Name: Antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos Poligliceróis hiper (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprenda a modificar glóbulos vermelhos funcionais com poliglicerol hiperramificado para proteger antígenos de superfície. Este método utiliza citometria de fluxo e pode melhorar a preservação de produtos sanguíneos para transfusões.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi financiada pelos Serviços de Sangue canadenses (CBS) e da Canadian Institutes of Health Science Partnership Fund (CIHR) Research. Os autores agradecem o Hub LMB Macromoléculas no Centro UBC para a pesquisa de sangue para o uso de suas instalações de pesquisa. A instalação de infra-estrutura é apoiada pela Fundação Canadense para Inovação (CFI) e do Michael Smith Fundação para a Pesquisa em Saúde (MSFHR). R. Chapanian é um receptor de (CIHR / CBS) bolsas de pós-doutorado em Ciências de Transfusão e um destinatário de MSFHR comunhão pós estagiário pesquisa de doutorado. JN Kizhakkedathu é um receptor de MSFHR Prêmio Acadêmico Carreira Investigador.

A. Modificação poliglicerol hiper (SS-HPG) <ol><li> Lugar liofilizado HPG 60 kDa (0,5 g, 0,0083 mmol) em um balão de fundo redondo e secar durante a noite sob vácuo a 90 ° C. </li><li> Refrigerar o balão até à temperatura ambiente e dissolve-se o HPG secas em piridina anidra (3 ml). </li><li> Para funcionalizar aproximadamente oito grupos hidroxilo em grupos carboxilo com HPG, adicionar uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina (uma gota de 5 mg / ml de solução em piridina) para a solução de HPG. A esta mistura, adiciona-se anidrido succínico (0,0067 g, 0,0664 mmol) dissolvido em 0,5 ml de piridina gota sábio, durante 10 min. Agita-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon. </li><li> Precipitar a mistura em 40 ml de acetona fria (4 ° C) num tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar utilizando uma centrífuga Beckman J2-MC a 27.000 xg durante 15 min. Decantar o sobrenadante, e remover a acetona residual por lavagem com árgon à temperatura ambiente. </li><li> Para ativar a carboxigrupos l com succinato succinimidilo (SS), grupos carboxilo dissolver o HPG-funcionalizado, em 3 ml de DMF anidra. Adicionar N-hidroxissuccinimida (0,0077 g, 0,0664 mmol) e N, N&#39;-diisopropilcarbodiimida (0,0084 g, 0,0664 mmol) à solução de HPG e agitar a mistura durante a noite à temperatura ambiente sob atmosfera de árgon. </li><li> Purifica-se o SS-HPG por precipitação em acetona fria. </li><li> Remover a acetona residual por lavagem com árgon. </li><li> Determinar a pureza das HPG modificado e o grau de funcionalização carboxilo e SS por protões (1H) - A análise por RMN. </li></ol> B. Recolha de Sangue Total e Separação de glóbulos vermelhos (hemácias) <ol><li> Recolha de sangue total (hematócrito de 40%, 3 ml) a partir de dadores humanos saudáveis ​​consentido em um tubo vacutainer citrato. </li><li> Centrifugar o tubo de citrato a 1000 xg, durante 4 min. </li><li> Remover o sobrenadante que contém o plasma e plaquetas, e o intermediário buffy coat que contém as células brancas do sangue e platelets, utilizando uma pipeta Pasteur. </li><li> Transferir RBCs embalados (80% de hematócrito, 1,2 ml) para um tubo de centrífuga de 12 ml Falcon, e adicionar o tampão PBS (8 ml, pH = 8,0) para lavar os glóbulos vermelhos. </li><li> Misturar por inversão RBCs para obter uma distribuição uniforme de células. </li><li> Centrifugar o tubo Falcon de 1.000 xg durante 4 min, e remover o sobrenadante. </li><li> Lavar com PBS RBCs duas vezes mais, repetindo os passos 5 e 6. </li><li> Colocar-embalado RBCs (100 ul) em 1,6 ml de tubo Eppendorf, e adicionar o tampão PBS (300 ul, pH = 8,0) para se obter 20% de hematócrito RBCs. </li></ol> C. HPG Enxertia de hemácias <ol><li> Imediatamente após a precipitação de HPG modificado em acetona em A6 passo, SS-HPG lugar (150 mg) num frasco de vidro (1 dram), e dissolvê-lo em tampão PBS (300 ul, pH = 8,0). </li><li> Adicionar SS-HPG em solução de polímero a 20% de hematócrito RBCs lavados para se obter um volume final de 400 uL e SS-HPG concentração que varia de 0,5 mm a 3 mm. Por exemplo, para preparar RBCs tratados com 0,5 mM de SS-HPG, remover 36 ul de PBS a partir do RBC lavados e colocar 36 ul de SS-HPG solução de polímero. </li><li> Vortex a suspensão suavemente e coloque os tubos Eppendorf num agitador orbital à temperatura ambiente durante 1 hr. </li><li> Centrifuga-se o tubo de Eppendorf a 1000 xg, durante 4 min, e pipetar para fora o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de PBS para lavar os glóbulos vermelhos, centrifugar e remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar 1 ml de solução salina e lavar os glóbulos vermelhos duas vezes como no passo 5. </li><li> Adicionar 300 ul de solução salina a 100 ul de RBCs embalados (80 Hematócrito%) para uma concentração final de 20% de hematócrito. </li></ol> D. Caracterização da HPG Modificado RBCs I. lise mediada por complemento <ol><li> Recolher cerca de 8 ml de sangue completo de dadores humanos saudáveis ​​em BD vacutainer tubo de soro de vidro, e permitir que o sangue coagular à temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Centrifuga-se o tubo a 2.000 xg durante 10 minutos e recolher cerca de 3 ml de soro. </li><li> Um mililitro da serum foi colocado num banho de água a 60 ° C durante 30 minutos para se preparar soro inactivado pelo calor. </li><li> Adicionar 60 ul de soro fresco ou de soro inactivado pelo calor para um tubo Eppendorf que contêm 60 ul de 20% de hematócrito HPG RBCs modificados ou não modificados RBCs. </li><li> Incubar RBCs de 1 hora a 37 ° C. </li><li> Para quantificar a quantidade de hemoglobina na suspensão de células, lugar 5,9 ul de hematócrito de 20% de HPG RBCs modificados ou não modificados, em triplicado, as células em placa de 96 poços. Adicionar 294 ul de reagente de Drabkin (um reagente que é usado para quantificar a quantidade de hemoglobina spectrophotomerically). Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando SPECTRA MAX leitor de placas 190. </li><li> Para quantificar a quantidade de hemoglobina no sobrenadante, centrifugar as células a 13.000 xg durante 1 min. Colocar 50 ul de sobrenadante, em triplicado, numa placa de 96 poços. Adicionar 250 ul de reagente de Drabkin do. Células misture com reagente de Drabkinpipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da cyanoderivative hemoglobina a 540 nm utilizando SPECTRA MAX leitor de placas 190. </li><li> Quantificar a quantidade de células lisadas a partir da razão de hemoglobina no sobrenadante (etapa 7) e a hemoglobina total na amostra (passo 6) 8, 11, 12. </li></ol> II. A camuflagem de antígenos maiores e menores usando MTS cartões <ol><li> Ul local 50 de HPG modificado RBC (10% hematócrito) num tubo de Eppendorf, centrifugar a 1000 g durante 1 min, e remover o sobrenadante. </li><li> Adicionar 110 ul de diluente MTS para o pellet celular e homogeneizar a suspensão de células por pipetagem dentro e para fora. </li><li> Adicionar 11 ul de suspensão de célula para cada coluna de gel de mini. Evitar tocar o gel durante a adição. </li><li> Localizar cartas MTS em um suporte de cartão, centrifugue e centrifugar a 156 xg durante 6 min. </li><li> Protecção dos antigénios de superfície é determinada a partir da localização de RBC na mini-coluna de gel, com base na produçãor descrição. </li></ol> III. Aquosas duas medições de fase de partição <ol><li> Prepare Dextran 500 kDa / PEG 8 kDa dois sistemas de separação de fases composto por (de 5% de dextrano 500k, 4% de PEG 8K, 150 mM NaCl, 10 mM de fosfato), de acordo com 13. </li><li> Centrifugar a 433 xg durante 10 min à temperatura ambiente para se obter um sistema de duas fases (o dextrano na parte inferior). </li><li> Separar as duas fases cuidadosamente. </li><li> Ml 1,0 alíquota da fase PEG superior para um tubo rotulado (com fundo côncavo), adicionar 20 ul de 20% hematócrito HPG modificado RBC, e as células misture suavemente por um movimento súbito. </li><li> Adicionar 0,5 ml da fase superior que contém células a 0,5 ml de uma fase inferior, e misturar o sistema suavemente passando rapidamente. </li><li> Colocar o tubo no banco de ~ 2 minutos para que o sistema de separar, e determinar a localização das células no sistema. Localização de RBCs (na fase de PEG superior, na fase de dextrano inferior ou em ambos) é função do grau de modificação e molecularpeso do HPG. </li></ol> IV. Osmóticos medições fragilidade <ol><li> Preparar soluções de NaCl com concentrações que variam de 0 a 0,9 (w / v)%. </li><li> Colocar 0,4 ml de soluções de NaCl em tubos de 1,5 ml de Eppendorf. </li><li> Adicionar 20 pi de glóbulos vermelhos (hematócrito de 20%) para as soluções de NaCl. </li><li> Mistura-se cuidadosamente as células por inversão e coloque-os num banho de água a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Suspender as células cuidadosamente por inversão. Tomar 50 ul de suspensão de RBC e adicioná-lo para um 1 ml de reagente de Drabkin, colocada numa cuvete. Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Meça a absorbância da hemoglobina cyanoderivative a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS leitor. </li><li> Para quantificar a quantidade de hemoglobina no sobrenadante, centrifugar as células a 1.000 xg durante 1 min. Adicionar 200 ul de sobrenadante de 1 ml de reagente de Drabkin, numa cuvete. Misture células com reagente Drabkin de pipetando dentro e para fora. Medir a absorvância da hemoglObin cyanoderivative a 540 nm usando BECKMAN COULTER DU 730 UV / VIS leitor. </li><li> Calcula-se a quantidade de células lisadas em solução de NaCl diferente da proporção da quantidade de hemoglobina no sobrenadante (passo 6) para a quantidade total de hemoglobina em suspensão de células (passo 5). </li></ol> Fluxo V. medições citometria - Proteção de Rhesus-D (Rh) antígeno <ol><li> Adicionar 5 uL de controlo ou de HPG RBCs modificados (hematócrito de 20%), em triplicado, para tampão de PBS suplementado com BSA a 0,5% para um volume total de 25 ul. </li><li> Adicionar 25 uL de FITC monoclonal anti-Rhesus D (Rh) comprado de Biodiagnostics Quociente (PA, EUA). </li><li> Incubar a mistura durante 30 min a 37 ° C num banho de água. </li><li> Lava-se a mistura com 1,5 ml de tampão PBS duas vezes. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para remover o sobrenadante. </li><li> Suspender RBCs em 1 ml de solução salina, e transferir a suspensão para 4 ml de fluxo BD tubo de citometria de fluxo. </li><li> Analisar usando FACSCanto II flow citómetro, a aquisição de 5.000 eventos no portão de controle RBC, e usar os eventos inteiros para análise. </li></ol> VI. Fluxo de medições de citometria - expressão de CD47 <ol><li> Adicionar 1,54 uL de controlo ou de HPG RBCs modificados (hematócrito de 20%), em triplicado, para tampão de PBS suplementado com BSA a 0,5% para um volume total de 44 ul. </li><li> Adicionar 6 ul de ficoeritrina (PE) anti-rato marcado humanos CD47 adquiridas da BD Biosciences (NJ, EUA). </li><li> Incubar a mistura durante 30 min a 37 ° C num banho de água. </li><li> Lava-se a mistura com 1,5 ml de tampão PBS por duas vezes. Centrifugar a 1.000 xg durante 1 min para remover o sobrenadante. </li><li> Suspender RBCs em 1 ml de solução salina, e passar através de 26 G 5/8 de agulha para minimizar a aglutinação de células. </li><li> Transferir a suspensão em 4 de fluxo BD ml tubo de citometria de fluxo. </li><li> Analisar usando FACSCanto citômetro de fluxo II, adquirindo 10.000 eventos no portão de controle RBC. </li></ol>

<ol><li>Bradley, A. J., Murad, K. L., Regan, K. L., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+consequences+of+linker+chemistry+and+polymer+size+on+stealth+erythrocytes%3A+size+does+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Biophysical consequences of linker chemistry and polymer size on stealth erythrocytes: size does matter.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1561 (2), 147-158 (2002).</li>
<li>Murad, K. T., Mahany, K. L., Brugnara, C., Kuypers, F. A., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+consequences+of+antigenic+modulation+of+red+blood+cells+with+methoxypoly%28ethylene+glycol%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Structural and functional consequences of antigenic modulation of red blood cells with methoxypoly(ethylene glycol.</a> Blood. 93 (6), 2121-2127 (1999).</li>
<li>Scott, M. D., Murad, K. L., Koumpouras, F., Talbot, M., Eaton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+camouflage+of+antigenic+determinants%3A+Stealth+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Chemical camouflage of antigenic determinants: Stealth erythrocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94 (14), 7566-7571 (1997).</li>
<li>Daniels, G., Reid, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+groups%3A+the+past+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Blood groups: the past 50 years.</a> Transfusion. 50 (2), 281-289 (2010).</li>
<li>Murad, K. L., Gosselin, E. J., Eaton, J. W., Scott, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stealth+cells%3A+Prevention+of+major+histocompatibility+complex+class+II-mediated+T-cell+activation+by+cell+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Stealth cells: Prevention of major histocompatibility complex class II-mediated T-cell activation by cell surface modification.</a> Blood. 94 (6), 2135-2141 (1999).</li>
<li>Kainthan, R. K., Hester, S. R., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biological+evaluation+of+high+molecular+weight+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro biological evaluation of high molecular weight hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 28 (31), 4581-4590 (2007).</li>
<li>Kainthan, R. K., Janzen, J., Levin, E., Devine, D. V., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatibility+testing+of+branched+and+linear+polyglycidol%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biocompatibility testing of branched and linear polyglycidol.</a> Biomacromolecules. 7 (3), 703-709 (2006).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+circulation%2C+clearance%2C+and+biodistribution+of+polyglycerol+grafted+functional+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vivo circulation, clearance, and biodistribution of polyglycerol grafted functional red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (10), 3047-3057 (2012).</li>
<li>Chapanian, R., Constantinescu, I., Rossi, N. A. A., Medvedev, N., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+polymer+architecture+on+antigens+Camouflage%2C+CD47+protection+and+complement+mediated+lysis+of+surface+grafted+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Influence of polymer architecture on antigens Camouflage, CD47 protection and complement mediated lysis of surface grafted red blood cells.</a> Biomaterials. 33 (31), 7871-7883 (2012).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+cell+surface+polymer+grafting+in+concentrated+and+nonreactive+aqueous+polymer+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Enhanced cell surface polymer grafting in concentrated and nonreactive aqueous polymer solutions.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (10), 3423-3430 (2010).</li>
<li>Rossi, N. A. A., Constantinescu, I., Kainthan, R. K., Brooks, D. E., Scott, M. D., Kizhakkedathu, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+membrane+grafting+of+multi-functional+hyperbranched+polyglycerols%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Red blood cell membrane grafting of multi-functional hyperbranched polyglycerols.</a> Biomaterials. 31 (14), 4167-4178 (2010).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Smirnov, M. D., Domogatsky, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolytic+complement+activity+assay+in+microtitration+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+App.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Hemolytic complement activity assay in microtitration plates.</a> J. App. Biochem. 7 (3), 223-227 (1985).</li>
<li>Walter, H., Brooks, D. E., Fisher, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalter%2C+H+%22Partitioning+in+aqueous+two-phase+systems%3A+theory%2C+methods%2C+uses%2C+and+applications+to+biotechnology%22">Partitioning in aqueous two-phase systems: theory, methods, uses, and applications to biotechnology</a>. , Academic Press Inc. London. (1985).</li>
<li>Rossi, L., Serafini, S., Pierige, F., Antonelli, A., Cerasi, A., Franternale, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocyte-based+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Erythrocyte-based drug delivery.</a> Expert Opin. Drug Deliv. 2 (2), 311-322 (2005).</li>
<li>Walter, H., Krob, E. J., Brooks, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+properties+other+than+charge+involved+in+cell+separation+by+partition+in+polymer%2C+aqueous+2-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane surface properties other than charge involved in cell separation by partition in polymer, aqueous 2-phase systems.</a> Biochemistry. 15 (14), 2959-2964 (1976).</li>
<li>Muzykantov, V. R., Murciano, J. C., Taylor, R. P., Atochina, E. N., Herraez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+complement-mediated+elimination+of+red+blood+cells+modified+with+biotin+and+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of the complement-mediated elimination of red blood cells modified with biotin and streptavidin.</a> Anal Biochem. 241 (1), 109-119 (1996).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Hemácias de doadores universais têm um grande potencial na disponibilidade de sangue e segurança para melhorar a terapia de transfusão de sangue. RBCs também são considerados veículos de entrega de drogas promissoras, devido à sua circulação longa e biocompatibilidade inerente 14, 15. Experiências apresentadas neste trabalho avaliar in vitro as características de HPG RBCs modificados. A propriedades in vitro e in vivo em circulação de RBCs HPG modificados têm sido ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Glycidol </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Trimethylolpropane </td><td> Fluka </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Metilato de potássio </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Piridina anidra </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> 4-dimetilaminopiridina </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Anidrido succínico </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Acetona </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> Dimetilformamida anidra </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> N-hidroxi-succinimida </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> N, N&#39;-diisopropilcarbodiimida </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> MTS cartões </td><td></td><td></td><td> Micro Typing System (MTS) cartões (FL, EUA) </td></tr><tr><td> Dextran 500 kDa </td><td> Pharmacia Fine Chemicals </td><td></td><td> (Suécia) </td></tr><tr><td> PEG 8 kDa </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td> FITC monoclonal anti-Rhesus D (RhD) </td><td> Biodiagnostics quociente </td><td></td><td> (PA, EUA) </td></tr><tr><td> PE monoclonal anti-CD47 </td><td> BD Biosciences </td><td></td><td> (NJ, EUA) </td></tr><tr><td> Reagente de Drabkin </td><td> Sigma Aldrich </td><td></td><td> (ON, Canada) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabela. Os produtos químicos e reagentes utilizados para a enxertia de polímeros de HPG RBC membrana e a sua análise. </td></tr></tbody></table>

antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos poligliceróis hiper

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Transfusão de células vermelhas do sangue (RBC) é vital para o tratamento de um certo número de agudos e crónicos problemas médicos, tais como a talassemia major e anemia falciforme 1-3. Devido à presença de grande número de antigénios na superfície de RBC (~ 308 antigénios conhecidos 4), os pacientes no tratamento crónico de transfusão de sangue desenvolvem aloanticorpos devido à falta de correspondência antigénios menores sobre os glóbulos vermelhos transfundidos 4, 5. A enxertia de polímeros hidrofílicos tais como polietileno glicol (PEG) e hiper-ramificado de poliglicerol (HPG) forma uma camada de exclusão da membrana de RBC que impede a interacção dos anticorpos com antigénios de superfície, sem afectar a passagem de moléculas pequenas, tais como o oxigénio, a glucose, e os iões de 3. Actualmente, nenhum método disponível para a geração de células de dador universal vermelhas do sangue, em parte, por causa da grande desafio apresentado pela presença de um grande número de antigénios (proteínas e hidratos de carbono com base) sobre a superfície e o RBC desenvolvimento de tais métodos irá melhorar significativamente a segurança das transfusões, e melhorar drasticamente a disponibilidade eo uso de hemácias. Neste relatório, as experiências que são usados ​​para desenvolver antigénios protegidas RBCs funcionais pela membrana de enxerto de HPG e sua caracterização são apresentados. HPGs são altamente biocompatíveis polímeros compactas 6, 7, e espera-se estar situado no glicocálice celular que rodeia a membrana lipídica 8, 9 e os antigénios de superfície da máscara 10, 11 de RBC.

Camuflagem de antígeno Rhesus D e proteína de superfície CD47 RBC foram quantificadas por citometria de fluxo utilizando anticorpos marcados fluorescentes monoclonais, e um resultado representativo é apresentado na Figura 1. Em caso de HPG-enxertadas RBCs (cinzento), a intensidade do sinal de diminuição (pico deslocado para a esquerda) em comparação com o controle de RBCs (vermelho e verde), indicando uma diminuição na ligação de anticorpos à superfície celular, que indicam o mascaramento de proteínas d...

A modificação da membrana celular das células vermelhas do sangue (RBC) com poliglicerol hiper-ramificado (HPG) é apresentada. Hemácias modificadas foram caracterizadas por partição de fase aquosa dois, fragilidade osmótica e lise mediada pelo complemento. A camuflagem de proteínas de superfície e antígenos foi avaliada usando a citometria de fluxo e Sistema de Digitação Micro (MTS) cartões de fenotipagem de sangue.

Antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos Poligliceróis hiper

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

O objetivo deste procedimento é preparar glóbulos vermelhos funcionais protegidos por antígenos. Isso é feito preparando primeiro o polímero HPG na segunda etapa. O HPG é funcionalizado através da adição de grupos succinil succinato.Em seguida, o sangue total de doadores saudáveis é lavado com solução salina para separar os glóbulos vermelhos. Na etapa final, os glóbulos vermelhos isolados são tratados com o HPG funcionalizado. Em última análise, a proteção dos antígenos de superfície nas células modificadas pelo HPG funcionalizado é testada por citometria de fluxo.A principal vantagem de nossa técnica em comparação com os métodos existentes é que as conjugações de HPG produzem glóbulos vermelhos funcionais que circulam normalmente. A implicação dessa técnica se estende à transfusão de sangue crônica. Como os glóbulos vermelhos modificados por HPG reduziram a antigenicidade e a circulação normal in vivo.Demonstrando o procedimento estará o Dr. Ian, um pós-médico, colega e escola constante, um técnico em meu laboratório Três dias antes de coletar sangue total de doadores saudáveis consentidos, HPG liofilizado seco em um frasco de fundo redondo durante a noite e um vácuo a 90 graus Celsius. Na manhã seguinte, retire o frasco do banho de óleo e deixe-o atingir a temperatura ambiente e, em seguida, dissolva o HPG seco em dois mililitros de piridina anidra. Em seguida, adicione uma quantidade catalítica de dimetil amino paridina à solução de HPG para funcionalizar aproximadamente oito dos grupos hidroxila no HPG com grupos carboxila.Nos próximos 10 minutos, adicione hidreto de Sica dissolvido em 0,5 mililitros, perina gota a gota à solução e, em seguida, mexa a mistura durante a noite em temperatura ambiente sob Argonne no dia seguinte precipite a mistura de HPG em 40 mililitros de quatro graus Celsius. Acetona em um tubo de 50 mililitros para centrífuga por 15 minutos a 27.000 vezes G a quatro graus Celsius. Em seguida, decantar o supinado e lavar o precipitado com argona à temperatura ambiente para remover qualquer acetona residual.Ativar os grupos carboxila com grupos succinato saxão e mial. Os grupos dissolvem o HPG funcionalizado com carboxila em dois mililitros de DMF anidro. Em seguida, adicione NHS e perfil Diop CARBIMIDA à solução de HPG e mexa a mistura durante a noite à temperatura ambiente sob Argonne.Na manhã seguinte, prossiga com a purificação do S-S-H-P-G por precipitação em acetona fria. Em seguida, lave com argônio para remover qualquer acetona residual. Em seguida, determine a pureza do HPG modificado e o grau de funcionalização do carboxila e do succinato de succinil por análise de RMN de prótons.Após obter o consentimento informado, colete o sangue do doador saudável enquanto a pureza do S-S-H-P-G está sendo avaliada. Centrifugue o sangue total do doador por quatro minutos a 1000 vezes G e temperatura ambiente. Use uma pipeta de paster para remover o supinato e o revestimento leucocitário e, em seguida, transfira os glóbulos vermelhos concentrados para um tubo de centrífuga cônico de 15 mililitros.Adicione PBS às células e depois misture por inversão para obter uma distribuição celular uniforme. Em seguida, centrifugue as células em PB S3 vezes, removendo o SUP natant. Após cada lavagem, transfira o pellet RBC para um tubo de 1,6 mililitro e adicione 300 microlitros de PBS para aumentar o volume para 400 microlitros imediatamente após confirmar a pureza do HPG modificado, transfira 150 miligramas do SSHP para um frasco de Dr.Glass.Depois de pesar o polímero, adicione 300 microlitros de PBS ao S-S-H-P-G e vortex para dissolver o polímero. Em seguida, adicione a solução de polímero S-S-H-P-G aos glóbulos vermelhos lavados a 20% hemid. Em seguida, subtraia suavemente a suspensão e coloque a mistura de HPG de glóbulos vermelhos em um agitador orbital à temperatura ambiente.Após uma hora, lave a solução quatro vezes com PBS e solução salina, removendo o supinato a cada vez. Em seguida, adicione 300 microlitros de solução salina ao palt final de 100 microlitros de concentrado de glóbulos vermelhos até uma concentração final de 20% de hematócrito. Agora deixe oito mililitros de células sanguíneas totais do doador coagularem por 30 minutos em temperatura ambiente.Então, depois de girar as células, colete cerca de três mililitros do soro e transfira um mililitro do soro para um banho-maria a 60 graus Celsius. Para preparar o soro inativado por calor. Após 30 minutos, adicione 60 microlitros de soro fresco e 60 microlitros de soro inativado pelo calor em tubos eph separados.Cada um contendo 60 microlitros de glóbulos vermelhos modificados com HPG a 20% de hematócrito. Em seguida, adicione 60 microlitros do mesmo em tubos contendo o mesmo volume de glóbulos vermelhos não modificados e incube todas as amostras de sangue vermelho por uma hora a 37 graus Celsius. Para quantificar a quantidade de hemoglobina nas suspensões celulares, coloque primeiro 5,9 microlitros de cada uma das amostras em triplicado em uma placa de 96 poços.Em seguida, misture cada amostra com 294 microlitros de reagente drab kins e leia a absorbância do derivado da hemoglobina sano com um espectrofotômetro a 540 nanômetros para quantificar a quantidade de hemoglobina na centrífuga supinada, o resto das amostras de células e, em seguida, coloque 50 microlitros de cada um dos supinatos em triplicado em uma placa de 96 poços. Depois de misturar as células com 250 microlitros de reagente drab kins, medir a absorbância do derivado da hemoglobina ano, como acabamos de demonstrar para esta etapa. Comece centrifugando 50 microlitros de hemácias modificadas com HPG com 10% de hematócrito em um tubo de orph eend.Depois de descartar o sobrenadante S a 110 microlitros de diluente MTS para o pellet celular e pipetar a solução para cima e para baixo algumas vezes para homogeneizar a suspensão celular. Agora carregue 11 microlitros da suspensão celular em cada coluna de um mini gel. Em seguida, coloque os cartões MTS em um porta-cartões centrífugo e gire os cartões por seis minutos a 156 vezes G. A proteção dos antígenos de superfície pode então ser determinada a partir da localização dos glóbulos vermelhos nas mini colunas de gel de acordo com a descrição do fabricante.Para esta etapa, após configurar um sistema de separação bifásica PEG dextrano, gire a solução PEG dextrana para obter o sistema bifásico. Em seguida, aliquota cuidadosamente um mililitro da fase PEG superior em um tubo rotulado com fundo côncavo. Adicione 20 microlitros de 20 a 30% de hemácias modificadas com HPG ao tubo, misturando a suspensão celular com movimentos suaves.Em seguida, adicione 0,5 mililitros da célula que contém a fase superior a 0,5 mililitros da face inferior do dextrano e, em seguida, misture o sistema novamente com movimentos mais suaves. Agora descanse o tubo na bancada para permitir que o sistema se separe após dois minutos. Os glóbulos vermelhos devem localizar-se na fase PEG superior, na fase dextra inferior ou em ambos os glóbulos vermelhos.Derivatizados com altos níveis de HPG estão localizados na fase superior de PEG para avaliar a proteção dos antígenos de superfície dos glóbulos vermelhos por análise por citometria de fluxo. Primeiro, adicione 20 microlitros de solução salina a três tubos de fatos para cada amostra. Em seguida, adicione cinco microlitros de glóbulos vermelhos de controle não modificados e HPG modificados em triplicata aos tubos.Em seguida, adicione 25 microlitros de fit C monoclonal anti reus D a cada tubo e incube as amostras a 37 graus Celsius em banho-maria. Após 30 minutos, lave as amostras em solução salina de 1,5 mililitro, duas vezes removendo o supinato de cada vez após a segunda lavagem, Reese dobre os glóbulos vermelhos em um mililitro de solução salina. Finalmente, adquira pelo menos 5.000 eventos na porta de controle de glóbulos vermelhos para analisar a proteção dos antígenos de superfície.Neste histograma, a expressão normal do Resus e-Antigen representado pelo pico verde em glóbulos vermelhos não modificados de doadores humanos saudáveis é mostrada quando os glóbulos vermelhos são enxertados em HPG, a intensidade do sinal do e-Antigen de Reese diminui conforme evidenciado pela mudança na expressão para a esquerda denotada pelo pico cinza. A modificação dos glóbulos vermelhos pelo HPG também camufla a expressão do CD 47, como demonstrado pelo deslocamento à esquerda do pico cinza observado também neste histograma, indicando que o mascaramento das proteínas de superfície ocorre na presença de HPG. Após este procedimento, modificador HPG, as células sanguíneas podem ter aplicação em transfusão de sangue e administração terapêutica mediada por células.Depois de assistir a este vídeo, você terá uma melhor compreensão de como os polímeros podem ser conjugados aos glóbulos vermelhos para modificar a antigenicidade e construir a base para a administração de medicamentos.

antigens-protected-functional-red-blood-cells-membrane-grafting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este artigo descreve uma técnica simples para induzir aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico. A técnica pode ser aplicada clinicamente para gerar células não-alorreativas doador. Infusão dessas células poderia melhorar a reconstituição imunológica e reduzir a toxicidade após o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas.

Indução de aloantígenos específicos de anergia em células mononucleares do sangue periférico por Estimulação com aloantígenos Co-estimulatórias bloqueio de sinal

Um método novo CD independente para indução e expansão de células T antígeno-específicos é descrito. HLA A2-Ig baseada Células Antigen Presenting artificial (AAPC) são carregados com HLA-A2 peptídeos restrito a expandir de forma eficiente CTL de especificidade do antígeno diversas. Esta tecnologia tem um grande potencial para CTL baseada imunoterapia adotiva.

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

Função Espaçador Lipid (FSL) constrói permitir as características da superfície de células vivas e virions ser modificado sem perda de vitalidade. O método requer apenas simples contato de uma solução de construção de uma célula com FSL / virion e incorporação de superfície espontânea e estável ocorre.

FSL Constrói: Um método simples para modificar Cell / Virion superfícies com um intervalo de Marcadores Biológicos sem afectar a viabilidade

A exposição do sangue a condutos sanguíneos poliméricos inicia a reação de corpo estranho que tem sido implicada em complicações clínicas. Aqui, o Chandler Loop Apparatus, uma ferramenta experimental que imita a perfusão sanguínea através desses condutos, é descrito. O apêndice do CD47 recombinante resulta em diminuição da evidência da reação de corpo estranho nesses condutos.

O uso do Ex Vivo Chandler Circuito Aparelho para avaliar a biocompatibilidade de Modificados Condutas sangue Poliméricos

Este artigo descreve um método para a geração e propagação de clones de células T humanas que respondem especificamente a um aloantígeno definido. Este protocolo pode ser adaptado para clonagem de células T humanas específicas para uma variedade de ligantes peptídicos-MHC.

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

Os macrófagos são células plasmáticas do sistema hematopoiético que desempenham um papel crucial na imunidade protetora e na homeostase. Neste relatório , descrevemos técnicas otimizadas in vitro para caracterizar fenotípica e funcionalmente macrófagos reguladores infiltrantes de enxerto que se acumulam no órgão transplantado em condições tolerogênicas.

Caracterização funcional de macrófagos regulatórios que inibem a imunidade reativa ao enxerto

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir a tolerância em transplante e avaliar in vitro e em vivo a capacidade supressora de subconjuntos distintos celular do destinatário e o status imune do destinatário para doador ou antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo de avaliação da atividade supressiva, T, B e células mieloides e respostas Humoral de pacientes transplantados

Quantificação de doador-derivado de células é necessária para monitorar a enxertia após transplante de células-tronco em pacientes com hemoglobinopatias. Uma combinação de classificação de celulares baseados em citometria de fluxo, ensaio de formação de colônia e posterior análise do tandem curta repetições podem ser utilizadas para avaliar a proliferação e diferenciação dos progenitores no compartimento eritroide.

Deteção de doador Residual eritroide progenitoras após transplante de células-tronco hematopoéticas para pacientes com hemoglobinopatias

Este protocolo descreve a remoção e purificação de células endoteliais artéria pulmonar (PAECs) que aderem as dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz, enquanto eles estão encravados na artéria pulmonar durante o cateterismo cardíaco direito e permanecer aderente para o balão vazio após a remoção do corpo do paciente.

Colheita de células endoteliais das dicas de balão de cateteres de Swan-Ganz após cateterismo cardíaco direito

A doença enxerto versus hospedeiro é uma grande complicação após o transplante de medula óssea alogênico. As células dendríticas desempenham um papel crítico na patogênese da doença enxerto-versus-hospedeiro. O artigo atual descreve uma nova plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas no desenvolvimento da doença enxerto versus hospedeiro e o efeito enxerto-versus-leucemia.

Plataforma de transplante de medula óssea para investigar o papel das células dendríticas na doença enxerto-versus-hospedeiro

Descrevemos um modelo de transplante de coração abdominal heterotópico em ratos, implicando modificações nas estratégias atuais, que levam a uma abordagem cirúrgica simplificada. Além disso, descrevemos um novo modelo de rejeição pela injeção in-ear de células musculares cardíacas vitais, permitindo novas análises imunológicas de transplante em ratos.

Um modelo imunológico para transplante heterotópico de células cardíacas e cardíacas em ratos

Aprenda a modificar glóbulos vermelhos funcionais com poliglicerol hiperramificado para proteger antígenos de superfície. Este método utiliza citometria de fluxo e pode melhorar a preservação de produtos sanguíneos para transfusões.

Antígenos funcionais protegidos glóbulos vermelhos pela membrana enxerto de compactos Poligliceróis hiper

Explorar mais vídeos