Name: Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Aprenda a medir danos no DNA em neurônios do hipocampo usando o ensaio cometa. Este método sensível permite quantificar quebras de fita simples e dupla por eletroforese, auxiliando pesquisas em neurodegeneração.

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Este trabalho foi financiado pelo Prêmio IMPACTO do Departamento de Radiação Oncológica da Universidade de Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, da Fundação da Criança de combate o câncer, ea Gabrielle Anjo (Fundação para ESY.).

1. Cultura de Células <ol><li> Cultura de células neuronais e tratá-los conforme necessário. </li><li> Células de colheita em tubos de 15 ml: meios de aspiração, lavar com solução salina tamponada com fosfato (PBS, cálcio e magnésio livre), adicionar tripsina, recolher em tubos de 15 ml e neutralizar a tripsina com meio contendo soro apropriadas. </li><li> Centrifugação a 1000 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar mídia. </li><li> Ressuspender as células em PBS. </li><li> Centrifugação a 1000 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar mídia e Ressuspender as células em PBS fresco. </li><li> Contar as células usando um hemocitômetro ou seu contador de células preferido. </li><li> Amostras de células deve ser preparado imediatamente antes de iniciar o ensaio. </li><li> Todas as amostras devem ser tratadas à luz escura ou amarelo para impedir o dano ao DNA da luz ultravioleta. </li></ol> 2. Ensaio Cometa 1. Preparação de slides <ol><li> Melt agarose a 1% (1 g / 100 ml em 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA, TBE) em um forno de microondas durante 3 minutos até que todos os grânulos desaparecer. </li><li> Dip slides em a agarose fundido e limpe um lado limpar com um Kimwipe. Permitir que a agarose de ar seco a uma película transparente. Isto pode ser feito com antecedência e as lâminas podem ser armazenadas. </li></ol> 2. Ensaio do Cometa Neutral <ol><li> Solução frio de lise (2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% de sódio sarcosinato de laurilo e Triton 1% X-100, pH 10) a 4 ° C durante pelo menos 1 hora antes da utilização. </li><li> 2.2.2. Derreta 1% baixo de derretimento ponto de de agarose a (1 g / 100ml em 1X Tris Base de Dados de, o ácido Boric, EDTA), em um forno de microondas para 3 min até que todos os grânulos de desaparecer. A agarose tem de ser arrefecida a 37 ° C num banho de água para evitar a indução artificial da cauda do cometa. Idealmente, a agarose precisa de ser arrefecida durante meia hora, antes da utilização. </li><li> 2.2.3. Diluiu-se a suspensão de células, de modo que há 100.000 células por ml. Combina-se o suspensão de células de com o baixo de derretimento ponto de de agarose a (at 37 ° C) menosuma proporção de 1:10 (v / v), de forma breve vórtice e, imediatamente pipetar 50 uL para a corrediça Comet. Usar o lado da ponta da pipeta para espalhar a suspensão de células de maneira uniforme sobre a área da amostra. Cada grupo de tratamento deve ser pelo menos em triplicado. </li><li> Lugar desliza para plana em geladeira por 30 min até que uma círculo aparece em a periferia de o slide. </li><li> Prechill a solução de de lise e slides de submergiria em esta solução de para 30 min no escuro e à 4 ° C (ou em um refrigerador). </li><li> Decantar ou aspirar a solução para lise e adicionar 1X tampão de electroforese de ponto morto (base Tris, ácido bórico, EDTA 1X TBE). Deixe lâminas neste tampão por meia hora na geladeira. </li><li> Adicionar tampão Eletroforese previamente arrefecido 1X Neutro (TBE) em câmara de eletroforese, slides Colocar na bandeja deslizante eletroforese. Alinhe os slides para que eles sejam equidistantes eletrodos. </li><li> Despeje 1X eletroforese neutro tampão até 0,2 centímetros acima slides. Tampão em excesso será entreFere com eletroforese. </li><li> Definir a tensão de alimentação de 1 V por cm (medida de eléctrodo para eléctrodo) e funcionou durante 30 minutos a 4 ° C (ou o quarto frio), no escuro. </li></ol> 3. Ensaio Cometa alcalino <ol><li> Solução frio de lise (2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% de sódio sarcosinato de laurilo e Triton 1% X-100, pH 10) a 4 ° C durante pelo menos 1 hora antes da utilização. </li><li> Melt 1% baixo ponto de fusão de agarose (1 g / 100 ml em 1X Tris Base, ácido bórico, EDTA) em um forno de microondas durante 3 minutos até que todos os grânulos desaparecer. Em seguida, arrefeceu-se num 37 banho de água ° C durante pelo menos 30 min. </li><li> Combinar as células a 1 x 105 ml / com fundido baixo ponto de fusão de agarose (a 37 ° C) numa razão de 1:10 (v / v), de forma breve vórtice e, imediatamente pipetar 50 uL para a corrediça Comet. Usar o lado da ponta da pipeta para espalhar a suspensão de células de maneira uniforme sobre a área da amostra. Cada grupo de tratamento deve ser pelo menos em triplicado. </li><li> Lugar deslizoues plana em geladeira por 30 min até que uma círculo aparece em a periferia de o slide. </li><li> Imergir as lâminas em solução de lise previamente arrefecido e deixar a 4 ° C durante 1 hora a durante a noite no escuro. </li><li> Remover as lâminas a partir da solução de lise, drenar as lâminas e lavar uma vez com tampão de neutralização fria durante 5 minutos para remover o detergente residual e sais antes do passo de álcali desenrolamento. </li><li> Colocar as lâminas numa câmara de electroforese em gel cheia com tampão de electroforese previamente arrefecido feita recentemente (300 mM de NaOH, 1 mM EDTA, pH&gt; 13) não superior a 0,5 cm acima slides. Alinhe os slides para que eles sejam equidistantes eletrodos. </li><li> Deixe lâminas sentar no tampão alcalino durante 30 min no escuro para permitir desenrolamento do DNA e a expressão de álcali susceptível de dano. </li><li> Definir a tensão de alimentação de 1 V por cm (medida de eléctrodo para eléctrodo) e funcionou durante 30 minutos a 4 ° C (ou na sala de frio). </li></ol> 4. Fixação e StaCélulas Ining <ol><li> Escorra Tampão Eletroforese excesso </li><li> Imergir desliza em pré-refrigerada a água destilada durante 5 min à TA. </li><li> Imergir as lâminas em pré-arrefecida de etanol a 70% durante 5 min à TA. </li><li> As amostras secas durante a noite. Não exponha slides para luz brilhante. As amostras podem ser armazenadas durante meses à temperatura ambiente antes de marcar nesta fase. </li><li> Corar as lâminas por imersão em SYBR Green (1X diluído em PBS) durante 20 minutos no frigorífico. </li><li> Retirar as lâminas e permitir que-los o secar completamente,, no escuro. A agarose vai se tornar transparente quando está completamente seca. </li></ol> 4. Aquisição e Análise de Imagem <ol><li> Adquirir imagens usando microscópio de fluorescência definida para o filtro verde (Zeiss AxioVision) e analisar usando Comet software Ensaio (Instrumentos perceptivos). </li><li> Clique no botão &quot;cabeça cometa&quot; (do núcleo) e o software calcula os parâmetros, incluindo o momento da cauda médio e quantidade de DNA nonúcleo. </li><li> Analisar, pelo menos, 200 células por tratamento. </li><li> Exportar dados para o Microsoft Excel. </li><li> Calcular significar momento da cauda para cada grupo de tratamento e dados de plotagem como apropriado. </li></ol> 5. Resultados representativos Um exemplo de análise cometa ensaio em células neuronais é mostrado na Figura 2 e Figura 3. Neste caso, a irradiação das células neuronais induz danos no ADN. À medida que as células são submetidas ao campo eléctrico, o DNA migra a taxas diferentes, devido às diferenças no tamanho, que é subsequentemente analisados ​​utilizando o software Assay Comet. Quanto mais os danos no DNA, o mais distante do DNA migra para fora do núcleo. Este diminui a intensidade de fluorescente em o núcleo a qual é subsequentemente escolhido acima por o software e os resultados da em momento mais elevado cauda. A Tabela 1 retrata uma tabela de representante a partir de análise de cometa ensaio de e A Figura 4 mostra um repretativo gráfico comparando danos ao DNA em células neuronais após radiação medida pelo ensaio cometa. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Gráfico Fluxo de de o ensaio de cometa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver figura maior</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Imagens representativas de células neuronais (A), sem e (B) com a cauda do cometa. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Análise ensaio do cometa usando um software de Ensaio Cometa. (A) tiros Representante de tela de imagem adquirida usando Carl microscópio Zeiss fluorescente e analisados ​​utilizando CometSoftware de Ensaio. (B) Clicando sobre o núcleo ou a &quot;cabeça cometa&quot; (circulado em verde) gera um mapa fluorescente e gráfico (circulado em amarelo) e (C) tabela de dados (circulado em vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="Figura 4"/> Figura 4. Gráfico representativas obtidas através da representação gráfica do momento da cauda médio obtido por análise de danos ao DNA em irradiados e não irradiados células neuronais utilizando o ensaio cometa neutro. Como esperado, a radiação 3Gy (x-ray) induz danos no ADN, como representado pela maior momento médio cauda nas células irradiadas neuronais. Mostrado é o momento da cauda média (+ / - erro padrão), ** P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="Tabela 1"/> Tabela 1. </strong&gt; tabela Representante obtido pelo cometa análise ensaio em irradiados e não irradiados células neuronais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> .

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
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<li>Collins, A. R., Harrington, V., Drew, J., Melvin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+modulation+of+DNA+repair+in+a+human+intervention+study%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Nutritional modulation of DNA repair in a human intervention study.</a> Carcinogenesis. 24, 511-515 (2003).</li>
<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O teste do cometa tem a capacidade única de analisar células individuais. Isto é vantajoso na identificação de subpopulações de células que demonstram respostas diferenciais aos agentes citotóxicos. Algumas limitações práticas têm de ser tidas em conta. O número de células que podem ser avaliadas individualmente podem variar, dependendo do indivíduo. O tamanho da amostra tem de ser aumentada, se há uma variedade de lesões do ADN dentro de uma população. Suspensão de uma única célula viável é crítica para este ensaio uma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários (opcional) </td></tr><tr><td> Tubos de 1,5 ml </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> TBE 10X (Tris-base, o ácido bórico, EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> 15 ml de tubo </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Folha de alumínio </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Proveta </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugador </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Cometa software Ensaio </td><td> Comet Assay IV Sistema de Análise de Imagem </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cilindro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Câmara de eletroforese </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio fluorescente </td><td> Zeiss Axio Vision </td><td></td><td> Qualquer microscópio de fluorescência com filtro verde bastará </td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> Baixo ponto de fusão agarose </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Microonda </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Salina tamponada com fosfato, cálcio, magnésio, livre livre </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Fonte de alimentação </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Geladeira </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Governante </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deslizar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> De hidróxido de sódio </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Lauril sarcosinato </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Bandeja </td><td> Fisela Científico </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Tris Base </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Vórtice </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Banho de água </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

ensaio danos no dna em neurônios do hipocampo usando o ensaio cometa

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Um certo número de drogas como alvo as vias de reparação do ADN e induzem a morte de células através da criação de danos no DNA. Assim, os processos para medir directamente danos no ADN têm sido extensivamente estudados. Os métodos tradicionais são o tempo de consuming, de recursos,, caro, intensivo e requerem células de replicadoras. Em contraste, o ensaio cometa, uma única célula de ensaio de electroforese em gel, é mais rápido, não invasivo, medida, de baixo custo directo e sensível de danos no DNA e de reparação. Todas as formas de danos no DNA, bem como a reparação do ADN pode ser visualizado no nível de célula única usando esta técnica poderosa. O princípio subjacente ao doseamento é que cometa DNA intacto é altamente ordenada ao passo que o dano ao DNA interrompe essa organização. Os danificadas escoa de ADN na matriz de agarose e quando sujeito a um campo eléctrico, o DNA carregado negativamente migra em direcção ao cátodo, que está carregado positivamente. As grandes cadeias de DNA não danificadas não são capazes de migrar longe do núcleo. Danos no DNAcria fragmentos menores de DNA que viajam mais longe do que o DNA intacta. Comet Assay, um software de de análise de imagem, as medidas de e compara o global de intensidade de fluorescente de o DNA em o com um núcleo com DNA de que tenha migrado para fora de o núcleo. Sinal fluorescente do DNA migrado é proporcional aos danos de DNA. Tail DNA mais brilhante significa danos no DNA aumentada. Alguns dos parâmetros que são medidos são momento da cauda, ​​que é uma medida de tanto a quantidade de ADN e de distribuição de ADN no comprimento da cauda a cauda, ​​e percentagem de DNA na cauda. Este ensaio permite medir a reparação do ADN, bem desde resolução de danos no DNA significa reparação teve lugar. O limite de sensibilidade é de aproximadamente 50 quebras na cadeia por diplóide 1,2 células de mamíferos. As células tratadas com quaisquer agentes que danificam o ADN, tais como o etoposido, pode ser utilizado como um controlo positivo. Assim, o teste do cometa é um procedimento rápido e eficaz para avaliar os danos do DNA.

O ensaio cometa é uma forma eficiente de detectar quebras simples e de fita dupla, incluindo álcali-lábeis sites e DNA-DNA/DNA-protein ligações cruzadas no DNA em todas as células, incluindo neurônios do hipocampo. O método tira partido da migração diferencial de DNA num campo eléctrico devido a diferenças na quantidade de danos no DNA.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

O objetivo geral deste procedimento é medir e quantificar a quantidade de danos ao DNA em neurônios usando o ensaio COMET. Isso é feito expondo primeiro os neurônios a várias condições prejudiciais ao DNA, coletando os neurônios e misturando-os com aros de baixo ponto de fusão. O segundo passo é imobilizar os neurônios em lâminas.Em seguida, os neurônios são lisados e submetidos à eletroforese na etapa final. O DNA está manchado de verde cibernético. Em última análise, a microscopia de fluorescência e o software de ensaio COMET são usados para visualizar e quantificar os níveis de danos ao DNA em neurônios individuais.Olá, meu nome é Eddie Yang e sou professor assistente no Departamento de Oncologia de Radiação da Universidade do Alabama em Birmingham. Hoje, demonstraremos o ensaio COMET, que é um método simples para detectar danos ao DNA nas células. A principal vantagem desta técnica sobre outros métodos existentes, como a coloração Gamma H de dois focos A X, bem como a eletroforese em gel de campo de pulso, é que esta técnica é um método direto e sensível para medir danos ao DNA.Além disso, com pequenas modificações dessa técnica, o tipo de dano ao DNA pode ser determinado porque muitas terapias contra o câncer agem induzindo danos ao DNA em tumores e muitas vezes agem alterando a capacidade de reparo do DNA. As implicações dessa técnica podem ser estendidas para a eficácia da terapia do câncer. Demonstrando o procedimento hoje estará a Sra. Samara Noshin, assistente de pesquisa do meu laboratório, Comece colhendo células neuronais tratadas nas circunstâncias experimentais desejadas em tubos de 15 mililitros.Gire os tubos por cinco minutos a 1000 vezes G e quatro graus Celsius após aspirar o resus sobrenadante. Suspenda o pellet em PBS e gire as células novamente após a segunda lavagem. Resus suspende as células em mais PBS, conte-as e mantenha-as no escuro até serem usadas no ensaio do cometa.Para evitar danos ao DNA antes de iniciar o ensaio de vir, derreta 1%aros no micro-ondas por três minutos até que todos os grânulos desapareçam. Em seguida, mergulhe as lâminas nos agros derretidos e limpe um lado com um lenço Kim. Deixe os agros secarem ao ar até formar um filme transparente enquanto os agros secam a solução de lise fria a quatro graus Celsius por pelo menos uma hora e derreta mais.1% baixo ponto de fusão agros. Fresco. Este lote de agros a 37 graus Celsius em banho-maria por meia hora. Para evitar a indução artificial de uma cauda de cometa, agora dilua a suspensão de células neuronais colhidas para que haja 100.000 células por mililitro.Combine a suspensão celular com os agros de baixo ponto de fusão de 37 graus Celsius em um vórtice de proporção de um para 10 brevemente e use imediatamente o lado de uma ponta de pipeta para espalhar 50 microlitros da suspensão celular uniformemente sobre a área de amostra do cometa seco ao ar Slide. Coloque as lâminas tratadas na geladeira por 30 minutos até que um círculo apareça na periferia da lâmina. Em seguida, mergulhe as lâminas na solução de lise pré-resfriada no escuro a quatro graus Celsius.Após 30 minutos, aspire a solução de lise. Em seguida, incube as lâminas em um tampão de eletroforese neutro por meia hora na geladeira. Em seguida, adicione um tampão de eletroforese neutro pré-resfriado a uma câmara de eletroforese e, em seguida, coloque as lâminas na bandeja de lâminas de eletroforese, alinhando as lâminas de modo que fiquem igualmente distantes dos eletrodos.Depois de encher a câmara o suficiente para cobrir as lâminas com 0,2 polegadas de um tampão de eletroforese neutro, defina a tensão da fonte de alimentação para um volt por centímetro e execute o ensaio no escuro por 30 minutos a quatro graus Celsius. Comece imergindo novos agros e lâminas tratadas com células neuronais em solução de lise fresca pré-resfriada e, em seguida, incube-as no escuro a quatro graus Celsius por uma hora a durante a noite. Em seguida, remova as lâminas da solução de lise, escorra-as e enxágue-as uma vez com tampão de neutralização a frio por cinco minutos para remover qualquer resíduo antes da etapa de enrolamento alcalino.Em seguida, coloque as lâminas em uma câmara de eletroforese em gel preenchida com tampão de eletroforese pré-resfriado e recém-feito para não exceder 0,5 centímetros acima das lâminas. Incubar as lâminas no tampão alcalino durante 30 minutos no escuro para permitir o desenrolamento do ADN e a expressão dos danos alcalinos susceptíveis de serem danificados. Em seguida, execute o ensaio a um volt por centímetro por 30 minutos a quatro graus Celsius.Depois de executar o ensaio do cometa, drene o excesso de tampão de eletroforese e, em seguida, mergulhe as lâminas em água destilada pré-resfriada à temperatura ambiente. Após cinco minutos, mergulhe as lâminas em etanol pré-resfriado a 70% também à temperatura ambiente. Após mais cinco minutos, coloque as amostras para secar durante a noite, mantendo-as longe da luz forte.Em seguida, pinte as lâminas em verde cibernético na geladeira por 30 minutos. Agora remova as lâminas e deixe-as secar completamente no escuro. O aros ficará transparente quando estiver completamente seco.Para adquirir imagens do ensaio, use um microscópio fluorescente ajustado para o filtro verde. Em seguida, abra o programa de ensaio COMET para analisar as imagens adquiridas. Ao clicar no botão da cabeça do cometa, o software calculará os parâmetros, incluindo o momento médio da cauda e a quantidade de DNA no núcleo.Depois de analisar pelo menos 200 células por tratamento, exporte os dados para o Microsoft Excel para cálculo do momento médio da cauda e plotagem de dados. Esta primeira figura mostra um exemplo de uma análise de ensaio COMET de células neuronais com e sem cauda de cometa. Neste segundo ensaio cometa analisado usando o software de ensaio COMET, a irradiação das células neuronais foi determinada para induzir danos ao DNA à medida que as células eram submetidas ao campo elétrico.O DNA migrou em taxas diferentes devido a diferenças de tamanho, conforme posteriormente analisado com o software de ensaio comum. Esta primeira captura de tela mostra imagens representativas adquiridas usando o microscópio fluorescente usando o programa de ensaio COMET. Clicar no núcleo ou na cabeça do cometa de uma imagem gerou um gráfico de mapa fluorescente e uma tabela de dados.Quanto maior o dano ao DNA, mais longe o DNA migrou para fora do núcleo. Isso resultou em uma diminuição na intensidade de fluorescência no núcleo, conforme indicado pela cor verde, e é posteriormente detectado pelo software produzindo um momento de cauda mais alto. Nesta figura final, um gráfico representativo do momento médio da cauda obtido pela análise do dano ao DNA em células neuronais irradiadas e não irradiadas usando um ensaio COMET neutro é mostrado como esperado três danos ao DNA induzidos por radiação cinza, conforme indicado pelo maior momento médio da cauda nas células neuronais irradiadas.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear as células com cuidado, evitando a exposição à luz direta e controlar a temperatura em pH. Isso é para que as células não sejam submetidas a estresse adicional, o que pode alterar seus resultados após este procedimento. Outros métodos, como análise de DNA, focos de reparo por meio de coloração por imunofluorescência podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre quais vias de reparo de DNA são alteradas.Por exemplo, a coloração imunofluorescente para focos RAD 51 ou fosfo, focos de DNA PK pode ser realizada para medir o reparo de recombinação homóloga ou não homóloga e o reparo de junção, respectivamente.

assaying-dna-damage-in-hippocampal-neurons-using-the-comet-assay

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O vídeo demonstra o ensaio cometa para detectar danos ao DNA após a exposição a agentes nocivos. Sob condições alcalinas, o DNA se desenrola e desnatura e, após a eletroforese, o DNA não danificado e danificado migra de maneira diferente no gel de agarose, formando uma estrutura em forma de cometa. O DNA não danificado de migração lenta forma a cabeça circular do cometa, enquanto os fragmentos de DNA danificados de migração rápida formam a cauda alongada do cometa.

Ensaio cometa para detecção de danos ao DNA em células

Descrevemos aqui uma plataforma que permite a detecção de teste do cometa de danos no DNA, com taxa de transferência sem precedentes. Os padrões de dispositivos de células de mamíferos para um microarranjo e permite o processamento em paralelo de amostras 96. A abordagem facilita a análise de danos ao DNA nível base, danos ao DNA induzidos por exposição e reparo do DNA cinética.

CometChip: A alta taxa de transferência de plataforma 96-Bem, para avaliação dos danos causados ​​no DNA em células Microarrayed Humanos

Ensaio Cometa mede quebras de DNA induzidas por diferentes fatores. Se todos os fatores (exceto estresse oxidativo) que causam danos ao DNA são mantidas constantes, a quantidade de dano ao DNA é um bom parâmetro indireto do estresse oxidativo. O objetivo deste protocolo é usar o teste do cometa para a medição indireta do estresse oxidativo.

Ensaio Cometa como uma medida indireta do Systemic Estresse Oxidativo

O ensaio de cometa alcalino mede quebras de fita de DNA em células eucarióticas. Ao adicionar uma etapa de digestão de endonuclease III ou 8-oxoguanina-DNA-N-glicosilase humana, o ensaio pode detectar com eficiência danos oxidativos ao DNA. Descrevemos métodos para usar esses ensaios para detectar danos ao DNA no fígado de ratos.

In Vivo Alkaline Ensaio Cometa e Enzyme-modificado Alkaline Comet Ensaio para medição Breaks DNA Strand e dano oxidativo ao DNA em Rat Liver

O ensaio cometa é um método eficiente para detectar danos do DNA incluindo single e double-stranded DNA quebra. Descrevemos o cometa alcalino e neutro de ensaios para medir o dano de DNA em células cancerosas para avaliar o efeito terapêutico da quimioterapia.

Avaliação In Vitro o dano de DNA usando ensaio cometa

Este protocolo descreve vários procedimentos para a preparação de amostras de tecido congelado de alta qualidade no momento da necropsia para uso no ensaio do cometa para avaliar danos no DNA: 1) tecido picado, 2) células epiteliais raspadas do trato gastrointestinal e 3) tecido em cubos amostras, necessitando de homogeneização usando um dispositivo de picar tecido.

Uso de tecido congelado no ensaio do cometa para avaliação de danos no DNA

O ensaio de cometa é um meio popular de detectar danos ao DNA. Este estudo descreve uma abordagem para a execução de lâminas em variantes representativas do ensaio do cometa. Essa abordagem aumentou significativamente o número de amostras, diminuindo o tempo de execução do ensaio, o número de manipulações de lâminas e o risco de danos aos géis.

Uma abordagem de ensaio de cometa de alto rendimento para avaliar danos ao DNA celular

Este protocolo descreve um método eficaz para quantificar a diferença no dano ao DNA induzido por inibidores do tipo I e tipo II em células mutantes FLT3 por meio da aplicação do ensaio cometa.

Ensaio cometa para quantificar danos ao DNA em células 32D que expressam mutantes FLT3 após exposição a inibidores de FLT3 tipo I e tipo II

Assaying Toxicidade β-amilóide utilizando um transgênico C. elegans Modelo

Nós descrevemos um protocolo que permite imagens de mitocôndrias na vida neurônios através de microscopia de fluorescência durante muito tempo. Imagem por longos períodos é realizado através de lentivírus mediada expressão de uma proteína fluorescente mitochondrially alvo e uso de uma infra-top estágio incubadora que foi projetada e construída em nosso laboratório.

Neuromodulação e Transportes mitocondrial: Imagens ao vivo em neurônios do hipocampo durante muito tempo

Aprenda a medir danos no DNA em neurônios do hipocampo usando o ensaio cometa. Este método sensível permite quantificar quebras de fita simples e dupla por eletroforese, auxiliando pesquisas em neurodegeneração.

Ensaio danos no DNA em neurônios do hipocampo Usando o Ensaio Cometa

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