Imagens ao vivo de Proteínas GFP-rotulados em Drosophila Oócitos

Neste protocolo, os citos que expressam proteínas marcadas com GFP são dissecados de drosófilas fêmeas e fotografados para estudar o movimento da proteína em células vivas. Primeiro, prepare uma câmara de visualização afixando duas lamínulas em uma lâmina usando graxa de silicone para formar um canal. Os lados do canal são revestidos com óleo de carbono halo.

Em seguida, disseque os ovários de uma mulher em uma gota de óleo de carbono halo em uma lamínula. Em seguida, isole os citos individuais e inverta a lamínula sobre o canal no slide preparado para criar uma câmara de visualização. Depois de localizar os citos com óptica de campo claro ou DIC, capture imagens digitais em intervalos de tempo definidos usando microscopia confocal e software associado.

Em última análise, uma sequência de lapso de tempo das imagens geradas pode ser usada para monitorar o movimento de proteínas ou partículas em células vivas ao longo do tempo. Este método pode ajudar a investigar áreas-chave na biologia celular e do desenvolvimento, como o tráfego de proteínas e mRNA e o estabelecimento da polaridade celular. Primeiro anestesiar as moscas saudáveis com menos de uma semana de idade e selecionar 10 a 15 fêmeas grandes com abdômen arredondado de cor creme.

Transfira as moscas selecionadas e alguns machos para um frasco contendo alimentos novos levemente fermentados. Em seguida, incube as moscas por dois dias a 25 graus Celsius para engordar. A engorda das moscas garante que uma variedade de estágios, especialmente os estágios oito a 12, estejam disponíveis para obter imagens de moscas não engordadas ou moscas mal engordadas geralmente contêm apenas estágios muito iniciais e citos maduros usando graxa de silicone.

Fixe duas lamínulas com aproximadamente um centímetro de distância em uma lâmina de vidro padrão. Use graxa suficiente apenas para garantir uma boa vedação entre a lamínula e a corrediça. Pressione firmemente cada lamínula para espalhar a graxa de maneira fina e uniforme.

Em seguida, adicione um pouco de óleo de carbono sagrado 27 à junção entre as lamínulas e deslize para evitar ferir os citos isolados nas etapas subsequentes. Agora coloque duas a três gotas de óleo de carbono 27 na superfície de uma lamínula de 22 milímetros quadrados. Em seguida, pipetar uma fêmea individual do frasco de comida e depositá-la suavemente no halo Óleo de Caron.

Usando uma pinça de dissecação afiada, prenda a mosca contra a lamínula e puxe a ponta do abdômen. Remova os ovários arrastando-os ao longo da superfície da lamínula sob o óleo para promover a adesão dos citos à lamínula. Agora, separe suavemente os ovários procurando por citos que estejam pelo menos no estágio 10 B da Oogênese.

Identifique os oócitos nesta fase procurando câmaras de ovos nas quais o oócito ocupe pelo menos 50 a 60% do volume total da câmara de ovos. Usando fórceps. Remova oócitos individuais da bainha ovial usando uma a três fêmeas.

Continue a isolar cinco a oito oócitos não danificados na lamínula. Em seguida, remova qualquer tecido inutilizável. Inverta cuidadosamente a lamínula contendo os oócitos na lâmina pré-preparada para que os citos fiquem posicionados entre os dois espaçadores.

E lembre-se, não pressione a lamínula, pois isso pode danificar os citadores, se necessário, adicione uma pequena quantidade de óleo de carbono halo nas bordas do sanduíche para garantir que o espaço seja preenchido. Observe que, neste ponto da oogênese, as células foliculares que recobrem o oócito tornaram-se coercidas e circundam o oócito por todos os lados, exceto por uma pequena região onde as conexões com as células enfermeiras permanecem. Coloque um oócito em foco usando DIC ou óptica de contraste de fase.

Examine o oócito em busca de sinais de danos, como vazamento de citoplasma ou abaulamento de células foliculares. Visualize apenas os oócitos que parecem saudáveis e não danificados. Para monitorar o streaming diretamente sem rotulagem GFP.

Defina imagens de captura na faixa ZI do osciloscópio com configurações de ganho mais altas do que aquelas usadas para proteínas marcadas com GFP. Usando objetivas aéreas para minimizar bastante a deriva e o movimento da amostra. Obtenha seções ópticas logo abaixo da superfície do oócito.

Quando uma região de interesse estiver em foco, desligue a óptica de campo claro e mude para a imagem confocal usando a função de visualização de varredura rápida do software, ajuste o foco e o ganho conforme necessário. Além disso, defina os parâmetros de excitação, comprimento de onda e comprimento de onda de emissão. Para a captura do eixo Z, selecione um eixo Z constante com um atraso de 10 segundos entre os quadros.

Depois de capturar uma sequência típica de lapso de tempo entre 20 e 50 quadros, revise e avalie imediatamente a qualidade do vídeo. Esta imagem de lapso de tempo único mostra um oócito de estágio 11. Este oócito expressando a proteína marcada com GFP R TNL pode produzir um sinal forte.

R TNL um parece co-localizar com os longos microtúbulos presentes durante o fluxo plasmático op. Normalmente, o fluxo opplasmático em uma câmara de ovos do tipo selvagem é evidente como movimento perceptível de vesículas de ilk autofluorescentes, conforme mostrado em uma projeção máxima de cinco quadros de uma câmara de ovos do estágio 10 B. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar citos fêmeas saudáveis que expressam proteínas marcadas com GFP, como preparar amostras para imagens ao vivo e como fazer vídeos de lapso de tempo de proteínas e partículas fluorescentes.