Name: Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T. (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Aprenda a medir citotoxicidade de células T em nível de célula única usando ensaio de alta vazão com arrays de nano poços e microscopia de fluorescência. Este método avança pesquisas em imunoterapia do câncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional do Câncer do Instituto Nacional de Saúde sob o número Prêmio R01CA174385. O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde.

1. Preparação de reagentes <ol><li> Prepare RPMI-PLGH misturando 500 ml ml de RPMI-1640 e 5 de cada um de penicilina-estreptomicina, L-glutamina, HEPES e solução. </li><li> Prepare R10 solução misturando RPMI-PLGH com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS). O FBS inactivado pelo calor é a 56 ° C durante 30 min antes da adição. </li><li> Pré-aquecido a 37 ° C de 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, e 15 de R10 em tubos cónicos estéreis. </li><li> Fabricação de matrizes de nanowells em PDMS: O mestre de silício é fabricado usando fotolitografia, essencialmente como descrito anteriormente 10. Misturar cuidadosamente a base de Sylgard 184 kit elastómero e agente de cura de peso de 10:1 em um copo descartável usando uma faca de plástico. Desgaseificar a mistura, em uma câmara de vácuo durante 1 hr. Despeje a mistura para a matriz nanowell, vedar com uma lâmina de vidro e deixar repousar durante 30 minutos. Transferir o conjunto dentro de um forno ajustado para 80 ° C durante 2 h e deixar arrefecer à temperatura ambiente durante 1 hr. O elastômero vontade atue durante este período e vontade vínculo com a lâmina de vidro. A lâmina de vidro que contém a matriz de PDMS nanowell é cuidadosamente levantada do mestre de silício, cobertos com fita adesiva Scotch e armazenadas até utilização futura. </li></ol> 2. Célula alvo Labeling (T) <ol><li> Conte 5.000.000 células alvo a partir de cultura de células utilizando um hemocitómetro e sedimentar as células em um tubo estéril de 15 mL cónico por centrifugação a 340 xg durante 5 min. A cultura de células é dividida no dia anterior em 5 ml de volume total (densidade = 1 milhão / ml) e cultivadas em frasco T-25 (VWR). Protocolos para contagem de células utilizando um hemocitómetro foram descritos em detalhe anteriormente 11 </li><li> Aspirar a mídia em excesso, deixando para trás cerca de 50 ul de mídia. </li><li> Preparar uma solução de trabalho de Célula tracker Red (CTR) através da mistura de 0,5 ul de estoque CTR (1 mM) a 150 ul de meio RPMI-PLGH (concentração final 2,5 uM). Adicionar 150 ul da solução de trabalho para as células alvo e misturar cuidadosamente com uma pipeta de P200.Alternativamente, PKH 26 (concentração final de 2 mM) pode ser usada como células alvo de etiquetas de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante 20 min. </li></ol> 3. Rotulagem de células efetoras (E) <ol><li> Conte 5.000.000 células efectoras provenientes da cultura de células utilizando um hemocitómetro e sedimentar as células em um tubo estéril de 15 mL cónico por centrifugação a 340 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar excesso de mídia </li><li> Preparar uma solução de trabalho de solução DyeCycleViolet Vybrant Stain pela adição de 1 uL de 5 mM estoque Violet Vybrant a 1 ml de meio R10 (concentração final de 5 uM). Adicionar a solução de trabalho para as células e ressuspender P200 usando uma pipeta. Alternativamente, PKH 67 (concentração final de 2 mM) pode ser usada como células alvo de etiquetas de acordo com as instruções do fabricante. Se PKH 67 é utilizado, em seguida, SYTOX Green não deve ser utilizada uma vez que eles estão no mesmo canal de fluorescência. A enumeração de metas apoptóticas é feito exclusivamente através de umnnexinV coloração no presente caso. Nota: Se executar lapso de tempo e medições não terminais, corantes UV como Violeta Vybrant deve ser evitado. </li><li> Incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante 20 min. </li></ol> 4. Separação de células vivas e mortas Usando um gradiente de densidade <ol><li> Adicionar 6,8 ml e 6,0 ml de meio RPMI-PLGH ao alvo e células efectoras, respectivamente, e misture pipetando para cima e para baixo suavemente. </li><li> Camada ml 3,5 de Ficoll-Paque Plus a parte inferior de cada tubo cónico contendo alvo e células efectoras. FICOLL camada lentamente para garantir boa formação de camadas entre FICOLL e mídia. </li><li> Centrifugar os tubos a 340 xg durante 30 min. sem freio e aceleração. </li><li> Durante a centrifugação, transferir 7 mL de PBS pré-aquecido a uma placa de quatro poços. Prepare nanowell array (fabricado em PDMS): inferior de lâmina de vidro limpa com etanol e oxidar o PDMS no ajuste alto RF usando plasma oxidante durante 1 min. Esta etapa irá sterilize matriz nanowell enquanto também tornar o PDMS hidrofílico. Imediatamente mover a matriz nanowell na placa contendo PBS. </li><li> Transfira a placa para uma cabine de segurança biológica e aspirar excesso de PBS. Fazer 10 ml de ágar a 1% por adição de 100 nobre pó de ágar a 10 mg de água DI ml e, em seguida, ela microondas por 30-45 segundos. Aplicar aquecer a 1% de ágar nobre na borda superior e inferior da lâmina de vidro que contém a matriz nanowell para imobilizar a matriz e esperar 10 minutos para agar solidificar. Adicionar 3 ml de PBS e agar excesso aspirado. </li><li> Adicionar 3 ml de R10 para o topo da matriz e deixar nanowell equilibrar durante ~ 10 min. </li><li> Subsequente à centrifugação de Ficoll, aspirar 5 ml de meio a partir da camada superior de cada tubo. Tenha cuidado para não aspirar a camada que contém as células. </li><li> Colher as células (camada branca), recuperando ml 1-2 da camada entre FICOLL e mídia com P1, 000 pipeta e mudança para novos tubos cônicos estéreis. Repita este procedimento para os dois conjuntos de células ao se certificar de que você máximaize das células de recuperação. </li><li> Adicionar 3 ml de RPMI pré-aquecido PLGH-se a cada tubo da mistura, por pipetagem e sedimento por centrifugação a 340 xg durante 5 min em plena aceleração e de travagem. </li><li> Aspirar a mídia em excesso, adicionam-se 5 ml de meio RPMI pré-aquecido PLGH-se a cada tubo e repetir a centrifugação a 340 xg durante 5 min. </li><li> Aspirar o excesso de media e ressuspender o sedimento de células em 500 uL de R10. </li><li> Contar as células vivas utilizando o método de exclusão de azul de tripano em um hemacitómetro. </li></ol> 5. Carregando célula para matriz Nanowell <ol><li> Aspirar o excesso de mídia matriz nanowell e adicionar 2 ml de R10 fresco através da matriz. Aspirar novamente enquanto certificando-se o topo da matriz nanowell não é muito úmido / seco como ele vai afetar a distribuição de células. </li><li> Depósito de 1 x 10 5 células efectoras em 200 ul de R10 para nanowell superfície da matriz (densidade = 5 x 10 5 células / ml). </li><li> Deixe as células assentar durante 5 min e usando um padrão de tecido de verificação microscópio cultura de ense que a distribuição das células é desejável. Adicionar mais células, se necessário. </li><li> Depósito 1 x 10 5 células-alvo em 200 ul de R10 nanowell superfície da matriz (densidade = 5 x 10 5 células / ml). </li><li> Deixe as células assentar durante 5 min e usando um padrão de tecido de verificação microscópio cultura para assegurar que a distribuição das células é desejável. Adicionar mais células, se necessário. </li><li> Lavar cuidadosamente com matriz nanowell 2 ml R10 e aspirado excesso de mídia. </li><li> Preparar 3 ml R10 pré-aquecido num tubo de 15 ml estéril cónico. Adiciona-se 3 uL de 0,5 mM de ácido nucleico SYTOX Verde Stain (concentração final 0,5 uM) e 60 jil de anexina V-Alexa Fluor 647 para preparar a solução de trabalho. Adicionar a solução de trabalho para a placa de quatro poços cuidadosamente assegurando ao mesmo tempo que as células não são deslocadas a partir das cavidades. </li><li> Incubar a 37 ° C / 5% de CO2 durante 15 min. </li></ol> 6. Imagem 1 <ol><li> Adquirir imagens da matriz nanowell usando um micr fluorescênciaoscope: Neste exemplo, usamos um Observer ZEISS Z-1 microscópio equipado com um palco motorizado e Lambda-DG4. </li><li> Inicializar o software e o microscópio e verificar a intensidade do sinal na luz transmitida e os outros canais fluorescentes. De modo geral, haverá cinco canais correspondentes a: luz transmitida, anexina V-647 (Cy5 filtro), CTR (DsRed filtro), SYTOX Green (FITC filtro), e Vybrant Violet (DAPI filtro). Certifique-se que o microscópio que configurar para garantir sinal máximo de ruído, evitando a saturação. </li><li> Definir X e Y posição para a matriz nanowell. Iniciar o processo, definindo a posição zero ea inicialização de foco no centro de 7 x 7 bloco matriz nanowell no canto superior esquerdo do selo matriz nanowell. Definir as posições x, y, para coincidir com o centro de cada bloco e o valor de z para reflectir com precisão a focagem em cada bloco. </li><li> Uma vez que a posição eo foco está tudo pronto, certifique-se de definir a aquisição de imagens em modo linear e adquirir imagens. <sTrong&gt; Nota: Se for necessário, na incubadora de CO 2 e sobre o microscópio, pelo menos, 30 minutos antes da experiência. </li></ol> 7. Pós-imagem Transferir a placa 4 poços contendo a matriz nanowell numa incubadora (37 ° C / 5% CO 2) durante 6 horas. 8. Imagem 2 Adquirir as imagens no segundo ponto do tempo, conforme descrito no Passo 6. 9. Análise de Imagem <ol><li> A ocupação de células dentro da nanowells é determinada através da utilização de programas apropriados de segmentação de imagem (por exemplo, ImageJ, <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) essencialmente como descrito anteriormente 9,12. </li><li> A análise do conjunto inicial de imagens de microscópio (t = 0 horas, t 0) é utilizado para gerar um banco de dados das nanowells individuais contendo exactamente uma célula alvo vivo (identificadopor CellTracker Red, vermelho) e sem células mortas (identificados por anexina V coloração, verde) [0 T1t nanowells]. </li><li> Análise de o segundo conjunto de imagens de microscópio (t = 6 horas; t 6) é utilizado para determinar de forma independente um segundo banco de dados de nanowells contendo uma célula alvo (vermelho) [6 T1t nanowells]. Uma verificação de integridade (consulta de banco de dados) é implementada para assegurar que todos os alvos vivos em t 0 são compatíveis com alvos em t 6 para produzir um conjunto final de metas combinadas (implementado como nanowells que têm T1t 0 = T1t 6, designado como T1match) </li><li> O número de células efectoras em nanowells é determinada utilizando coloração violeta Vybrant em t 0 [E1 nanowells] </li><li> Uma consulta de base de dados é implementado para identificar nanowells contendo efectores individuais co-incubado com alvos individuais (definida como nanowells que têm correspondência E1 e T1, designados como E1T1) </li><li> Apoptose induzida efetor é marcado por i<html> dentifying alvos que estão anexina V negativa em t 0 e V Anexina positivo em t 4 (E1T1 com anexina V na coloração de alvo t 6). </li></ol> 10. Imagem Time-lapse opcional de Matar Usando BioStation Nikon IM <ol><li> Pegue uma placa de Petri com o fundo lamela e cortar um pequeno pedaço do chip matriz nanowell (preparado na Etapa 5) que vai caber exatamente na lamela. Certifique-se de que o chip fica molhada durante o corte. </li><li> Misturar 1 x 10 6 alvos e 1 x 10 6 células T em 100 ul de meios de comunicação, e pipeta-lo para a lamela. </li><li> Permitir que cerca de 15-30 minutos para permitir que as células resolver. </li><li> Rapidamente inverter o chip matriz pequena nanowell e colocá-lo sobre a lamela. </li><li> A fim de assegurar que o chip não será capaz de se mover durante a imagiologia lugar, um ou dois 20 milímetros x 20 milímetros lamelas sobre a parte superior do chip. Aplicar uma pressão suave para empurrar o chip para o fundo do prato. </li></ol>tenda &quot;&gt; Nota: bottom O chip matriz nanowell é muito grande para imagens de alta resolução e, portanto, tem que ser virado de cabeça para baixo Durante este, muitas das células são lavadas para fora Uma vez que este não pode ser facilmente controladas, o número de células no Passo 9.2.. e tempo de incubação na etapa 9,3 têm de ser optimizados.

<ol><li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li>
<li>Savoldo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+costimulation+improves+expansion+and+persistence+of+chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+lymphoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients.</a> J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).</li>
<li>Kalos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+with+chimeric+antigen+receptors+have+potent+antitumor+effects+and+can+establish+memory+in+patients+with+advanced+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia.</a> Sci. Transl. Med. 3, 95ra73(2011).</li>
<li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPorter%2C+DL+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. , (2011).</li>
<li>Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+for+cancer%3A+harnessing+the+T+cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response.</a> Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li>
<li>Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy%3A+visualizing+immunity+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy: visualizing immunity in context.</a> Immunity. 21, 315-329 (2004).</li>
<li>Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+cytokine+optimization+and+standard+operating+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure.</a> Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).</li>
<li>Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+individual+hybridomas+by+microengraving+to+discover+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies.</a> Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).</li>
<li>Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+IFN-gamma+Elispot+assay+in+HIV+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research.</a> Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).</li>
<li>Varadarajan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+efficient+functional+characterization+and+recovery+of+HIV-specific+human+CD8%2B+T+cells+using+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).</li>
<li>Makedonas, G., Betts, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+in+a+house+of+cards%3A+re-evaluating+CD8%2B+T-cell+immune+correlates+against+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV.</a> Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).</li>
<li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Temos descrito o protocolo para um ensaio de elevado rendimento de célula única citolítica activado através de co-incubação de efectores e alvos em matrizes de nanowells (Figura 1). Além disso a taxa de transferência de uma grande vantagem da técnica é a capacidade de monitorizar efectora mediada por citotoxicidade contra células alvo desejadas, sem a necessidade para a engenharia de células alvo, que por sua vez permite o uso de autólogos ou matched / primário de células tumorais, como as células-alvo....

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente / Material </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamina </td><td> Cellgro </td><td> 15-040 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Cellgro </td><td> 30-002 CI- </td><td> 10.000 UI de penicilina estreptomicina 10000 ug / ml </td></tr><tr><td> L-glutamina </td><td> Cellgro </td><td> 25-005 CI- </td><td> 200 mM de solução de </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> De soro fetal bovino (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Lote testado </td></tr><tr><td> Rastreador de celular mancha vermelha </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 ug </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violeta Mancha </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> SYTOX Ácido Nucleico mancha verde </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Anexina V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 ul </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 CV- </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Agar Noble </td><td> DISCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Trypan Blue </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> 0,4% de líquido, filtrado estéril </td></tr><tr><td> Hemocitômetro </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Linha brilhante </td></tr><tr><td> 4-bem chapa </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Cleaner Plasma </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Aspirador de plasma básica </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Microscópio de fluorescência (funciona com as três partes abaixo) </td></tr><tr><td> Lambda 10-3 </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td><td> Filtro controlador </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Instrumento Sutter </td><td></td><td> Ultra-High-Speed ​​Wavelength switcher </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD da câmera </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> Microscópio CCD da câmera </td></tr><tr><td> 15 tubo cônico ml </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tubo cónico </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Inc. </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Vidro prato de cultura de fundo </td><td> MatTek Corporação </td><td> P35G-0 </td><td> 35 milímetros placa de Petri de 10 mm de micropoços </td></tr></tbody></table>

quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células t.

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Imunoterapia do cancro pode aproveitar a especificidade da resposta imunitária para alvejar e eliminar tumores. Terapia celular adoptiva (ACT) com base na transferência adoptiva de células T geneticamente modificadas para expressar um receptor de antigénio quimérico (CAR) se mostrou promissora em ensaios clínicos 1-4. Existem várias vantagens de usar CAR + células T para o tratamento de cancros, incluindo a capacidade para alvejar os antigénios do MHC não-limitados e para funcionalizar as células T para a sobrevivência óptima, homing e persistência no interior do hospedeiro, e, finalmente, para induzir a apoptose de CAR + As células T, em caso de toxicidade central 5. Delineando as funções ideais de CAR + células T associados com o benefício clínico é essencial para projetar a próxima geração de ensaios clínicos. Os recentes avanços na imagem animal vivo como microscopia multifotônica revolucionaram o estudo da função de células imunes in vivo 6,7. Embora estes estudos tenham avançado a nossa compreensão da função das células T in vivo, de células T ACT baseada em ensaios clínicos exige a necessidade de ligar as características moleculares e funcionais de células T preparações pré-infusão com eficácia clínica pós-perfusão, utilizando-se, em Os ensaios in vitro de células T de monitorização funções como, citotoxicidade e a secreção de citocinas. Padrão de citometria de fluxo-ensaios baseados foram desenvolvidos para determinar o funcionamento geral das populações de células T ao nível de uma única célula, mas estes não são adequados para a monitorização e a formação de conjugado vidas ou a capacidade da mesma célula para matar alvos múltiplos 8. Matrizes microfabricated projetados em polímeros biocompatíveis como polidimetilsiloxano (PDMS) é um método particularmente atraente para confinar espacialmente efetores e metas em pequenos volumes 9. Em combinação com a microscopia de fluorescência automatizado lapso de tempo, thousands de-alvo efetor interações podem ser monitoradas simultaneamente por poços individuais de imagem de uma matriz nanowell. Apresentamos aqui um método de alto rendimento para a monitorização de células T da citotoxicidade mediada ao nível de uma única célula que pode ser amplamente aplicado para estudar a função de células T citolíticas.

Um exemplo da aplicação do ensaio de elevado débito citolítica é demonstrado na Figura 2. Resumidamente, CD19 marcado específico CAR + células T foram co-incubadas com células EL4 marcadas rato alvo nos poços individuais de uma matriz nanowell (secções 1-5). Uma imagem inicial foi gravado no microscópio fluorescente automatizada para identificar a ocupação (efectores e / ou alvos) de cada nanowell único na matriz (Secção 6). Processamento de imagem foi usada para identificar todos os nanowell...

Descrevemos uma única célula ensaio de elevado débito para medir a citotoxicidade de células T, quando incubado com as células-alvo tumorais. Este método emprega uma matriz elastomérica denso, de sub-nanolitro poços (~ 100000 poços matriz /) para confinar espacialmente as células T e as células alvo em proporções definidas e está acoplado a microscopia de fluorescência para monitorizar alvo efetuador conjugação e apoptose subsequente.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Este sistema experimental oferece uma metodologia de alto rendimento para monitorar a citotoxicidade mediada por células T no nível de célula única. Primeiro, rotule as células T efetoras e as células-alvo do tumor com corantes fluorescentes. Carregue os dois tipos de células nas matrizes de nano poços e mergulhe todo o chip em meio contendo cyt verde e nexina marcada com fluorescência. Cinco.Para identificar células necróticas e apoptóticas, registre agora uma pré-imagem inicial para determinar a ocupação do poço e a viabilidade celular no início do ensaio. Após seis horas de incubação, registre uma segunda imagem. Em seguida, use a análise de imagem automatizada para quantificar a lise específica do antígeno de EL quatro células T positivas para CD 19 por células T positivas para carro.Os resultados obtidos com este método de alto rendimento podem rastrear a lise específica do antígeno de alvos por células efetoras com base na coloração positiva com citoxina. Cinco. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como o ensaio de liberação de cromo 51, é que as verdadeiras interações de alvo eficazes de um para um podem ser alcançadas e a frequência do satélite me

quantitative-high-throughput-single-cell-cytotoxicity-assay-for-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

O ensaio de libertação de crómio, um ensaio comum para a detecção da actividade de células T citotóxicas, tem várias limitações. Usando células T CD8 específicos de antígenos ea linha de tumor de câncer de mama humano, SKBR3, no presente artigo, uma abordagem baseada em impedância foi examinado para a capacidade de detecção de morte celular.

Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

Este vídeo demonstra um método para monitorar a atividade das células T CAR contra células cancerígenas por meio de medições de impedância elétrica em tempo real. O rastreamento de mudanças na impedância avalia a eficácia das células T CAR na indução da citólise de células cancerígenas, fornecendo informações sobre suas capacidades citotóxicas.

Um ensaio de citólise in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T CAR

Este protocolo descreve um ensaio de citotoxicidade sensível baseado em células. Ao enumerar a diminuição na frequência de células T CD4+ alvo vivas na presença de um número crescente de células T CD8+ efetoras, este ensaio permite a avaliação direta da atividade citolítica de células T CD8+ específicas do antígeno.

Baseada em células de Citometria de Fluxo Ensaio medir citotóxicos Atividade

O ensaio de citotoxicidade de sangue total (WCA) é um ensaio de citotoxicidade desenvolvido mediante a incorporação de alto rendimento tecnologia de posicionamento de célula com microscopia de fluorescência e de processamento de imagem automatizado. Aqui, nós descrevemos como células de linfoma tratadas com um anticorpo anti-CD20 pode ser analisada em tempo real no sangue humano inteiro para fornecer uma análise quantitativa da citotoxicidade celular.

Em tempo real de Citotoxicidade em Sangue Total Humano

Um ensaio de alto rendimento e em tempo real foi desenvolvido para identificar simultaneamente (1) antimicrobianos penetrantes em células eucarióticas direcionados a um patógeno bacteriano intracelular e (2) avaliar a citotoxicidade de células eucarióticas. Uma variação da mesma tecnologia foi posteriormente combinada com a tecnologia de dispensação digital para permitir estudos fáceis, de alta resolução, dose-resposta e sinergia bidimensional e tridimensional.

High Throughput, em tempo real, Teste Dual-leitura dos intracelular Actividade Antimicrobiana e citotoxicidade celular eucariótica

Apresenta-se no presente estudo, um ensaio baseado em fluorescência de novo utilizando linfócitos derivados de um ratinho transgénico. Este ensaio é adequado para rastreio de alto rendimento (HTS) de pequenas moléculas dotadas com a capacidade de qualquer inibição ou promoção da activação dos linfócitos.

A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

Descrevemos um sistema quantitativo de ensaio de citolíse in vitro em tempo real para avaliar a potência das células T do receptor de antígeno quimérico que visam células tumorais líquidas e sólidas. Este protocolo pode ser estendido para avaliar outras células efetores imunes, bem como tratamentos combinados.

Um ensaio de potência em tempo real para células T do receptor de antígeno quimérico visando células cancerosas sólidas e hematológicas

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para gerar células T do receptor de antígeno quimérico transitório (CAR) usando mRNA não integrante para imunoterapia contra o câncer e fornece métodos confiáveis para avaliar as células CAR-T e sua função citotóxica.

Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer

Aqui, descrevemos um método para criar gotículas de emulsão dupla encapsulando uma célula T e uma célula-alvo cancerígena para examinar a morte celular no nível de uma única célula. Este método permite a quantificação dupla de moléculas citotóxicas e apoptose de células-alvo em uma grande população de células T.

Ensaio de citotoxicidade baseado em gotículas para avaliar células T receptoras de antígeno quimérico no nível de célula única

Este método descreve o uso de sistema de imagem de Infravermelhos corante baseada em para a detecção de A H1N1 no bronchioalveolar o lavado de fluido (BAL) de camundongos infectados em uma alta sensibilidade. Esta metodologia pode ser realizado em um 96 - ou 384-bem prato, requer &lt;volume de 10 uL de material de teste e tem o potencial para a triagem concomitante de agentes patogénicos múltiplos.

Alta capacidade método de detecção de vírus Influenza

Aprenda a medir citotoxicidade de células T em nível de célula única usando ensaio de alta vazão com arrays de nano poços e microscopia de fluorescência. Este método avança pesquisas em imunoterapia do câncer.

Quantitativo de alta capacidade ensaio de citotoxicidade de célula única para as células T.

Explorar mais vídeos