estufa nas mesmas condições. </li><li> Após 24 h, retirar o suporte e lava-se com 2 mL de DPBS duas vezes para remover o excesso de células. </li><li> Adicionar 2 ml de meio de cultura quente para prato e substituir as células em estufa nas mesmas condições. Cultura as células a confluência. Substituir mídia todos os dias. </li></ol>

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<li>Kim, J., Hayward, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+dynamic+in+vivo+environments+with+stimuli-responsive+materials+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Mimicking dynamic in vivo environments with stimuli-responsive materials for cell culture.</a> Trends in Biotechnology. 30, 426-439 (2012).</li>
<li>Henderson, D. J., Anderson, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+and+Structure+of+the+Ventricles+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The Development and Structure of the Ventricles in the Human Heart.</a> Pediatr Cardiol. 30, 588-596 (2009).</li>
<li>Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Micropatterned+Cardiac+Cell+Cultures+with+Realistic+Ventricular+Microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysj%22%5BJournal%5D)">Novel Micropatterned Cardiac Cell Cultures with Realistic Ventricular Microstructure.</a> Biophysj. 96, 3873-3885 (2009).</li>
<li>Badrossamay, M. R., McIlwee, H. A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofiber+Assembly+by+Rotary+Jet-Spinning%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Nanofiber Assembly by Rotary Jet-Spinning.</a> Nano Lett. 10, 2257-2261 (2010).</li>
<li>Rao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microgrooved+culture+substrates+on+calcium+cycling+of+cardiac+myocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Tecidos cardíacos funcionalmente maduros faltam para tanto in vivo e in vitro em aplicações de engenharia de tecido cardíaco. Os métodos de nanofabricação CFL aqui descritas são técnicas robustas para alcançar o alinhamento celular e influenciando a função do tecido macroscópico devido à escalabilidade do sistema. Grandes áreas podem ser facilmente modelado e usado para a cultura de células. Alinhamento celular macroscópica é essencial em engenharia de tecido cardíaco, a fim de criar biomimético, tecid...

A doença cardiovascular é a principal causa de morbidade e mortalidade no mundo e apresentar um peso sócio-econômico importante em uma 1,17 já tenso sistema de saúde global. Engenharia de tecidos cardíacos tem dois objetivos distintos: (1) para regenerar miocárdio danificado após doença isquêmica ou cardiomiopatia ou (2) para a criação de um modelo de alta fidelidade do coração para a triagem de drogas in vitro ou modelagem doença. O coração é um órgão complexo que deve trabalhar constantemente para fornecer sangue para o corpo. Estruturas laminares densamente embalado de cardiomiócitos e tecidos de suporte são dispostos em padrões helicoidais em toda a parede do coração 18,19. O coração também é eletromecanicamente acoplada 20 em uma forma altamente coordenada para ejetar o sangue eficientemente para o corpo 21. Vários grandes obstáculos ainda precisam ser abordados, no entanto, antes de desenho intrincado da natureza pode ser reproduzido de forma confiável in vitro.Em primeiro lugar, embora os métodos de diferenciação de cardiomiócitos robustas continuam a ser desenvolvidos 22, HPSC-CMs ainda exibem fenótipos bastante imaturos. Suas propriedades eletromecânicas e morfologia mais se aproximam os níveis fetais 23. Em segundo lugar, quando mantidos em condições de cultivo tradicionais, tanto com células-tronco derivadas e cardiomiócitos primários não conseguem montar em, estruturas de tecido-como nativas. Pelo contrário, as células tornam-se orientadas aleatoriamente e não apresentam a aparência em forma de haste em faixas de miocárdio adulto 24. O ambiente da matriz extracelular (ECM) com os quais interagem as células desempenha um papel importante em numerosos processos celulares 11,13,25. A ECM é composto por sinais moleculares e topográficos complexos, bem definidas, que influenciam de forma significativa a estrutura e função das células de 6,26. Dentro do coração, o alinhamento celular segue de perto as fibras ECM escala nanométrica subjacente 2. O impacto destes nanotopographpistas icas em células e a função do tecido, no entanto, está longe de ser completamente entendido. Estudos preliminares de interação célula-biomaterial escala nanométrica indicam a potencial importância eo impacto da sub-mícron sugestões topográficas para sinalização celular 27, adesão 28-30, crescimento de 31, e de diferenciação 32,33. No entanto, devido à dificuldade no desenvolvimento de substratos nanofabricated reprodutíveis e expansíveis, tais estudos podem não reproduzir os efeitos celulares multi-escala do complexo em ambiente de ECM in vivo. Neste protocolo, uma técnica de nanofabricação simples e de baixo custo para a produção de scaffolds de cultura celular que imita fibra de alinhamento ECM cardíaca nativa é descrito, permitindo uma ampla gama de novas investigações de interações cardiomiócitos-biomaterial. Entender como cardiomiócitos interagir com o ambiente ECM nanoescala pode permitir a capacidade de controlar o comportamento celular para mais de perto imitar func tecido nativoção. Além disso, as monocamadas de células são um sistema experimental simplificado em comparação com estruturas 3D, mas ainda apresentam um comportamento multicelular complexo para investigações criteriosas e triagem funcional 2,34-36. Finalmente, tais suportes pode ser usada para melhorar a função do enxerto celular quando implantado no coração para efeitos de regeneração 37.

<table><tbody><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences</td><td>354008</td><td></td></tr><tr><td>NOA 76</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>7606B</td><td></td></tr><tr><td>Promotor de Adesão de Superfície (Primer de Vidro)</td> <td>Minuta Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PUA</td><td>Minuta Tech</td><td>MINS-311RM</td><td></td></tr><tr><td>Rolo de Borracha Macia</td><td>Speedball</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bolachas de Silício</td><td>NOVA Electronic Materials</td><td>FA01-9900</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist</td><td>Shipley</td><td>SPRT510</td><td></td></tr><tr><td>Photoresist Desenvolvedor</td>Sistema de litografia por feixe de <td>elétrons Shipley</td><td>MF320</td><td></td></tr><tr><td></td><td>JEOL</td><td>JBX-9300FS</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de gravação</td> Sistemas <td>de tecnologia de superfície</td><td>NP10 8UJ</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de asher de plasma</td><td>BMR Technology Co.</td><td>DSF-200</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Cura por Ozônio</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-O- 08</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Cura por Fusão</td><td>Minuta Tech</td><td>MT-UV-A 11</td><td></td></tr><tr><td>NOA 83H</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>8301</td><td></td></tr><tr><td>Spin Coater</td><td>Laurel Technology</td><td>WS-400-6NPP</td><td></td></tr><tr><td>Skyrol PET Film</td><td>SKC Co., Ltd.</td><td>23038-59-9</td><td></td></tr><tr><td>25 milímetros Corning</td><td></td><td>2948</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de Elastômero de Silicone</td><td>Kit Dow Corning</td><td>6/5/2553</td><td></td></tr><tr><td>Poli (D, L-lactide-co-glicolide)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P2191-1G</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>372978-1L</td><td></td></tr><tr><td>500 g Pesos</td><td>Global Insustrial</td><td>T9FB503120</td><td></td></tr><tr><td>Álcool isopropílico</td><td>EMD Millipore</td><td>PX1835-2</td><td></td></tr><tr><td>Placa Quente</td><td>Corning</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td>Branson B2510MTH</td><td></td></tr></tbody></table>

capilar força litografia de engenharia tecido cardíaco

Capillary Force Lithography for Cardiac Tissue Engineering

A doença cardiovascular continua a ser a principal causa de morte em todo o mundo 1. Engenharia de tecidos cardíacos muito promissora para entregar descobertas médicas inovadoras com os objectivos de desenvolvimento de tecidos funcionais para regeneração cardíaca, bem como ensaios in vitro de triagem. No entanto, a capacidade de criar modelos de alta fidelidade de tecido cardíaco tem sido difícil. Matriz extracelular do coração (ECM) é uma estrutura complexa composta de ambos os sinais bioquímicos e biomecânicos que variam a partir do micro-à escala nanométrica 2. Local condições de carga mecânica e interações célula-ECM foram recentemente reconhecidos como componentes vitais em engenharia de tecido cardíaco 3-5. Uma grande parte do ECM cardíaco é composto por fibras de colágeno alinhados com diâmetros em escala nano que influenciam significativamente a arquitetura do tecido e acoplamento eletromecânico 2. Infelizmente, alguns métodos have foram capazes de imitar a organização das fibras de ECM para baixo para a escala nanométrica. Os recentes avanços em técnicas de nanofabricação, no entanto, permitiram o projeto e fabricação de andaimes escaláveis ​​que imitam os sinais in vivo de rigidez estrutural e substrato do ECM no coração 6-9. Aqui apresentamos o desenvolvimento de duas reprodutíveis, os processos de microusinagem escaláveis ​​para o alinhamento funcional das células cardíacas usando o poli biocompatível polímero (ácido lático-co-glicólico) (PLGA) 8 e um poliuretano (PU) de polímero a base de custo-benefício, e. Estes substratos anisotropicamente nanofabricated (ANFS) imitar o ECM subjacente bem organizados, tecidos alinhados e pode ser utilizado para investigar o papel de nanotopografia na morfologia e função das células 10-14. Usando um mestre de silício nanopatterned (NP), como um modelo, um acrilato de poliuretano (PUA) molde é fabricado. Este molde PUA é então utilizado para pattern o hidrogel PU ou PLGA via assistida por UV ou litografia força capilar mediada por solvente (CFL), respectivamente 15,16. Resumidamente, PU ou PLGA de pré-polímero é gota dispensada para uma lamela de vidro e o molde PUA é colocada em cima. Para CFL assistida por UV, a UP é então exposto à radiação ultravioleta (λ = 250-400 nm) para a cura. Para mediada por solvente CFL, o PLGA é gravado utilizando calor (120 ° C) e pressão (100 kPa). Após a cura, o molde PUA é retirado, deixando para trás um ANFS para cultura de células. Pilhas, como miócitos ventriculares de ratos neonatos, bem como cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas, pode ser mantido no ANFS 2.

A Figura 1 é uma vista geral esquemática do processo de produção para os dois métodos de fabrico. Devido à difracção da luz causada pela topografia nanoescala, microusinagem deve resultar numa superfície iridescente ao ANFS. Figura 2 representa essa superfície iridescente num bem modelado 25 milímetros NP-PU lamela (Figura 2A) com rebordo 800 nm e ranhura largura (Figura 2B). A aparência iridescente do ANFS vai variar um pouco dependendo do cume e sulco...

Neste protocolo, demonstramos a fabricação de substratos biomiméticos de cultura de células cardíacas feitos de dois materiais poliméricos distintos usando litografia de força capilar. Os métodos descritos fornecem uma técnica escalável e econômica para projetar a estrutura e a função dos tecidos cardíacos macroscópicos para aplicações in vitro e in vivo.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

Cardiovascular disease remains the leading cause of death worldwide1. Cardiac tissue engineering holds much promise to deliver groundbreaking medical ...

O objetivo geral deste procedimento é produzir substratos de cultura celular biomiméticos para engenhar a estrutura e a função de tecidos cardíacos em escala macroscópica. Isso é realizado primeiramente fabricando-se um molde de silicone com a arquitetura topográfica desejada por meio de gravação iônica reativa profunda. O segundo passo consiste em transferir o padrão topográfico desejado do molde de silício para um molde de PUA utilizando litografia por força capilar assistida por UV.Em seguida, o molde de PUA é usado como molde para fabricar substratos para cultivo celular a partir de diversos materiais poliméricos, dependendo da aplicação desejada, por meio de litografia por força capilar assistida por UV ou mediada por solvente. O passo final consiste em semear cardiomiócitos derivados de células primárias ou de células-tronco nos substratos para cultivo celular com padrão nanométrico para análises subsequentes. Por fim, são utilizadas microscopia de campo claro e imunofluorescência para demonstrar alterações na morfologia celular e no arranjo das proteínas contráteis dentro dos cardiomiócitos.A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a impressão por microcontato, é que a litografia por força capilar produz substratos de cultura celular com padrões nanométricos que podem induzir o alinhamento estrutural de monocamadas de tecido cardíaco sem depender da proliferação ou migração celular. Embora este método possa ser usado para investigar a relação entre estrutura e função em tecidos cardíacos, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a mecanobiologia do câncer. Para estudar o impacto da topografia da matriz na migração celular, inicie este procedimento limpando a superfície do molde de silício com etanol 100% ou xileno e seque com gás oxigênio ou nitrogênio.Em seguida, posicione o molde mestre de silício com o lado do padrão voltado para cima em uma placa de Petri; para um molde mestre com uma superfície padronizada de dois centímetros por dois centímetros, pipete 40 microlitros de PUA sobre ele. Em seguida, coloque uma folha de filme de poliéster transparente de quatro centímetros por quatro centímetros sobre o PUA depositado, pressione a folha de PET e espalhe o PUA por baixo da folha sobre toda a superfície do padrão utilizando um rolo ou uma superfície plana, de modo que todo o padrão fique coberto pelo pré-polímero de PUA. Então, posicione o molde de silício com o pré-polímero e a folha de PET aproximadamente 10 centímetros abaixo de uma lâmpada UV de 20 watts por 50 segundos.Após a cura, remova lentamente o filme de PET com pinça. O PUA deve aderir ao filme de PET com um negativo do nano padrão do Molde de Silício. Em seguida, cure os nano padrões de P-U-A-P-E-T sob UV por pelo menos 12 horas antes do uso.Para limpar os moldes de silício, coloque outro filme de PET sobre o molde sem a adição de PUA. Exponha à luz UV por 50 segundos e remova o filme de PET. Em seguida, enxágue o molde de silício com etanol a 100% ou xileno e seque sob fluxo de gás oxigênio e nitrogênio.Neste procedimento, trate lâminas de vidro circulares com diâmetro de 18 milímetros colocando-as em uma câmara de ozônio por 10 minutos. Em seguida, posicione as lâminas sobre blocos de PDMS para fixá-las temporariamente e facilitar o manuseio. A seguir, aplique uma camada de primer de vidro sobre a superfície da lâmina de vidro.Deixe o primer secar ao ar por 30 minutos. Agora coloque as lâminas de vidro sobre uma folha de papel sulfite. Adicione 10 microlitros de pré-polímero de poliuretano no centro de cada lâmina de vidro e certifique-se de que não se formem bolhas.Em seguida, posicione o molde de PUA com a face do padrão voltada para baixo sobre a lâmina de vidro, espalhando o pré-polímero de PU uniformemente pela superfície da lâmina com um rolo cilíndrico de borracha ao longo do molde de PUA. O papel de impressão absorverá o excesso de polímero. Em seguida, realize a cura UV por 60 segundos sob uma lâmpada UV de 20 watts. Posteriormente, remova a amostra da fonte de luz UV e retire cuidadosamente o molde de PUA da lâmina de vidro revestida com PU. Considera-se completa a polimerização do PU.Quando a forma de PUA destacar limamente da amostra e a lâmina de vidro de PU apresentar uma aparência iridescente, coloque as amostras em um dessecador para armazenamento por até um mês. Agora, fixe lamínulas de NFS a um prato de poliestireno para cultura de tecidos de 35 milímetros e pipete 20 microlitros de NOA no fundo do prato. Coloque suavemente a lamínula de NPPU sobre o NOA e deixe a cola espalhar-se e cobrir completamente a parte inferior da lamínula; em seguida, cure o NOA expondo o prato à luz UV por 10 minutos.Em seguida, esterilize os SUBSTRATOS NP lavando-os duas vezes com dois mililitros de solução aquosa de etanol 70% por cinco minutos cada. Remova o etanol por aspiração. Deixe o A NFS secar completamente ao ar por cerca de uma hora sob a lâmpada de esterilização UV na cabine de segurança biológica.Para melhorar a adesão celular, recubra a A NFS com fibronectina durante a noite, diluindo primeiro a fibronectina em água destilada até cinco microgramas por mililitro. Em seguida, pipete dois mililitros da solução de fibronectina em uma placa. Depois, coloque a A NFS no incubador a 37 graus Celsius e 5%CO2 durante a noite.Obtenha VMs NR, CMS de CESH ou outras células cardíacas de interesse, centrifugue a amostra celular a 1000 RPM durante três minutos para obter o pellet celular. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração e certifique-se de não perturbar o pellet. Em seguida, re-suspenda as células em meio de cultura até uma concentração de 4,6 vezes 10 à sexta células por mililitro.Pipete cuidadosamente 200 microlitros de suspensão celular sobre o A NFS esterilizado e certifique-se de que a suspensão celular permaneça sobre o lamínula. Em seguida, coloque as células no incubador a 37 graus Celsius e 5%CO₂ por quatro horas para permitir que as células adiram ao A NFS. Então, adicione dois mililitros de meio de cultura adicional aquecido à placa e coloque novamente as células no incubador nas mesmas condições.Após 24 horas, remova o meio e lave com dois mililitros de DPBS duas vezes para remover as células em excesso. Em seguida, adicione dois mililitros de meio de cultura morno ao recipiente. Coloque as células em uma incubadora sob as mesmas condições e mantenha o cultivo.As células em confluência têm o meio substituído a cada dois dias. Esta figura mostra imagens representativas de campo claro de VMs de RN após sete dias de cultivo e CMS de cÉSH. Após 48 horas de cultivo, VMs de RN e CMS de cÉSH nas superfícies NP exibem nítida anisotropia estrutural e alinhamento, enquanto os cardiomiócitos em superfícies com padrão UN estão orientados aleatoriamente.A análise imunohistoquímica destaca o impacto da nano-topografia no alinhamento do citoesqueleto celular, nos filamentos de actina e na actina alfa sarcomérica. Nas células cultivadas sobre NFS A, esses elementos se alinham ao longo das nano-cristas, mas permanecem distribuídos aleatoriamente nas células sobre substratos não padronizados. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de esterilizar os substratos antes do cultivo celular, pois a contaminação pode se tornar um grande problema após o desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores em biologia cardiovascular explorarem a maturação cardíaca e os cardiomiócitos derivados de células-tronco.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como produzir substratos biomiméticos para cultivo celular por meio da litografia por força capilar para aplicações em engenharia de tecidos cardíacos.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

A geração de alinhados tecido do miocárdio é um requisito fundamental para a adaptação dos avanços recentes em biologia de células-tronco para fins clinicamente úteis. Descrevemos aqui uma abordagem impressão microcontact para o controlo preciso da forma e função celular. Usando populações altamente purificadas de células-tronco embrionárias derivadas progenitores cardíacos, nós, então, gerar tecido funcional anisotrópica do miocárdio.

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Apresentamos um método para deposição microfluídica de genipina e fibronectina padronizadas em substratos PDMS, permitindo a viabilidade estendida de tecidos densos de células musculares lisas vasculares. Este método de fabricação de tecidos é combinado com a tecnologia anterior de filme fino muscular vascular para medir a contratilidade vascular ao longo de cursos de tempo relevantes para a doença.

Técnica microfluídico genipina Deposição de Cultura Extensão da micropatterned vasculares musculares Filmes Finos

Este manuscrito descreve a criação de tecidos cardíacos projetados definidos usando expressão de marcadores de superfície e classificação celular. Os tecidos definidos podem então ser usados em um biorreator multitecido para investigar os mecanismos da terapia com células cardíacas, a fim de fornecer um sistema modelo funcional, mas controlado, do coração humano.

Construção de Engineered Definido cardíaca humana Tecidos para estudar os mecanismos da terapia celular cardíaca

Este protocolo descreve a bioprinção 3D do tecido cardíaco sem o uso de biomateriais. Os remendos cardíacos bioprinted 3D apresentam integração mecânica de esferóides componentes e são altamente promissores na regeneração do tecido cardíaco e como modelos 3D de doenças cardíacas.

Criação de tecido cardíaco exibindo integração mecânica de esferóides usando 3D Bioprinting

Nós fornecemos um protocolo generalizado, baseado em uma estratégia de bioprinting microfluidic para engenharia uma cama vascular microfibrous, onde um tipo da pilha secundária poderia ser mais propagado para o espaço intersticial dessa estrutura microfibrous para gerar organoids e tecidos vascularizados.

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Aqui apresentamos um método rápido, fácil e baixo custo para a fabricação de moldes de polidimetilsiloxano personalizado que podem ser usados para a produção de tecidos de engenharia baseada em hidrogel com geometrias complexas. Adicionalmente descrevemos os resultados de avaliações mecânicas e histológicos realizados na engenharia tecidos cardíacos produzidos utilizando esta técnica.

Custom Engineered moldes de cultura de tecidos de Masters gravados a Laser

Este protocolo introduz um método de micropadronização livre de litografia que é simples e acessível para aqueles com um fundo de bioengenharia limitado. Este método utiliza estêncil personalizado de corte a laser para micropadrão proteínas de matriz extracelular em uma forma de interesse para modulação de morfologias celulares. O procedimento de micropadronização é demonstrado usando cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

Micropadronização simples de células únicas sem litografia usando estêncil cortado a laser

Os tecidos projetados dependem fortemente de redes vasculares adequadas para fornecer nutrientes e gases vitais e remover resíduos metabólicos. Neste trabalho, um protocolo de semeadura passo a passo de células endoteliais e células de suporte cria redes vasculares altamente organizadas em uma plataforma de alta produtividade para estudar o desenvolvimento do comportamento da embarcação em um ambiente 3D controlado.

Semeadura de células stepwise em andaimes tesavendados para estudar vasos sanguíneos brotando

Tecidos cardíacos tridimensionais bioprojetados usando cardiomiócitos derivados de células-tronco têm emergido como modelos promissores para estudar o miocárdio humano saudável e doente in vitro , enquanto recapitulam aspectos-chave do nicho cardíaco nativo. Este manuscrito descreve um protocolo para fabricação e análise de tecidos cardíacos projetados de alto conteúdo gerados a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos.

Projetando um Biorreator para Melhorar a Aquisição de Dados e Modelar o Rendimento de Tecidos Cardíacos Projetados

O uso da luz para controlar células e tecidos cardíacos permite a estimulação sem contato, preservando assim o estado natural e a função das células, tornando-se uma abordagem valiosa tanto para pesquisa básica quanto para aplicações terapêuticas.

Um sistema microfisiológico cardíaco para estudar a propagação de Ca2+ via estimulação óptica não genética

Um método reprodutível é apresentado para gerar tecidos miocárdicos 3D combinando scaffolds de escrita eletrospinning (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogéis de fibrina com cardiomiócitos e fibroblastos derivados de hiPSC. Essa técnica oferece controle preciso sobre a arquitetura do andaime e pode ser aplicada em testes pré-clínicos de medicamentos e modelagem de doenças cardíacas.

Geração de tecido miocárdico humano 3D usando escrita eletrogiratória por fusão de andaimes de policaprolactona e células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprenda a fabricar substratos biomiméticos para cultivo celular usando litografia por força capilar. Este método permite engenheirar tecidos cardíacos macroscópicos com padrões topográficos precisos para estudos de cardiomiocitos.

Capilar Força Litografia de Engenharia tecido cardíaco

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