Visualização de mRNAs retículo endoplasmático localizados em células de mamíferos

O objetivo deste procedimento é visualizar o RNA mensageiro que está associado ao retículo endoplasmático ou er. Isso é feito primeiro colocando células de cultura de tecidos de mamíferos em lamínulas. A segunda etapa do procedimento é tratar as células com tampão de extração para remover o mRNA citoplasmático não ligado ao er.

Os próximos passos são fixar rapidamente as células e corar o mRNA por hibridização fluorescente in situ. As etapas finais são criar imagens e, em seguida, quantificar a quantidade de fluorescência associada ao er. Em última análise, os resultados podem mostrar como os mRNAs estão associados à superfície dessa organela sob diferentes condições.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave da biologia celular, como se os mRNAs que codificam proteínas secretoras podem ser mantidos na superfície do er, independentemente dos ribossomos ou da síntese de proteínas. A demonstração visual desse método é crítica, pois envolve algumas etapas complicadas de manipulação celular. Semear as células de cultura de tecidos em lamínulas tratadas com ácido por pelo menos um dia antes do experimento custa sete e, devido às células OS, são escolhas adequadas, pois têm alta produção de proteínas secretadas e ERs bem definidos.

Se um Sr. NA exógeno estiver sendo investigado, transfecte as células um dia após a semeadura e, em seguida, incube as células por mais 18 horas para permitir a RM. Expressão NA. No dia do experimento. Para obter alta eficiência de extração, as células não devem exceder 80% de fluência de co na lamínula para detectar se os mRNAs interagem com o ER independentemente da tradução. As células podem ser tratadas com agentes que interrompem a interação entre ribossomos e mRNA nesses agentes ou meios de controle para as células 30 minutos antes da extração.

Neste caso, são utilizados inibidores translacionais, micina pura e Homo Harrington ou HHT. Comece aquecendo a solução de extração recém-preparada contendo tonina de escavação e um tampão de trabalho de um XCHO a 37 graus Celsius. Defina um bloco de aquecimento para 40 graus Celsius e insira um bloco de metal invertido para formar uma superfície de trabalho plana.

Umedeça o bloco de metal com água, cubra-o com um novo pedaço de paraforma e alise as bolhas usando luvas sem RNAs e lenços de papel sem fiapos. Em seguida, para cada par de lamínulas, prepare uma placa de seis poços para lavar e fixar as células em quatro poços. Adicione dois mililitros de tampão CHO aquecido aos dois últimos poços.

Adicione dois mililitros da solução de fixação. Em seguida, guarde o prato a 37 graus Celsius até que seja necessário. No bloco de aquecimento, coloque uma gota de 100 microlitros da solução de extração para cada lamínula de células a serem processadas.

Agora, usando uma pinça de joalheiro, pegue uma lamínula revestida de célula e mergulhe-a no primeiro e segundo poços contendo tampão CHO. Isso lava o meio de crescimento. Em seguida, retire rapidamente o excesso de buffer da parte de trás da lamínula.

E coloque brevemente a lamínula com o lado da célula voltada para baixo na solução de extração. Após 10 segundos, transfira o lado da célula de lamínula para o tampão de fixação, onde deve permanecer por pelo menos 15 minutos. A etapa de extração celular é essencial para remover todo o mRNA de ciop plástica que não está ligado ao RE.

Além disso, prepare uma lamínula de controle onde as células são fixadas sem a extração. Passo após a fixação. Lave essas células de controle extraídas unex duas vezes com PBS e, em seguida, permeie em PBS e TRITTON X 100.

Embora não seja necessário, a escavação nas células extraídas também deve ser lavada com a mesma solução de PBS e Triton para reduzir a fluorescência de fundo após as células terem sido permeadas. Lave as lâminas duas vezes com PBS para remover o fixador e o detergente. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com 60% de fide em tampão citrato de sódio ou SSC.

No entanto, se uma sonda de peixe oligo DT for usada para corar todas as células, o poli mRNA reduz o nível de fide para 25%Em seguida, prepare o tampão de hibridização com a sonda de peixe. Diluir a sonda de peixe de caldo a 0,2 micromolar na mesma concentração de fide no tampão de hibridização. Agora prepare a câmara de coloração.

Encha o fundo de uma placa de Petri de 150 milímetros com água. Em seguida, coloque um pedaço de paraforma na água e vire o prato de cabeça para baixo. O filme para aderirá ao fundo do prato à medida que a água escapa.

Se houver bolhas de ar, remova-as com luvas e lenços de papel sem fiapos para cada lamínula pipetar 100 microlitros da solução de hibridização contendo a sonda de peixe no filme para. Agora coloque a lamínula com o lado da célula voltada para baixo na solução. Finalmente, incube a câmara por cinco a 24 horas em uma câmara umidificada quente.

Antes que o tempo de coloração dos peixes termine, prepare uma área de lavagem livre de RNAs, uma superfície plana nivelada mais úmida com água e cubra-a com tiras de param. Remova todas as bolhas de ar com luvas e lenços de papel livres. Quando a coloração terminar, transfira a câmara para a área de trabalho para cada lamínula Pipete um mililitro de tampão de lavagem na área de lavagem.

Para filme para transferir as lamínulas Primeiro pipete meio mililitro de tampão de lavagem de peixe perto da borda de cada lamínula. O líquido será aspirado sob a lamínula por ação capilar. Em seguida, usando uma pinça, remova as lamínulas da câmara e coloque-as sobre as gotas do tampão de lavagem.

E espere cinco minutos. Repita esta técnica de lavagem mais três vezes. Usando gotas frescas de um mililitro de tampão de lavagem na área de lavagem.

Enquanto isso, limpe as lâminas de vidro com 70% de etanol e seque-as com lenços de papel sem fiapos. Em seguida, para cada lamínula, aplique 25 microlitros de solução de montagem DPI em uma lâmina Usando uma pinça, pegue uma lamínula e seque sua parte traseira com um lenço de papel sem fiapos para remover o excesso de tampão de lavagem. Em seguida, transfira o lado da célula de lamínula voltado para baixo para a queda da solução de montagem.

Os slides concluídos podem ser armazenados a quatro graus Celsius até que sejam fotografados com custo. Sete células que foram transfectadas com plasmídeos contendo fosfatase alcalina placentária ou citocromo P 4 58 B um foram extraídas com tonina e depois fixadas ou diretamente fixadas para determinar a porcentagem desses mRNA que está associada ao RE. A fluorescência não nuclear foi quantificada em ambas as amostras e a fração de mRNA associada ao ER foi calculada para ambos os mRNAs.

Cerca de 60% da fração citoplasmática foi associada ao RE para monitorar a associação desses transcritos no RE. Após a dissociação do ribossomo, sete células foram tratadas com meio controle, pur MYCIN ou HHT e, em seguida, extraídas de tonina e mRNA fixo. A coloração revelou que o A LPP, mas não o CYP oito P um mRNA permaneceu associado ao RE após a ruptura do ribossomo.

quantificação de mRNA apoiou essa observação e, de forma importante, mostrou que o nível de mRNA nuclear foi consistente em todas as amostras. Esses dados revelam que um subconjunto de mRNAs direcionados ao ER, como o transcrito A LPP, é mantido na superfície do ER após a desmontagem do ribossomo. Usando este protocolo, podemos começar a investigar como vários mRNAs se localizam em compartimentos subcelulares distintos, como a retícula endoplasmática, quando combinados com outros ensaios usados para analisar a exportação nuclear de mRNA.

Este procedimento pode ser usado para estudar o direcionamento inicial de mRNAs recém-sintetizados para a superfície do er.