Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Este sistema experimental oferece uma metodologia de alto rendimento para monitorar a citotoxicidade mediada por células T no nível de célula única. Primeiro, rotule as células T efetoras e as células-alvo do tumor com corantes fluorescentes. Carregue os dois tipos de células nas matrizes de nano poços e mergulhe todo o chip em meio contendo cyt verde e nexina marcada com fluorescência. Cinco.

Para identificar células necróticas e apoptóticas, registre agora uma pré-imagem inicial para determinar a ocupação do poço e a viabilidade celular no início do ensaio. Após seis horas de incubação, registre uma segunda imagem. Em seguida, use a análise de imagem automatizada para quantificar a lise específica do antígeno de EL quatro células T positivas para CD 19 por células T positivas para carro.

Os resultados obtidos com este método de alto rendimento podem rastrear a lise específica do antígeno de alvos por células efetoras com base na coloração positiva com citoxina. Cinco. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio de liberação de cromo 51, é que as verdadeiras interações de alvo eficazes de um para um podem ser alcançadas e a frequência do satélite medida A implicação desta técnica se estende a qual terapia do câncer porque permite estudar correlatos de eficácia na terapia celular autóloga Para fabricar nano poços usando o mestre de silício primeiro misture completamente a base do kit de elastômero charuto 180 4 e o agente de cura em um Proporção de peso de 10 para um em um copo descartável usando uma faca de plástico. Desgaseifique a mistura em uma câmara de vácuo por uma hora.

Em seguida, despeje a mistura no mestre de silício e deixe descansar por 30 minutos. Agora, para curar o elastômero, aqueça o conjunto em um forno a 80 graus Celsius por duas horas após esfriar em temperatura ambiente por uma hora. Remova cuidadosamente a matriz de nano poços PDMS do mestre de silício.

Cubra-o com fita adesiva até o uso um dia antes da passagem do experimento 5 milhões de células-alvo em cinco mililitros. O dia do experimento. Pellet 5 milhões de células em um tubo cônico estéril de 15 mililitros por centrifugação a 340 Gs por cinco minutos.

Aspire o excesso de meio deixando para trás aproximadamente 50 microlitros de meio para rotular as células. Adicione 150 microlitros da solução de trabalho vermelha do rastreador de células frescas e misture bem usando uma pipeta P 200 incubar por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Usando um hemocitômetro, enumere as células efetoras colhidas da cultura.

Em seguida, coloque 5 milhões de células em um tubo cônico estéril de 15 mililitros por centrifugação. Aspire o excesso de meio. Em seguida, adicione uma solução de trabalho fresca de cinco micromolares vibrantes de coloração violeta de ciclo D e suspenda novamente usando uma pipeta P 200.

Incube as células e morra por 20 minutos a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono a 6,8 mililitros e 6,0 mililitros de R-P-M-I-P-L-G-H para as células-alvo e efetoras, respectivamente, e misture por pipetagem. Em seguida, coloque lentamente 3,5 mililitros de pacote fial mais no fundo de cada tubo, centrifugue ambos os tubos a 340 GS por 30 minutos sem interrupção e aceleração durante a centrifugação, prepare a matriz de nano poços Primeiro transfira sete mililitros de PBS pré-guerra para uma placa de quatro poços. Limpe o fundo da lâmina de vidro com etanol usando um oxidante de plasma.

Trate o PDMS em alta configuração de RF por 30 a 45 segundos. Em seguida, coloque a matriz no PBS. Transfira a placa para um gabinete de biossegurança e aspire o excesso de PBS, aplique ágar 1% nobre quente nas bordas superior e inferior da lâmina de vidro para imobilizar a matriz.

Certifique-se de não deixar o PDMS secar após 10 minutos a três mililitros de PBS e aspire o excesso de ágar. Em seguida, adicione três mililitros de R 10 no topo da matriz de nano poços e equilibre por cerca de 10 minutos. Após a centrifugação Fial, aspire cinco mililitros de meio da camada superior de cada tubo.

Cuidado para não aspirar a camada que contém as células com uma pipeta P 1000. Colha a camada branca de células entre o frasco e o meio. Transfira as células para novos tubos cônicos estéreis.

Agora lave o efetor colhido e as células-alvo duas vezes com três mililitros de R-P-M-I-P-L-G-H pré-guerra. Após a centrifugação final, aspirar o excesso de meio e ressuspender o sedimento celular. Em 500 microlitros de R 10, conte as células viáveis usando o método de exclusão trian blue em um hemocitômetro aspire o excesso de meio da matriz nano will.

Em seguida, adicione dois mililitros de aspirado R 10 fresco. Novamente, certifique-se de que a parte superior da matriz nano não esteja muito úmida nem muito seca, pois isso afetará a distribuição das células. Agora deposite uma vez 10 elevado ao quinto das células fectoras em 200 microlitros de R 10 na superfície da matriz nano permitirá que as células se assentem por cinco minutos.

Em seguida, usando um microscópio de cultura de tecidos padrão, verifique a distribuição desejada das células. Em seguida, deposite uma vez 10 nas quintas células-alvo em 200 microlitros de R 10 na superfície da matriz de nano poços contendo as células efetoras. Após cinco minutos, avalie a distribuição celular por microscopia.

Em seguida, enxágue cuidadosamente a matriz de nano poços com dois mililitros de R 10 e aspire o excesso de meio em um tubo cônico estéril separado de 15 mililitros. Pipete três mililitros de R 10 pré-aquecido a três microlitros de 0,5 milimolar cyt, coloração de ácido nucleico verde e 60 microlitros de um X em cinco LOR 6 47 bem misturados por pipetagem. Agora pipete suavemente a solução de coloração na placa de quatro poços, certificando-se de que as células não sejam deslocadas dos poços incubados por 15 minutos a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono adquirem imagens da matriz de nano poços usando um microscópio de fluorescência como o microscópio zes observer Z one, equipado com um estágio motorizado e Lambda DG quatro.

Inicialize o software e o microscópio. Verifique a intensidade do sinal na luz transmitida e nos outros canais fluorescentes. Ajuste a configuração do microscópio para garantir o sinal máximo ao ruído, evitando a saturação.

Agora abra a lista de posições x e Y para a matriz nelle. Defina a posição XY zero e zere o foco no centro de um bloco de matriz nelle de sete por sete no canto superior esquerdo do carimbo de matriz nelle. Defina as posições XY para coincidir com o centro de cada bloco e o valor Z para refletir com precisão o foco em cada bloco.

Agora defina a aquisição de imagem no modo linear e adquira imagens. Após a primeira série de imagens, retorne as matrizes de nano poços à incubadora de cultura de células por seis horas. Cuidar da agitação pode levar ao deslocamento celular.

Em seguida, repita a aquisição das imagens no segundo momento. Este ensaio citolítico de alto rendimento mede a frequência da lise específica do antígeno marcada com CD, 19 células T positivas para CAR específicas foram co-incubadas com quatro células-alvo EL de camundongo marcadas nos poços individuais de uma matriz nano L. Os gráficos de histograma de células-alvo representam poços contendo uma única célula efetora e uma única célula-alvo.

Após seis horas de co-incubação, histogramas pareados de células-alvo sem efetores foram usados como controles negativos para relatar a frequência de morte celular de fundo. É desejável atingir baixas frequências de lise inespecífica na faixa de dois a 4% A matriz de poços nano pode ser adaptada para imagens de lapso de tempo para permitir a observação do efetor, conjugação do alvo e subsequente morte celular. Aqui, as células T positivas para carros não marcadas foram co-incubadas com NA LM seis células-alvo GFP em um NOL e submetidas a monitoramento dinâmico.

Quando um Xin cinco foi adicionado ao meio de cultura, as células apoptóticas rotuladas como vermelhas Uma vez dominadas. Esta técnica pode ser realizada corretamente em 10 a 12 horas Após este procedimento. Outros métodos, como micro agarramento, podem ser usados para determinar o perfil de secreção de citocinas das células.